罗丹明类荧光染料及其应用

本发明涉及生物荧光成像，具体而言，涉及一种罗丹明类荧光染料及其应用。

背景技术：

1、随着显微镜技术的不断革新，生物荧光成像技术是目前研究生物问题的重要手段之一。普通的光学显微镜到荧光显微镜再到共聚焦显微镜，人们对成像的时空分辨率、所包含的信息要求越来越高。超分辨成像技术在2014年获得了诺贝尔化学奖之后，在纳米级别的超高分辨率下，很多未知的结构及其相互联系也随之被揭示，成像领域正式迎来了超分辨的时代。超分辨荧光成像的发展依赖与显微镜的硬件和荧光染料协同优化。例如：随机光学重建显微镜(stochastic optical resolution microscopy,storm)需要荧光染料能够在一定时间内高效多次发成光转化的性质；受激发射损耗荧光显微镜(stimulatedemission depletion microscopy，sted)需要一束超强的损光来实现分辨率的降低，这无疑对染料的光稳定性有了更高的要求。

2、在此之前受限于仪器和染料的发展，很多成像的数据都来自于固定的生物样品。对于超分辨成像的未来一定是活细胞、组织水平上的长时程、大视野成像。无论是对于storm还是sted来说，反复激发染料分子或者使用超强的损耗光，不仅仅对染料本身造成损伤，对活的生物样本来说更是致命的打击。在成像过程中，产生的活细胞、组织等样品的损伤，称为光毒性。例如：在长时间观察线粒体的动态活动中，线粒体常常会随着观察时间的延长，出现肿胀变圆，继而破裂引发细胞凋亡。

3、光毒性是一种普遍现象，主要来源于发色团三线态激发态高活性物种与环境中基态的三线态氧气分子通过碰撞发生了能量的转移，从而产生了单线态氧及其他活性氧物种(reactive oxygen species,ros)。这些活性氧物种会与生物大分子如脂质、蛋白质、dna发生反应破坏其正常的生理结构和功能。光毒性这一问题无疑对荧光染料提出了一个全新维度的要求。除了要求荧光染料具有抗漂白的光稳定性，还要求其具备对样品的低光毒性来匹配活样品的生物相容性。因此降低荧光染料的光毒性的解决思路是降低荧光的三线态激发态的组分。

4、荧光染料的三线态是导致染料光漂白和光毒性的关键因素。因此降低三线态的寿命，尽可能地将处于三线态的染料拉回到基态是唯一的解决的策略，目前主要有以下几种技术：

5、1.体系除氧：在单分子体系中，为了增加染料分子的光稳定性通常会采用除氧的方式，来抑制高活性的三线态激发态染料分子与氧气发生。

6、2.成像体系中添加三线态猝灭剂(triplet state quenchers,tsqs)：三线态猝灭剂在溶剂中通过与染料分子三线态碰撞，使其发生光物理或光化学的猝灭，荧光团以一种分子间的形式受到保护。其中，光物理的三线态猝灭剂有环辛四烯(cot)，二苯基己三烯，或镍离子，它们都是通过染料和猝灭剂之间的能量转移来实现光保护作用的。光化学的三线态猝灭剂需要一个同时具有氧化和还原能力的试剂。例如：trolox(tx)，抗坏血酸，二茂铁，对硝基苯甲醇，硝基苯丙氨酸，甲基紫精。染料的三线态是通过光致电子转移(pet)的机理被猝灭，从而形成自由基阴离子或阳离子中间体，再经过连续的氧化还原反应恢复到染料的基态。

7、3.自修复染料：现有的技术是将三线态猝灭剂环辛四烯(cot)共价连接在花菁类染料(主要是cy5、cy3)分子内部，染料的三线态会和三线态猝灭剂发生分子内的猝灭，减少了三线态-三线态的能量传递，实现染料分子自修复的能力，这类染料称为自修复染料。在除氧条件下，cy5-cot偶联物的三线态寿命在0.15μs左右，而cy5的三线态寿命约为110μs，并且cy5-cot在有氧条件下的光稳定较cy5提高了5倍左右。将两个cot分子对称的连接在cy3和cy5的两端，得到的分子分别将光毒性降低了3和5倍。

8、然而，上述除氧体系不适用于活细胞成像，成像体系中添加三线态猝灭剂的方法中，猝灭效率依赖于分子间的碰撞，因此体系中需要较高浓度的三线态猝灭剂。如此高浓度会存在细胞毒性，生物相容性差。自修复染料也存在一定的缺陷，比如：(1)不具备普适性：cot与不同母核的花菁类染料共价连接，其对染料分子的三线态猝灭程度大不相同，有些无明显改善。(2)活细胞染料的局限性：花菁类染料天然带有一个正电荷，会累积在富负电荷的线粒体内膜上，不适合做其他细胞器以及蛋白、dna的成像。

9、因此，仍需要对降低荧光染料的光毒性提供新的解决方案。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种罗丹明类荧光染料及其应用，以提供一种新的降低现有技术中荧光染料的光毒性的方案。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种罗丹明类荧光染料，该罗丹明类荧光染料包括罗丹明类染料分子以及与罗丹明类染料分子共价偶联的三线态猝灭剂环辛四烯。

3、进一步地，罗丹明类染料分子通过底环与环辛四烯共价偶联；优选地，通过底环上的邻位与环辛四烯共价偶联。

4、进一步地，罗丹明类染料分子选自如下任一种：氧罗丹明类、碳罗丹明类或硅罗丹明类；优选地，氧罗丹明类包括如下任意一种或多种：tmr、rho110、map555、jf503、jf525、jf536、jf549、jf522、jf571、500r、510r或515r；优选地，碳罗丹明类包括如下任意一种或多种：6-cpy、5-cpy、crhp、580cp、jf585、jf612、jf608或map618；优选地，硅罗丹明类包括如下任意一种或多种：sir、jf626、jf629、jf630、jf635、jf646、jf669或sirh。

5、进一步地，罗丹明类荧光染料的单线态氧产率为0.0014～0.018。

6、根据本技术的第二个方面，提供了一种荧光检测试剂盒，该试剂盒包括上述任一种罗丹明类荧光染料。

7、根据本技术的第三个方面，提供了一种生物标记分子，该生物标记分子包括生物分子及标记生物分子的荧光染料，其中，生物分子的荧光染料为前述任一种罗丹明类荧光染料。

8、根据本技术的第四个方面，提供了一种生物荧光成像方法，该方法采用前述任一种罗丹明类荧光染料标记细胞。

9、进一步地，细胞为活细胞；优选地，罗丹明类荧光染料标记细胞是标记细胞内的细胞器，其中细胞器包括如下任意一种或多种：线粒体、细胞核、细胞骨架、高尔基、内质网、溶酶体、内含体、核糖体或迁移体；优选地，罗丹明类荧光染料标记细胞是标记细胞内的分子标记物，分子标记物为蛋白分子、糖分子或核酸分子；优选地，生物荧光成像方法还包括将罗丹明类荧光染料标记的细胞置于显微镜下成像观察，显微镜包括如下任意一种或多种：共聚焦显微镜、随机光学重建显微镜或受激发射损耗荧光显微镜。

10、根据本技术的第五个方面，提供了前述的任一种罗丹明类荧光染料，或试剂盒，或者生物荧光成像方法在活细胞成像研究中的应用。

11、进一步地，成像是在如下任意一种或多种显微镜下成像：共聚焦显微镜、随机光学重建显微镜或受激发射损耗荧光显微镜。

12、应用本发明的技术方案，一方面由于罗丹明能够应用于所有活细胞，而拓宽了染料的适用范围；另一方面罗丹明的空间构象使其能够进一步拉近生色团与三线态猝灭剂的距离，从而能够更有效地降低光毒性，因此，本技术的将三线态猝灭剂环辛四烯共价偶联到罗丹明类染料分子上的罗丹明类荧光染料，能够实现在活细胞层面的各种细胞器和蛋白的低光毒性成像。