一株丛毛红曲霉工程菌及其应用

1.本发明属于食品生物技术领域，尤其涉及一株丛毛红曲霉工程菌及其应用。


背景技术：

2.红曲起源于中国，已有上千年历史，是近年来备受关注的功能性食品，经红曲霉发酵后的大米就是红曲米，其中含有多种活性物质，以色素、莫纳可林k（monacolin k, mk）和γ-氨基丁酸为主，有益于人体健康。近年来，研究人员通过发酵条件优化和筛选高产mk的红曲霉突变菌株等方法，提高了红曲霉的mk产量及其应用价值。同时，随着现代生物技术的不断发展，基因工程技术为改良红曲霉菌株提供了有效的手段，即通过基因工程手段促进次生代谢物合成关键基因的表达，从而提高其mk合成能力。
3.1979年，endo首次从红色红曲霉（monascus ruber）的培养物中分离出一种可抑制体内胆固醇合成的活性物质，并命名为monacolin k，该物质与albert等从土曲霉（aspergillus terreus）的培养物中分离获得的洛伐他汀（lovastatin）具有相同的分子结构。
4.mk具有降血脂、抗癌防癌、抗炎抑菌、保护神经等功效。mk降血脂功效的主要作用机理为：mk与人体内胆固醇合成途径的限速酶hmg-coa还原酶（hmgr）的结构相似，能够对hmgr形成高效的竞争性抑制，从而达到降低胆固醇合成的效果。
5.如何提升mk的发酵产量是研究红曲的一大热点，首先选育高产mk突变菌株，优化发酵条件都能够在一定程度上提高mk的合成产量，例如利用紫外诱变筛选出来的红曲菌株合成mk的能力是初始菌株的2到5倍不等（常聪，2018）。另外，优化发酵基质也能起到显著效果，zhang等（2018）采用大米、小米、小麦和大麦等不同种类的谷物进行红色红曲霉（m. ruber）的固态发酵，结果发现小米为基质的mk产量最高（7.25mg/g）。
6.如今，利用分子生物技术研究mk的生物合成途径是研究红曲霉的新方向，红曲霉mk合成基因簇中部分基因的功能已经得到解析，其过表达能够显著提升红曲霉的mk产量，而且还可以实现异源表达。sakai等（2012）以米曲霉(a. oryzae）作为宿主，成功地将mk合成基因簇在米曲霉中进行异源表达。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一株丛毛红曲霉工程菌及其应用。该丛毛红曲霉工程菌不仅高产莫纳可林k（monacolin k，mk），而且不产桔霉素。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一株丛毛红曲霉工程菌ti-02，其分类命名为：丛毛红曲霉（monascus pilosus），该菌株已于2021年1月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmcc no. 21449，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
9.上述一株丛毛红曲霉工程菌的制备方法，具体包括以下步骤：1）将莫纳可林k（mk）合成基因簇上的外排泵基因mok i（其序列如seq id no.1所
示）构建到真核表达载体pneo0380上，获得mok i基因的过表达载体pneo-mki。
10.2）采用农杆菌介导法，将过表达载体pneo-mki转化到丛毛红曲霉模式菌株cicc 5045中，经筛选培育、红曲米发酵和检测分析，得到高产莫纳可林k（mk）且不产桔霉素的丛毛红曲霉工程菌ti-02。
11.上述步骤1）具体为：设计合成mok i基因编码区两端的特异引物mki1-4（5
′‑
cccaagcttatggcttcccaccagtctgaga-3
′
）和mki2-4（5
′‑
cgagctcctagactcgttca tcgcggc-3
′
），采用rt-pcr技术，从丛毛红曲霉模式菌株cicc 5045中克隆出mok i基因的编码区，其序列如seq id no.1所示；将mok i基因的编码区构建到真核表达载体pneo0380上，获得含有mok i基因的过表达载体pneo-mki。
12.上述步骤2）具体为：采用冻融法，将过表达载体pneo-mki转化到农杆菌agl1中，获得含有mok i基因过表达载体的重组农杆菌agl1/pneo-mki；将获得的重组农杆菌与丛毛红曲霉模式菌株cicc 5045进行共培养，经过筛选培育（利用含有80
ꢀµ
g/ml遗传霉素g418的培养基进行筛选培养）、红曲米发酵和检测分析，获得了高产monacolin k且不产桔霉素的丛毛红曲霉工程菌ti-02。
13.上述一株丛毛红曲霉工程菌在莫纳可林k生产中的应用。
14.本发明的显著优点在于：
①
成功获得了过表达mok i基因的丛毛红曲霉转化菌株ti-02。
15.②
丛毛红曲霉转化菌株ti-02固态发酵产物红曲米的mk总产量分别比出发菌株相对提高了87.8%，其中酸式mk的含量分别比出发菌株提高了1.3倍。
16.③
丛毛红曲霉不同转化菌株的固态发酵产物红曲米中均未检出桔霉素，市售红曲米样品的桔霉素含量为10.36 mg/kg。
附图说明
17.图1为mok i基因编码区的pcr扩增结果；m：dna marker dl2000，1：mok i基因编码区的pcr扩增产物。
18.图2为mok i基因过表达载体pneo-mki的示意图。
19.图3为丛毛红曲霉转化子的pcr鉴定结果；m：dna marker dl2000，1-3：阳性转化子，4：阴性对照（出发菌株cicc 5045），5：阳性对照（质粒pneo-mki）。
20.图4为丛毛红曲霉固态发酵产物中mk含量检测的hplc图谱；a：酸式mk标准品的色谱图，b：内酯式mk标准品的色谱图，c：丛毛红曲霉转化菌株待测样品的色谱图，d：出发菌株待测样品的色谱图。
21.图5为丛毛红曲霉固态发酵产物中mk产量的hplc检测结果。
22.图6为丛毛红曲霉固态发酵产物中桔霉素含量检测的hplc图谱；a：桔霉素标准品的色谱图，b：丛毛红曲霉转化菌株待测样品的色谱图，c：市售红曲米待测样品的色谱图。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
24.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如：分子克隆实
验指南（第三版）（sambrook等著，黄培堂译，2002）中所述的条件，或者按照试剂制造厂商所建议的条件。
25.实施例：（1）丛毛红曲霉mok i基因的克隆
①
丛毛红曲霉总rna的提取与检测将丛毛红曲霉（monascus pilosus）模式菌株cicc 5045接种于麦芽汁液体培养基中，培养4-5天后，采用美国invitrogen公司的trizol试剂，按照其说明书的方法，从丛毛红曲霉的菌丝体中提取出总rna。
26.总rna完整性的检测：取5
µ
l丛毛红曲霉总rna，经1wt%琼脂糖凝胶电泳（6v/cm）20min后，呈现出三条清晰可区分的条带，分别为28s、18s和5.8s rna，其中28s rna和18s rna的比例大约为2∶1，说明获得的丛毛红曲霉总rna较为完整，可用于后续的rt-pcr等实验。
27.总rna浓度和od值的检测：取1
µ
l丛毛红曲霉总rna，用超微量紫外分光光度计（nd-2000c）检测其浓度和od
260/280
值，结果显示，丛毛红曲霉总rna的浓度为1592.9 ng/
µ
l，od
260
/od
280
=2.1，说明获得的总rna纯度较高，可用于后续rt-pcr等实验。
28.②
丛毛红曲霉mok i基因编码区的rt-pcr采用宝生物工程（大连）有限公司的primescript
® rt reagent kit（perfect real time），参照其说明书的方法（将37℃的反应时间改为60 min），将丛毛红曲霉总rna反转录合成第一链cdna。
29.根据genbank已报道的丛毛红曲霉mok i基因的核苷酸序列（dq176595.1），设计合成mok i基因编码序列两端的特异引物mki1-4（5
′‑
cccaagcttat ggcttcccaccagtctgaga-3
′
）和mki2-4（5
′‑
cgagctcctagactcgttca tcgcggc-3
′
），分别在引物的5’端添加合适的酶切位点hind
ꢀⅲ
和sacⅰ（引物序列的下划线部分）和保护碱基，用高保真酶primerstar
®
hs dna polymerase进行pcr扩增，pcr反应条件：98℃ 5min；随之以98℃ 10sec，55℃ 5sec，72℃ 1.5min进行35个循环后，以72℃延伸10min，结果得到了约1.6kb的目的条带（图1）。对pcr扩增产物进行电泳和胶回收后，送往铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。
30.测序结果表明，采用rt-pcr技术获得的丛毛红曲霉模式菌株cicc 5045的mok i基因的编码序列如seq id no.1所示；序列分析结果表明，其与genbank报道的mok i基因同源性为100%，编码区长度为1632 bp，编码543个氨基酸，其蛋白质的分子量约为57.3 kda。
31.（2）mok i基因转化丛毛红曲霉
①
mok i基因过表达载体的构建对上述rt-pcr获得的mok i基因的编码区进行酶切后，将酶切产物回收并连接到pneo0380载体上，然后对重组载体进行pcr和酶切鉴定以及测序验证，结果表明成功构建了mok i基因的过表达载体pneo-mki，载体图谱如图2所示。
32.②
含有mok i基因的过表达载体pneo-mki转化丛毛红曲霉采用冻融法，将过表达载体pneo-mki转化到农杆菌agl-1中，经pcr和酶切鉴定，成功获得了含有mok i基因过表达载体pneo-mki的重组农杆菌agl-1/pneo-mki。
33.制备丛毛红曲霉模式菌株cicc 5045的孢子悬浮液，然后将含有mok i基因的重组农杆菌agl-1/pneo-mki与丛毛红曲霉孢子进行共培养，经过筛选培养，得到了一批丛毛红
曲霉抗性转化子。
34.（3）丛毛红曲霉转化菌株的获得及其发酵培养和检测分析
①
丛毛红曲霉抗性转化子的pcr鉴定用软件vector nti 7.0设计一对正反向特异引物pgpda-f1（5
′‑
ctgcactcg acctgctgaggtc-3
′
）和mki2-8（5
′‑
caatttggctcagacccatcat-3
′
），用于丛毛红曲霉抗性转化子的pcr鉴定，其扩增产物的大小为847bp。
35.先将重组农杆菌agl1/pneo-mki与丛毛红曲霉菌株cicc 5045的分生孢子进行共培养后，利用含有80
ꢀµ
g/ml遗传霉素g418的筛选培养基进行筛选培养，得到丛毛红曲霉的一批抗性转化子。然后，将抗性转化子分别接种于麦芽汁液体培养基中，培养3-4天后，采用基因组dna快速提取试剂盒（北京鼎国生物技术有限责任公司），从其菌丝体中提取基因组dna，用引物pgpda-f1和mki2-8进行pcr扩增，结果表明：成功获得了一批过表达mok i基因的丛毛红曲霉转化菌株，命名为ti-01、ti-02、ti-03、ti-04、ti-05、ti-06（图3）。
36.②
丛毛红曲霉转化菌株的发酵培养及其mk产量的hplc检测pda培养基的配制：取200 g新鲜土豆削皮，切块，20 min沸水煮烂成汁，经四层纱布过滤后加入葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，加水溶解后定容至1000 ml，ph自然，121℃下高压灭菌20 min。
37.种子培养基的配制：葡萄糖50 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，kh2po
4 1 g，feso4•
7h2o 0.01 g，mgso4•
7h2o 0.5 g，加水溶解后定容至1000 ml，ph自然，121℃下高压灭菌20 min。
38.固态发酵培养基的配制：称取30 g大米，置于250 ml塑料发酵瓶中，加入6 g甘油与20 ml水，封口后于121℃下杀菌20 min。
39.不同菌株的发酵培养：丛毛红曲霉的转化菌株和出发菌株cicc 5045，分别接种在pda平板上活化培养7天后，用无菌水冲取孢子，经三层擦镜纸过滤后，调整孢子的浓度至1
×
106个/ml。按1wt%接种量接种于种子培养基中，28℃，220 rpm培养48h后备用。将种子液稀释至孢子浓度约为1
×
107个/ml后，按照10wt%接种量接种至固态发酵培养基中，每个菌株分别做4个重复，28℃培养15天。
40.待测样品的前处理：将发酵完成的红曲米样品置于50℃的鼓风干燥箱中烘干至恒重，研磨粉碎后过80目筛子，称取1.0 g样品置于10 ml棕色容量瓶中，用75vol%乙醇定容至10 ml，超声处理30 min，期间摇匀一次，待超声完成后再摇匀一次，并静置5 min，随后取上清液经0.45 μm滤膜过滤后，用于hplc进样检测。
41.酸式mk标准溶液的配制：称取1.5 mg mk标准样品，置于10 ml棕色容量瓶中，加入2 ml的0.2 mol/l naoh溶液，再用75vol%乙醇溶解后定容至10 ml，50℃水浴30 min，期间振摇2次，使内酯式mk转化为酸式mk，配制成150 μg/ml的标准液，置于4℃冰箱中保存备用。
42.内酯式mk标准溶液的配制：称取1.5 mg mk标准样品，置于10 ml棕色容量瓶中，用75vol%乙醇溶解后定容至10 ml，配制成150 μg/ml标准液，置于4℃冰箱中保存备用。
43.采用美国waters公司的e2695高效液相色谱仪检测上述红曲米样品中的mk含量，色谱条件如下：色谱柱为waters sunfire c18（5 μm，4.6
×
120 mm），流动相为乙腈∶0.18%磷酸水溶液=55∶45（v/v）；流速为1 ml/min；检测器的波长为238 nm；柱温为30℃；进样量为20 μl。检测结果如图4和图5所示，不同转化菌株（ti-01~ti-06）固态发酵红曲米中的mk总产量分别为254.78、267.30、198.22、247.40、241.87、234.20 mg/kg，分别比出发菌株相对
提高了79.0%、87.8%、39.3%、73.8%、69.9%、64.5%；其中酸式mk的含量分别为60.89、82.80、57.91、73.04、82.22、76.36 mg/kg，分别比出发菌株提高了0.7倍、1.3倍、0.6倍、1.1倍、1.3倍、1.1倍。
44.③
丛毛红曲霉转化菌株发酵产物中桔霉素含量的hplc检测待测样品的前处理：将经过研磨并过80目筛子的红曲米粉末，称取1.0 g置于棕色容量瓶中，用甲醇定容至10 ml，超声处理30 min，60℃水浴浸提60 min，5000 g离心20 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后，用于hplc进样检测，并以市售红曲米作为对照。
45.桔霉素标准溶液的配制：精确称取桔霉素标准品1 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容至10 ml，质量浓度为100 μg/ml，置于4℃冰箱中保存备用。
46.采用美国agilent公司的1200infinity series高效液相色谱仪检测上述红曲米样品的桔霉素含量，色谱条件如下：色谱柱为waters sunfire c18（5 μm，4.6 mm
×
250 mm）；流动相为超纯水（用磷酸调ph至 2.5）∶乙腈=50∶50（v/v）；流速为1 ml/min；荧光检测器的波长为λex=331 nm，λem=500 nm；柱温为28℃；进样量为20 μl。检测结果如图6所示，丛毛红曲霉不同转化菌株（ti-01~ti-06）的固态发酵产物红曲米中均未检出桔霉素，而市售红曲米样品的桔霉素含量为10.36 mg/kg。