与鸡胸肌肉色性状相关的分子标记及其应用

1.本发明涉及分子标记技术领域，具体地说，涉及与鸡胸肌肉色性状相关的分子标记及其应用。


背景技术：

2.近年来随着肉类消费结构的改变，鸡肉的消费量呈逐年增长的趋势。商业化鸡种在追求快速生长以达到产肉率高和节约成本的同时，也带来了肉品质不佳等问题。
3.肉色是消费者评判肉品质优劣的最直接的感官指标，其评价指标为cielab颜色系统的亮度l*、红度a*、黄度b*三个参数。一方面消费者对颜色有偏爱，如劣质肉pse肉的最大特征就是颜色灰白而被淘汰。另一方面，肉色与其他肉品质指标直接相关。一般来讲，a*反应了肉的新鲜度，a*越高，肉越新鲜；而b*与肌内脂肪含量正相关，l*偏高的肉与pse肉发生潜在关联。肉色作为典型的复杂性状，受到肌红蛋白含量、ph、肌内脂肪、品种、饲养条件、饲粮和加工参数等多种因素的影响，建立稳定有效的遗传选育方法，对优质肉禽选育至关重要。
4.随着育种技术的发展，利用分子标记进行辅助选择是理想方法之一，可以实现目标性状的早期选择，实现与性状相关等位基因的快速纯合，加快育种进展。snp(single nucleotide polymorphism)作为第三代遗传标记与其他分子标记相比具有较大的优越性：snp数量多，分布广泛；snp适于快速、规模化筛查；snp等位基因频率的容易估计；易于基因分型。在当前家禽饲养成本(饲料、人工、环境控制等)急剧飙升的大背景下，利用分子标记辅助选择法对复杂性状进行选择提高，即可节省新品系选育的准确性，又可以提高配套制种的效率。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种与鸡胸肌肉色性状显著相关的snp分子标记及高品质鸡选育方法。
6.肉色l*值反应鸡肉的亮度，a*反应鸡肉的红度，是衡量肉品质的重要指标，二者之间呈强的负相关。
7.针对育种和生产实践需求，本发明使用以黄羽肉鸡d2系和快速型白羽肉鸡b系为代表性素材，通过全基因选择性信号分析以及转录组分析定位与肉色表型相关的候选区域，通过肉色表型和全基因组snp测定，筛选并获得显著影响鸡肉色的snp标记。为实现胸肌肉色的早期选择和性状相关等位基因的快速纯和，加快遗传选择进展提供技术支撑。
8.肉色的分子标记研发难度在于性状的复杂性，因为肉色受到营养和饲养环境等外部因素影响较大，所以需要大样本的测定和关联等分析后才能有望确定有效的分子标记。
9.具体地，本发明的技术方案如下：
10.与鸡胸肌肉色性状相关的分子标记，所述鸡胸肌肉色性状指cielab颜色系统肉色亮度值l*或红度值a*，所述分子标记包括rs314975036、rs13870259、rs14828173、
rs13818821和rs734339595；
11.其中，分子标记rs314975036含有鸡1号染色体上第55,750,308bp处多态性为a/g的核苷酸序列；
12.分子标记rs13870259含有鸡1号染色体上第55,750,741bp处多态性为t/a的核苷酸序列；
13.分子标记rs14828173含有鸡1号染色体上第55,754,161bp处多态性为c/g的核苷酸序列；
14.分子标记rs13818821含有鸡1号染色体上第196,830,375bp处多态性为g/a的核苷酸序列；
15.分子标记rs734339595含有鸡1号染色体上第196,778,102bp处多态性为a/g的核苷酸序列。
16.以上分子标记的物理位置参考基因组grcg6a版本。
17.本发明中，分子标记rs314975036所含多态性位点的基因型为aa，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低a*水平，所含多态性位点的基因型为ga，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低a*水平，所含多态性位点的基因型为gg，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高a*水平；
18.分子标记rs13870259所含多态性位点的基因型为ta，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低a*水平，所含多态性位点的基因型为tt，对应于待测鸡的胸肌肉色具有a*水平居中，所含多态性位点的基因型为aa，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高a*水平；
19.分子标记rs14828173所含多态性位点的基因型为gc，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低a*水平，所含多态性位点的基因型为gg，对应于待测鸡的胸肌肉色具有a*水平居中，所含多态性位点的基因型为cc，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高a*水平；
20.分子标记rs13818821所含多态性位点的基因型为gg，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低l*水平，所含多态性位点的基因型为ga，对应于待测鸡的胸肌肉色的l*水平居中，所含多态性位点的基因型为aa，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高l*水平；
21.分子标记rs734339595所含多态性位点的基因型为gg，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低l*水平，所含多态性位点的基因型为ga，对应于待测鸡的胸肌肉色的l*水平居中，所含多态性位点的基因型为aa，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高l*水平。
22.本发明还提供一种用于扩增上述分子标记的引物。
23.本发明中，扩增分子标记rs314975036的引物如seq id no.1-2所示；
24.扩增分子标记rs13870259的引物如seq id no.3-4所示；
25.扩增分子标记rs14828173的引物如seq id no.5-6所示；
26.扩增分子标记rs13818821的引物如seq id no.7-8所示；
27.扩增分子标记rs734339595的引物如seq id no.9-10所示。
28.本发明另提供一种含有上述引物的试剂或试剂盒。
29.本发明再提供一种上述分子标记或引物或试剂或试剂盒的以下任一应用：
30.(1)在鉴定鸡胸肌肉色相关性状表型中的应用；
31.(2)在鸡胸肌肉色相关性状早期预测中的应用；
32.(3)在鸡资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
33.其中，所述鸡胸肌肉色相关性状指cielab颜色系统肉色亮度值l*或红度值a*。
34.本发明还提供一种优质鸡的分子育种方法，包括：
35.(1)提取待测鸡总dna；
36.(2)以dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增；
37.(3)分析pcr扩增产物，判断鸡遗传潜质，留种、繁种。
38.本发明中，步骤(3)包括：对扩增产物进行等位基因检测，根据基因分型结果判定如下：
39.若分子标记rs314975036所含多态性位点的基因型为gg，判断待测鸡的胸肌肉色具有高a*水平；
40.分子标记rs13870259所含多态性位点的基因型为aa，判断待测鸡的胸肌肉色具有高a*水平；
41.分子标记rs14828173所含多态性位点的基因型为cc，判断待测鸡的胸肌肉色具有高a*水平；
42.分子标记rs13818821所含多态性位点的基因型为gg，判断待测鸡的胸肌肉色具有低l*水平；
43.分子标记rs734339595所含多态性位点的基因型为gg，判断待测鸡的胸肌肉色具有低l*水平。
44.本发明的有益效果至少在于：
45.本发明采用鸡胸肌肉色l*和肉色a*双性状改良分子育种技术，涉及整合利用显著snp分子标记的基因组选择方法，可同时改良两个肉色指标。通过本发明选育的种系，可降低肉色l*，提高肉色a*，对肉鸡的生产具有重大的指导意义。
附图说明
46.图1为本发明rs314975036的基因分型图。
47.图2为本发明rs13870259的基因分型图。
48.图3为本发明rs14828173的基因分型图。
49.图4为本发明rs13818821的基因分型图。
50.图5为本发明rs734339595的基因分型图。
51.图6为本发明转录组差异基因go和kegg富集分析结果，其中，圆圈大小代表富集基因数，圆圈颜色代表p值，条目编码来自kegg或go数据库。
52.图7为本发明fst受选择基因go和kegg富集分析结果，其中，圆圈大小代表富集基因数，圆圈颜色代表p值，条目编码来自kegg或go数据库。
53.图8为关键候选基因在d2(jxh)和b系(line b)中荧光定量pcr定量表达验证结果，其中，*p《0.05,**p《0.01。
具体实施方式
54.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
55.下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，各实施
例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
56.本发明的分子标记详细信息见表1，引物信息见表2。
57.表1
58.ensembl公共数据库中rs编号gga位置(bp)等位基因rs314975036155,750,308a/grs13870259155,750,741t/ars14828173155,754,161c/grs138188211196,830,375g/ars7343395951196,778,102a/g
59.具体包括，鸡1号染色体(gga1)55,750,308位置上的a/g突变、鸡1号染色体(gga1)55,750,741位置上的t/a突变、鸡1号染色体(gga1)55,754,161位置上的c/g突变、鸡1号染色体(gga1)196,830,375位置上的g/a突变和鸡1号染色体(gga1)196,778,102位置上的a/g突变。snp位点rs314975036、rs13870259、rs14828173、rs13818821和rs734339595的基因分型图分别参见图1至图5。
60.表2引物信息
[0061][0062]
上述分子标记位点基因型的检测，可以待测鸡的基因组为模板，利用表2中的引物(seq id no.1-10)进行pcr扩增后，采用直接测序法或其他有效方式对扩增产物进行等位基因检测测序。
[0063]
pcr反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃5min。pcr反应体系以25μl计为：模板dna10pg-1μg，上游引物0.1-1μl，下游引物0.1-1μl，2
×
taq pcr mastermix12.5μl，ddh2o补至25μl。
[0064]
实施例1：与鸡肉色相关的snp标记的获得
[0065]
首先，随机挑选中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地京星黄鸡d2家系母鸡100只，新广农牧育种场科宝肉鸡终端父系b系公鸡100只。利用柯尼卡美能达公司生产的型号为cr-410的色彩色差计测定胸肌肉色表型，其中l*值表示亮度，a*值表示红度，b*值表示黄度。结果表明b系亮度值(l*)、红度值(a*)高于d2，黄度值(b*)低于d2。两品种肉色表型值存在显著差异(表3)。
[0066]
表3d2与b系肉色表型差异
[0067][0068]
通过对d2和b系全基因组重测序数据进行群体分化指数fst分析找出两品种基因组受选择基因；对d2和b系转录组数据进行差异表达分析，找出两品种间差异表达基因。通过对候选基因进行kegg和go富集分析，发现候选基因富集到与肉色表型相关的糖、脂代谢，色素含量相关通路。结果参见图6和图7。从图6的转录组差异基因go和kegg富集分析结果可知，肉色表型与脂肪酸代谢、氨基酸代谢、血红素和铁结合有关的物质相关，从图7的fst受选择基因go和kegg富集分析结果可知，肉色表型与脂肪酸代谢、蛋白质转换以及与血红素和铁的结合有关的物质相关。
[0069]
将与糖脂代谢、色素沉积相关的在基因组上受到选择同时在转录组水平差异表达的基因作为关键候选基因。首先对关键候选基因进行荧光定量pcr定量验证(内参是rpl32)，其中有8个基因与转录组结果趋势一致(图8)。
[0070]
在d2和b系重测序数据中提取8个关键候选基因区域内的snp，并与肉色表型进行一般线性模型关联分析，其中gdpd5、tbxas1基因区域内的5个snp在d2和b系中均显著与肉色表型相关(表4)。
[0071]
表4gdpd5、tbxas1基因区域内肉色显著相关snp位点
[0072]
基因表型snpd2 p值b系p值tbxas1a*rs3149750360.032140.02183tbxas1a*rs138702590.048240.00372tbxas1a*rs148281730.037150.001035gdpd5l*rs138188210.00090890.01881gdpd5l*rs7343395950.036240.004584
[0073]
实施例2：进一步检验标记对京星黄鸡d2系肉色l*和a*性状的影响
[0074]
本实施例在实施例1的研究基础上，进一步统计表1中的4个显著snp位点对于100只京星黄鸡d2系(来自于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地)胸肌肉色相关性状l*和a*的影响数据(平均值
±
标准误差)，结果见表5和表6。
[0075]
本实施例中，以鸡dna为模板，采用表2中引物和上述pcr反应条件(记载于表2下方)进行扩增，采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，对snp位点基因型进行分型。
[0076]
表5
[0077][0078]
注：不同肩标字母表示差异显著(p《0.05)。
[0079]
从表5中可知，分子标记rs13818821与l*的关联性佳。
[0080]
表6
[0081][0082][0083]
注：不同肩标字母表示差异显著(p《0.05)。
[0084]
从表6中可知，分子标记rs314975036与a*的关联性佳；分子标记rs13870259与a*的关联性佳；分子标记rs14828173与a*的关联性佳。
[0085]
实施例3：进一步检验标记对白羽肉鸡b系肉色l*性状的影响
[0086]
本实施例在实施例1的研究基础上，进一步统计表1中的1个显著snp位点对于100只白羽肉鸡b系(来自于新广农牧育种场)胸肌肉色相关性状l*影响数据(平均值
±
标准误差)，结果见表7。
[0087]
本实施例中，以鸡dna为模板，采用表2中引物和上述pcr反应条件进行扩增，采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，对snp位点基因型进行分型。
[0088]
表7
[0089][0090]
注：不同肩标字母表示差异显著(p《0.05)。
[0091]
从表7中可知，分子标记rs734339595与l*的关联性佳。
[0092]
实施例4利用本发明的snp分子标记辅助选择改良肉色的育种方法
[0093]
1、待选择群体
[0094]
挑选待检测种鸡500只以上，于20日龄左右翅静脉采血，加入抗凝剂，-20℃保存备用。
[0095]
2、dna提取
[0096]
采用常规酚仿或试剂盒等常用方法提取基因组dna,溶于te缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测dna的纯度和浓度,然后稀释至浓度50ng/μl。
[0097]
3、pcr反应及序列测定
[0098]
采用表2中引物和上述pcr反应条件进行扩增，采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，对snp位点rs314975036、rs13870259、rs14828173、rs13818821和rs734339595位点基因型进行分型。
[0099]
根据基因分型结果选留满足rs314975036位点为gg基因型、rs13870259位点为aa基因型、rs14828173位点为cc基因型中任意一项的健康公母鸡，为胸肌肉色红度偏高的鸡。
[0100]
根据基因分型结果选留满足rs13818821位点为gg基因型、rs734339595位点为gg基因型中任意一项的健康公母鸡，为胸肌肉色亮度偏低的鸡。
[0101]
根据基因分型结果选留满足rs314975036位点为aa基因型的健康公母鸡，为胸肌肉色红度偏低的鸡。
[0102]
根据基因分型结果选留满足rs13818821位点为aa基因型、rs734339595位点为aa基因型中任意一项的健康公母鸡，为胸肌肉色亮度偏高的鸡。
[0103]
总之，根据目标种鸡群的实际情况确定选育方向，按上述方法根据不同基因型辅助选择。
[0104]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。