一种生物标志物组合、含其的试剂及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术和诊断领域，具体涉及一种生物标志物组合、含其的试剂及其应用，所述应用具体涉及制备肠癌患者接受常规化疗联合靶向治疗的预后产品等。


背景技术：

2.肠癌(colon cancer，crc)是世界上第三大常见癌症，其发病率和病死率在各种恶性肿瘤中分别居第三和第二位，严重威胁人类健康。外科手术是早期病例的主要治疗手段，但早期肠癌无明显临床症状，出现症状就诊时往往已是晚期，失去根治性手术的机会，只能靠新辅助药物治疗提高生活质量甚至维持生存。大肠癌的新辅助药物主要包括奥沙利铂(oxaliplatin，oxaliplatin，)，亚叶酸钙(leucovorin calcium，)，氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-)，西妥昔单抗(cetuximab，)，贝伐珠单抗(bevacizumab，)。靶向药物西妥昔单抗常用于k-ras，n-ras，braf野生型患者，通过对与表皮生长因子(egf)受体结合，阻断细胞内信号转导途径，从而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞的凋亡。靶向药物贝伐珠单抗能与血管内皮生长因子(vegf)结合抑制肿瘤血管内皮的增殖和新生血管的形成，减少肿瘤组织营养，从而抑制肿瘤生长。在临床上，肿瘤的治疗效果存在较大的个体差异，但是药物个性化的选择依据过少，临床急需指导个体化精准医疗的标志物，从而缓解药物耐受问题。
3.因此，为了实现肠癌的个体化治疗，有必要根据分子遗传学和病理学特征来识别亚类，发现并应用相应的靶基因。此外，在肠癌研究中，已经报道了可以根据肠癌的亚型对肠癌的预后进行分类的结果。目前已涌现的多项研究性专利均是基于基因组和转录组的基因表达水平实现对肠癌的诊断与预后预测，如结肠直肠癌的预后预测(专利号cn101389957b)，大肠癌相关的mirna作为生物标志物的应用及大肠癌检测试剂盒(专利号cn107326092a)。然而在临床中，针对肠癌患者的一线治疗方案，常规化疗联合靶向治疗仍未提供有效的治疗方案决择依据。
4.蛋白质组学在揭示肿瘤发生的复杂分子事件，如肿瘤发生、侵袭、转移和对治疗耐受上起了重大作用。蛋白质组学肿瘤诊断具有灵敏度高、特异性强、背景机理明确的优点，近年来被越来越多地运用于肿瘤检测。而且，这些肿瘤标志物的研究往往是基于一定量的实验数据，所涉及的癌症种类和样本量都相对有限。因此，通过收集蛋白质组数据，利用大数据分析方法，建立预测治疗有效的模型，有助于实现个性化化疗，对患者推荐合适的治疗方案具有重要的临床意义。


技术实现要素：

5.为解决以上技术问题，本发明提供一种生物标志物组合、含其的试剂及其应用，以及肠癌常规化疗联合靶向治疗的预测系统。具体地，本发明通过如下技术方案解决上述技术问题。
6.本发明的技术方案之一为：一种生物标志物组合，其包括以下生物标志物：
7.aar2、acyp1、akt2、amy2b、apoc2、arl6ip1、armcx1、asna1、baiap2l1、c10orf54、c19orf66、c4bpa、c9、ccdc137、ccdc43、ccdc47、cd55、cdk12、cdk4、cdx1、cfl2、clec11a、cnep1r1、cpb2、cpped1、cst1、ctr9、cyp51a1、d2hgdh、dcakd、dhf、dhodh、dnm2、dolpp1、ebna1bp2、egfr、entpd4、eps8、evpl、f10、fdx1、fermt1、fga、fry、gnai1、hist1h1e、hla-dpa1、hla-drb4、hook1、inpp5f、itih4、jund、kif20a、lbp、mad1l1、maged1、magi3、magt1、map3k3、mastl、mepce、mpp5、mpp7、mrpl3、mrps2、mrps28、msi2、mst1r、mta3、mtfr1、nae1、nckap1l、nol3、oaf、pes1、plekhg3、plvap、poglut1、polr2l、polrmt、ppp1ca、ppp1r13l、prim1、prtfdc1、psip1、ptgr2、qpct、rab4a、rbbp5、rdh10、relb、rnf123、rnf220、rock1、rpl18a、saa2、sdr16c5、serpina5、sh3bgrl2、slc25a26、slc35b1、slc37a3、smc2、sp3、srgn、ston2、sufu、supt20h、taok3、tbcb、tcea3、thumpd3、tlr8、tmem55b、tmem63b、tmem68、tor3a、tp53rk、trmt10c、txn2、ubr4、uhrf1、usp11、vnn2、vps33a、vwa8、wdhd1、wdr18、wdr70、wnk2、xxylt1和znf830。
8.本发明的技术方案之二为：用于检测如技术方案之一所述的生物标志物组合的表达水平的试剂，所述试剂包含与如技术方案之一所述的生物标志物组合特异性杂交的生物分子；
9.较佳地，所述生物分子包括选自引物、探针和抗体中的一种或多种。
10.本发明的技术方案之三为：如技术方案之一所述的生物标志物组合，或者如技术方案之二所述的试剂在制备肠癌患者接受常规化疗联合靶向治疗的预后的产品中的应用。
11.本发明的技术方案之四为：一种试剂盒，其包含如技术方案之一所述的生物标志物组合，或如技术方案之二所述的试剂。
12.本发明的技术方案之五为：技术方案之四所述的试剂盒在制备肠癌患者接受常规化疗联合靶向治疗的预后产品中的应用。
13.本发明的技术方案之六为：一种用于评估肠癌患者接受常规化疗联合靶向治疗的预后的系统，所述系统包括：
14.数据处理模块，用于将接收或输入患者的如技术方案之一所述的生物标志物组合的数据进行计算，得到计算结果；以及
15.判断并输出模块，用于判断所述的计算结果是否符合预设的判断条件，并输出预测结果；
16.任选地，在所述判断并输出模块中，当所述计算结果满足所述判断条件时，输出预测结果为“预后效果好、推荐该治疗方案”；当所述计算结果不满足所述判断条件时，输出预测结果为“预后效果差、不推荐该治疗方案”；
17.任选地，在所述数据处理模块中，所述数据为患者的如技术方案之一所述的生物标志物组合的表达量信息；
18.任选地，所述生物标志物的表达量信息是利用测序方法得到的；
19.任选地，所述判断并输出模块优选glm广义线性模型；
20.任选地，在所述判断并输出模块中，所述判断包括如技术方案之一所述的生物标志物组合的表达量信息在模型中的表现，即敏感预测概率和非敏感预测概率；
21.任选地，所述判断条件为敏感预测概率与非敏感预测概率的比较：1)若敏感预测
概率大于非敏感预测概率，且敏感预测概率大于0.8，向患者推荐该治疗方案；2)若非敏感预测概率大于敏感预测概率，且非敏感预测概率大于0.8，不推荐该治疗方案；3)若敏感预测概率或者非敏感预测概率小于等于0.8，均不推荐该治疗方案。
22.较佳地，所述系统还包括样本提取模块，所述样本提取模块提取样本数据，并将其传输给生物标志物组合验证模块。
23.本发明的技术方案之七为：一种包括机器学习模型的装置，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述计算机程序被所述处理器执行时，可实现如技术方案之六所述的系统的功能。
24.本发明的技术方案之八为：一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如技术方案之六所述的系统的功能。
25.本发明的技术方案之九为：如技术方案之六所述的系统在制备评估肠癌患者接受常规化疗联合靶向治疗的预后的产品中的应用；
26.较佳地，所述产品为芯片、试剂盒、试纸或者高通量测序平台。
27.可见，本发明主要提供了一组用于预测肠癌常规化疗联合靶向治疗响应的蛋白质分子，建立预测模型，有助于实现个性化治疗；基于此，提供一种用于基于临床样本检测的肠癌常规化疗联合靶向治疗的装置及决策系统。
28.另外，本发明还提供了一种用于基于临床样本蛋白质组的预测治疗反应的方法，所述方法包括如下步骤：
29.(1)收集常规化疗联合靶向治疗的不同治疗反应的肠癌患者的治疗前的临床样本如石蜡包埋样本肿瘤组织切片；
30.(2)肠癌患者临床样本蛋白质制备；
31.(3)检测肠癌患者样品中的蛋白质分子表达水平；
32.(4)找到肠癌患者不同治疗反应的高表达的蛋白质组分子，并构建分类器进行区分。
33.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
34.本发明所用试剂和原料均市售可得。
35.本发明的积极进步效果在于：
36.本发明提供的上述蛋白质分子标志物通过实验发现在肠癌患者不同治疗反应的临床样本中的表达水平存在显著变化，因此本发明中提供的蛋白质分子标志物可以作为预测肠癌患者接受常规化疗治疗的不同反应的模型，具有高灵敏度和高特异性的优点，为预测肠癌患者接受常规化疗治疗提供有利的技术支持。
37.基于肠癌患者接受常规化疗治疗的不同反应的临床样本的蛋白质分子标志物研制相应的预测装置，具有广泛的科研价值并为肠癌患者提供个性化治疗，为患者推荐是否适合接受该治疗方案。
附图说明
38.图1显示训练集的预测准确度、灵敏度以及特异性。
39.图2显示内部验证集的预测准确度、灵敏度以及特异性。
具体实施方式
40.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
41.实施例中所需的接受常规化疗联合靶向治疗的肠癌患者的治疗前的31例的临床样本来自复旦大学中山医院。本研究的设计和实施由复旦大学中山医院医学伦理委员会通过伦理投票批准和监督。已获得所有患者的书面知情同意。
42.实施例1肠癌治疗前的临床样本的预处理
43.临床样本为福尔马林固定石蜡包埋组织。样品预处理：从石蜡块上取3-10μm厚的切片进行宏观解剖，二甲苯脱蜡，乙醇洗涤，风干处理，获得白片，同时苏木精-伊红对3μm厚的切片进行染色作为肿瘤镜下对切片中肿瘤细胞含量进行评估判断并划选肿瘤区域。10μm厚的切片收集对应的肿瘤样本至离心管中，-80℃冻存备用。
44.实施例2临床样本的蛋白质及肽段提取
45.将等量的ffpe组织收集于ep管，加入裂解缓冲液(0.1m tris-hcl ph8.0中，0.1m dtt，1mm pmsf)，然后用磨棒研磨3分钟；加入十二烷基硫酸钠(sds)使终浓度为4％，99℃，1800rpm震荡2-2.5小时；12,000g离心5分钟收集上清于ep管，加入4倍体积的丙酮，放置-20℃4小时或过夜；12,000g于4℃离心1分钟弃上清保留沉淀，冷丙酮洗涤沉淀三次，超净台风干处理蛋白沉淀；用8m urea和50mm nh4hco3将蛋白沉淀复溶后加在fasp管中，反复用50mm nh4hco3离心去除urea；将溶有5.5μg胰蛋白酶的50μl 50mm nh4hco3加入到fasp管中，于37℃温育18-20小时进行酶解；12,800g离心15分钟收集肽段，为提高肽段得率，用200μlms水洗涤两次，一并收集；60℃真空抽干，获得用于质谱检测所需的肽段。
46.实施例3临床样本的质谱检测
47.用q-exactive hf-x混合四极轨道阱质谱仪(thermo fisher scientific，rockford，il，usa)和高效液相色谱系统(easy nlc 1200，thermo fisher)进行检测，并得到该肽样品对应的质谱数据。具体操作为：
48.抽干的肽样品重新溶解在溶剂a(0.1％甲酸的水溶液)中，上样至trap柱(100μm
×
2cm；粒子大小，3μm；孔径大小，)，后在分析柱上进行分离(150μm
×
12cm，粒子大小，1.9μm；孔径大小，)，梯度为5-35％流动相b(80％乙腈和0.1％甲酸)洗脱，流速为600nl/min，合计洗脱75分钟。对qe-hfx进行ms分析，一次全扫描(300-1400m/z，分辨率＝12000)，离子阱中允许进入的最大离子数(automatic gain control target，agc target)为3e+06离子，随后进行高能量碰撞诱导离解(隔离窗口为1.6m/z，碰撞能量为27％，agc target为5e+04离子，最大注入时间为30ms，动态排除设置为18秒)。液相色谱串联质谱系统使用xcalibur软件(thermo scientific)控制进行数据采集。
49.实施例4数据分析
50.所有数据均使用firmiana进行处理。firmiana是一个基于galaxy系统的工作流，由用户登录界面、原数据、识别与量化、数据分析和知识挖掘等多个功能模块组成。原始文件是根据人类国家生物技术信息中心(ncbi)的refseq蛋白质数据库检索的。选择胰蛋白酶作为蛋白水解酶，最大允许两个漏切位点，固定修饰为carbamidomethyl(c)，动态修饰为protein acetyl(protein n-term)，oxidation(m)。第一个搜索质量耐受性为20ppm，主要
搜索肽耐受性为0.5da。肽谱匹配(psms)和蛋白质的错误发现率(fdr)均小于1％。将所鉴定的肽段定量结果记为所有参考谱库中色谱碎片离子峰面积的平均值。使用无标签的基于强度的绝对定量(ibaq)方法进行蛋白质定量。我们计算了峰面积值作为相应蛋白质的一部分。总分数(fot)用于表示样品中特定蛋白质的标准化丰度。fot定义为蛋白质的ibaq除以样品中所有已鉴定蛋白质的总ibaq。选择具有至少一条专属肽段(unique peptide)且1％fdr的蛋白质进行进一步分析。
51.对复旦大学中山医院的肠癌患者的临床样本中的132种蛋白质分子标志物(aar2、acyp1、akt2、amy2b、apoc2、arl6ip1、armcx1、asna1、baiap2l1、c10orf54、c19orf66、c4bpa、c9、ccdc137、ccdc43、ccdc47、cd55、cdk12、cdk4、cdx1、cfl2、clec11a、cnep1r1、cpb2、cpped1、cst1、ctr9、cyp51a1、d2hgdh、dcakd、dhf、dhodh、dnm2、dolpp1、ebna1bp2、egfr、entpd4、eps8、evpl、f10、fdx1、fermt1、fga、fry、gnai1、hist1h1e、hla-dpa1、hla-drb4、hook1、inpp5f、itih4、jund、kif20a、lbp、mad1l1、maged1、magi3、magt1、map3k3、mastl、mepce、mpp5、mpp7、mrpl3、mrps2、mrps28、msi2、mst1r、mta3、mtfr1、nae1、nckap1l、nol3、oaf、pes1、plekhg3、plvap、poglut1、polr2l、polrmt、ppp1ca、ppp1r13l、prim1、prtfdc1、psip1、ptgr2、qpct、rab4a、rbbp5、rdh10、relb、rnf123、rnf220、rock1、rpl18a、saa2、sdr16c5、serpina5、sh3bgrl2、slc25a26、slc35b1、slc37a3、smc2、sp3、srgn、ston2、sufu、supt20h、taok3、tbcb、tcea3、thumpd3、tlr8、tmem55b、tmem63b、tmem68、tor3a、tp53rk、trmt10c、txn2、ubr4、uhrf1、usp11、vnn2、vps33a、vwa8、wdhd1、wdr18、wdr70、wnk2、xxylt1、znf830)的相对表达水平计算其预测准确度，灵敏度及特异性，其中包24例训练集，预测准确率为100％，诊断灵敏度100％，特异性100％(见图1)，剩余7例为内部验证集，预测准确率为100％，诊断灵敏度100％，特异性100％(见图2)。对于待治疗肠癌患者，根据蛋白质分子标志物的表达水平，得到该患者使用常规化疗联合靶向治疗的不同反应的输出结果，从而向该患者推荐或不推荐该治疗方案(见表1)。
52.数据是基于glm模型，在r语言环境下，使用predict函数如predict(glm.model,test_data,type＝"prob")。此处glm.model为该治疗方案的标志物预测模型，test_data为待治疗患者的蛋白质组所测得的标志物组合表达量信息，type＝"prob"为预测敏感和非敏感的概率值。如上述描述，将标志物组合表达值输入模型，使用predict函数输出患者对常规化疗联合靶向治疗敏感和非敏感的概率，输出的结果即为表中的结果。判断是否使用该治疗方案是参考该治疗方案敏感预测概率值和非敏感治疗概率值。本专利推荐参考值：根据敏感预测概率大于非敏感预测概率，且敏感预测概率大于0.8，向患者推荐该治疗方案；根据非敏感预测概率大于敏感预测概率，且非敏感预测概率大于0.8，不推荐该治疗方案；敏感预测概率或者非敏感预测概率小于等于0.8，均不推荐该治疗方案。
53.表1
[0054][0055]
由上述结果可知，将肠癌患者的临床样本中的132种蛋白质分子标志物(aar2、acyp1、akt2、amy2b、apoc2、arl6ip1、armcx1、asna1、baiap2l1、c10orf54、c19orf66、c4bpa、c9、ccdc137、ccdc43、ccdc47、cd55、cdk12、cdk4、cdx1、cfl2、clec11a、cnep1r1、cpb2、cpped1、cst1、ctr9、cyp51a1、d2hgdh、dcakd、dhf、dhodh、dnm2、dolpp1、ebna1bp2、egfr、entpd4、eps8、evpl、f10、fdx1、fermt1、fga、fry、gnai1、hist1h1e、hla-dpa1、hla-drb4、hook1、inpp5f、itih4、jund、kif20a、lbp、mad1l1、maged1、magi3、magt1、map3k3、mastl、mepce、mpp5、mpp7、mrpl3、mrps2、mrps28、msi2、mst1r、mta3、mtfr1、nae1、nckap1l、nol3、oaf、pes1、plekhg3、plvap、poglut1、polr2l、polrmt、ppp1ca、ppp1r13l、prim1、prtfdc1、psip1、ptgr2、qpct、rab4a、rbbp5、rdh10、relb、rnf123、rnf220、rock1、rpl18a、saa2、sdr16c5、serpina5、sh3bgrl2、slc25a26、slc35b1、slc37a3、smc2、sp3、srgn、ston2、sufu、supt20h、taok3、tbcb、tcea3、thumpd3、tlr8、tmem55b、tmem63b、tmem68、tor3a、tp53rk、trmt10c、txn2、ubr4、uhrf1、usp11、vnn2、vps33a、vwa8、wdhd1、wdr18、wdr70、wnk2、xxylt1、znf830)或其中分子的任意联用，可用于预测肠癌患者是否适合接受常规化疗联合靶向治疗。
[0056]
最后，上述具体实施方法仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。