针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用的制作方法

针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用
1.本技术是申请日为2020年07月17日，申请号为2020106941733，发明名称为“针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用。


背景技术：

3.冠状病毒(cov)具有单链、非节段的正极性rna基因组，其病毒含有4种主要结构蛋白：核衣壳(n)蛋白、跨膜(m)蛋白、包膜(e)蛋白和刺突(s)蛋白。其中刺突蛋白s对病毒附着、融合、进入、传播发挥关键作用，包含n端负责病毒受体结合的s1亚基和c端负责病毒-细胞膜融合的s2亚基，s1可细分为n-末端结构域(ntd)和受体结合结构域(rbd)。
4.新冠病毒(sars-cov2)是新型冠状病毒肺炎(covid-19)的病原体。中和抗体被认为是对抗covid-19候选疗法。就其原理来说，新冠病毒通过其表面的刺突糖蛋白(s蛋白)识别并结合宿主细胞表面受体，而中和抗体正是靶向该蛋白。中和抗体药物注射进人体后，能抢先与新冠病毒的刺突蛋白(s蛋白)结合，使病毒无法感染人体细胞，从而被免疫系统清除。
5.众多抗体药物研发企业和高校院所都竞相开展了中和抗体药物的研发，靶点基本都是新冠病毒的s蛋白，且绝大比例研究集中在s蛋白的rbd结合区域。从3月中旬第一个新冠病毒中和抗体问世，至今已经有多个具备真病毒中和活性的中和抗体发表。复旦大学应天雷组以及中国医学科学院病原生物学研究所均公布了针对新型冠状病毒的纳米抗体。纳米抗体作为新一代抗体诊断及治疗中的新兴力量，具有稳定性高、人源化简单、生产快、成本低、易于纯化等特点，在免疫实验、诊断与治疗中，发挥着超乎想象的巨大功能。同时，纳米抗体由于体积小而理化性质优异，可开发为雾化吸入制剂，理论上尤其适用于新冠肺炎等呼吸系统疾病的治疗。
6.针对目前尚无治疗新冠肺炎的特效药的现状，研发一款对ace2/s-rbd具备较高阻断活性，且能够与多种病毒突变体结合的纳米抗体，将具备极高的市场价值及临床应用价值。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用。
8.本发明的第一方面，提供了一种针对新型冠状病毒的纳米抗体。
9.在另一优选例中，所述针对新型冠状病毒的纳米抗体能够特异性结合sars-cov2。
10.在另一优选例中，所述针对新型冠状病毒的纳米抗体能够特异性结合sars-cov2 s蛋白。
11.在另一优选例中，所述针对新型冠状病毒的纳米抗体的互补决定区cdr为选自下
组的一种或多种：
12.(1)seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、和seq id no:3所示的cdr3；
13.(2)seq id no:10所示的cdr1、seq id no:11所示的cdr2、和seq id no:12所示的cdr12；
14.(3)seq id no:19所示的cdr1、seq id no:20所示的cdr2、和seq id no:21所示的cdr3；
15.(4)seq id no:28所示的cdr1、seq id no:29所示的cdr2、和seq id no:30所示的cdr3；
16.(5)seq id no:37所示的cdr1、seq id no:38所示的cdr2、和seq id no:39所示的cdr12；
17.(6)seq id no:46所示的cdr1、seq id no:47所示的cdr2、和seq id no:48所示的cdr3；
18.(7)seq id no:55所示的cdr1、seq id no:56所示的cdr2、和seq id no:57所示的cdr3；
19.(8)seq id no:64所示的cdr1、seq id no:65所示的cdr2、和seq id no:66所示的cdr12；
20.(9)seq id no:73所示的cdr1、seq id no:74所示的cdr2、和seq id no:75所示的cdr3；
21.(10)seq id no:82所示的cdr1、seq id no:83所示的cdr2、和seq id no:84所示的cdr3；
22.(11)seq id no:91所示的cdr1、seq id no:92所示的cdr2、和seq id no:93所示的cdr12；
23.(12)seq id no:100所示的cdr1、seq id no:101所示的cdr2、和seq id no:102所示的cdr3；
24.(13)seq id no:109所示的cdr1、seq id no:110所示的cdr2、和seq id no:111所示的cdr3；
25.(14)seq id no:118所示的cdr1、seq id no:119所示的cdr2、和seq id no:120所示的cdr12；
26.(15)seq id no:127所示的cdr1、seq id no:128所示的cdr2、和seq id no:129所示的cdr3；
27.(16)seq id no:136所示的cdr1、seq id no:137所示的cdr2、和seq id no:138所示的cdr3；
28.(17)seq id no:145所示的cdr1、seq id no:146所示的cdr2、和seq id no:47所示的cdr12；
29.(18)seq id no:154所示的cdr1、seq id no:155所示的cdr2、和seq id no:156所示的cdr3；
30.(19)seq id no:163所示的cdr1、seq id no:164所示的cdr2、和seq id no:165所示的cdr3；
31.(20)seq id no:172所示的cdr1、seq id no:173所示的cdr2、和seq id no:174所示的cdr12；
32.(21)seq id no:181所示的cdr1、seq id no:182所示的cdr2、和seq id no:183所示的cdr3；
33.(22)seq id no:190所示的cdr1、seq id no:191所示的cdr2、和seq id no:192所示的cdr3；
34.(23)seq id no:199所示的cdr1、seq id no:200所示的cdr2、和seq id no:201所示的cdr12；
35.(24)seq id no:208所示的cdr1、seq id no:209所示的cdr2、和seq id no:210所示的cdr3；
36.(25)seq id no:217所示的cdr1、seq id no:218所示的cdr2、和seq id no:219所示的cdr3；
37.(26)seq id no:226所示的cdr1、seq id no:227所示的cdr2、和seq id no:228所示的cdr12；
38.(27)seq id no:235所示的cdr1、seq id no:236所示的cdr2、和seq id no:237所示的cdr3；
39.(28)seq id no:244所示的cdr1、seq id no:245所示的cdr2、和seq id no:246所示的cdr3；
40.(29)seq id no:253所示的cdr1、seq id no:254所示的cdr2、和seq id no:255所示的cdr12；
41.(30)seq id no:262所示的cdr1、seq id no:263所示的cdr2、和seq id no:264所示的cdr3；
42.(31)seq id no:271所示的cdr1、seq id no:272所示的cdr2、和seq id no:273所示的cdr3；
43.(32)seq id no:280所示的cdr1、seq id no:281所示的cdr2、和seq id no:282所示的cdr12；
44.(33)seq id no:289所示的cdr1、seq id no:290所示的cdr2、和seq id no:291所示的cdr3；
45.(34)seq id no:298所示的cdr1、seq id no:299所示的cdr2、和seq id no:300所示的cdr12；和
46.(35)seq id no:307所示的cdr1、seq id no:308所示的cdr2、和seq id no:309所示的cdr3。
47.在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与新型冠状病毒的s蛋白特异性结合能力的衍生序列。
48.在另一优选例中，所述针对新型冠状病毒的纳米抗体能够与新型冠状病毒的s蛋白特异性结合。
49.在另一优选例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。
50.在另一优选例中，所述针对新型冠状病毒的纳米抗体还包括框架区fr。
51.在另一优选例中，所述的框架区fr为选自下组的一种或多种：
52.(1)seq id no:4所示的fr1、seq id no:5所示的fr2、seq id no:6所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4；
53.(2)seq id no:13所示的fr1、seq id no:14所示的fr2、seq id no:15所示的fr3、和seq id no:16所示的fr4；
54.(3)seq id no:22所示的fr1、seq id no:23所示的fr2、seq id no:24所示的fr3、和seq id no:25所示的fr4；
55.(4)seq id no:31所示的fr1、seq id no:32所示的fr2、seq id no:33所示的fr3、和seq id no:34所示的fr4；
56.(5)seq id no:40所示的fr1、seq id no:41所示的fr2、seq id no:42所示的fr3、和seq id no:43所示的fr4；
57.(6)seq id no:49所示的fr1、seq id no:50所示的fr2、seq id no:51所示的fr3、和seq id no:52所示的fr4；
58.(7)seq id no:58所示的fr1、seq id no:59所示的fr2、seq id no:60所示的fr3、和seq id no:61所示的fr4；
59.(8)seq id no:67所示的fr1、seq id no:68所示的fr2、seq id no:69所示的fr3、和seq id no:70所示的fr4；
60.(9)seq id no:76所示的fr1、seq id no:77所示的fr2、seq id no:78所示的fr3、和seq id no:79所示的fr4；
61.(10)seq id no:85所示的fr1、seq id no:86所示的fr2、seq id no:87所示的fr3、和seq id no:88所示的fr4；
62.(11)seq id no:94所示的fr1、seq id no:95所示的fr2、seq id no:96所示的fr3、和seq id no:97所示的fr4；
63.(12)seq id no:103所示的fr1、seq id no:104所示的fr2、seq id no:105所示的fr3、和seq id no:106所示的fr4；
64.(13)seq id no:112所示的fr1、seq id no:113所示的fr2、seq id no:114所示的fr3、和seq id no:115所示的fr4；
65.(14)seq id no:121所示的fr1、seq id no:122所示的fr2、seq id no:123所示的fr3、和seq id no:124所示的fr4；
66.(15)seq id no:130所示的fr1、seq id no:131所示的fr2、seq id no:132所示的fr3、和seq id no:133所示的fr4；
67.(16)seq id no:139所示的fr1、seq id no:140所示的fr2、seq id no:141所示的fr3、和seq id no:142所示的fr4；
68.(17)seq id no:148所示的fr1、seq id no:149所示的fr2、seq id no:150所示的fr3、和seq id no:151所示的fr4；
69.(18)seq id no:157所示的fr1、seq id no:158所示的fr2、seq id no:159所示的fr3、和seq id no:160所示的fr4；
70.(19)seq id no:166所示的fr1、seq id no:167所示的fr2、seq id no:168所示的
fr3、和seq id no:169所示的fr4；
71.(20)seq id no:175所示的fr1、seq id no:176所示的fr2、seq id no:177所示的fr3、和seq id no:178所示的fr4；
72.(21)seq id no:184所示的fr1、seq id no:185所示的fr2、seq id no:186所示的fr3、和seq id no:187所示的fr4；
73.(22)seq id no:193所示的fr1、seq id no:194所示的fr2、seq id no:195所示的fr3、和seq id no:196所示的fr4；
74.(23)seq id no:202所示的fr1、seq id no:203所示的fr2、seq id no:204所示的fr3、和seq id no:205所示的fr4；
75.(24)seq id no:211所示的fr1、seq id no:212所示的fr2、seq id no:123所示的fr3、和seq id no:214所示的fr4；
76.(25)seq id no:220所示的fr1、seq id no:221所示的fr2、seq id no:222所示的fr3、和seq id no:223所示的fr4；
77.(26)seq id no:229所示的fr1、seq id no:230所示的fr2、seq id no:231所示的fr3、和seq id no:232所示的fr4；
78.(27)seq id no:238所示的fr1、seq id no:239所示的fr2、seq id no:240所示的fr3、和seq id no:241所示的fr4；
79.(28)seq id no:247所示的fr1、seq id no:248所示的fr2、seq id no:249所示的fr3、和seq id no:250所示的fr4；
80.(29)seq id no:256所示的fr1、seq id no:257所示的fr2、seq id no:258所示的fr3、和seq id no:259所示的fr4；
81.(30)seq id no:265所示的fr1、seq id no:266所示的fr2、seq id no:267所示的fr3、和seq id no:268所示的fr4；
82.(31)seq id no:274所示的fr1、seq id no:275所示的fr2、seq id no:276所示的fr3、和seq id no:277所示的fr4；
83.(32)seq id no:283所示的fr1、seq id no:284所示的fr2、seq id no:285所示的fr3、和seq id no:286所示的fr4；
84.(33)seq id no:292所示的fr1、seq id no:293所示的fr2、seq id no:294所示的fr3、和seq id no:295所示的fr4；
85.(34)seq id no:301所示的fr1、seq id no:302所示的fr2、seq id no:303所示的fr3、和seq id no:304所示的fr4；和
86.(35)seq id no:310所示的fr1、seq id no:311所示的fr2、seq id no:312所示的fr3、和seq id no:313所示的fr4。
87.在另一优选例中，所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体的vhh链的氨基酸序列选自下组：seq id no:8、seq id no:17、seq id no:26、seq id no:35、seq id no:44、seq id no:53、seq id no:62、seq id no:71、seq id no:80、seq id no:89、seq id no:98、seq id no:107、seq id no:116、seq id no:125、seq id no:134、seq id no:143、seq id no:152、seq id no:161、seq id no:170、seq id no:179、seq id no:188、seq id no:197、seq id no:206、seq id no:215、seq id no:224、seq id no:233、seq id no:242、seq id no:251、
seq id no:260、seq id no:269、seq id no:278、seq id no:287、seq id no:296、seq id no:305、seq id no:314、或其组合。
88.在另一优选例中，所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。
89.本发明的第二方面，提供一种针对新型冠状病毒的抗体，所述抗体包括一个或多个如本发明第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体的vhh链。
90.在另一优选例中，所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体的vhh链的氨基酸序列选自下组：seq id no:8、seq id no:17、seq id no:26、seq id no:35、seq id no:44、seq id no:53、seq id no:62、seq id no:71、seq id no:80、seq id no:89、seq id no:98、seq id no:107、seq id no:116、seq id no:125、seq id no:134、seq id no:143、seq id no:152、seq id no:161、seq id no:170、seq id no:179、seq id no:188、seq id no:197、seq id no:206、seq id no:215、seq id no:224、seq id no:233、seq id no:242、seq id no:251、seq id no:260、seq id no:269、seq id no:278、seq id no:287、seq id no:296、seq id no:305、seq id no:314、或其组合。
91.在另一优选例中，所述的针对新型冠状病毒的抗体，可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
92.本发明的第三方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体，或本发明第二方面所述的抗体。
93.在另一优选例中，所述多核苷酸的序列选自下组：seq id no:9、seq id no:18、seq id no:27、seq id no:36、seq id no:45、seq id no:54、seq id no:63、seq id no:72、seq id no:81、seq id no:90、seq id no:99、seq id no:108、seq id no:117、seq id no:126、seq id no:135、seq id no:144、seq id no:153、seq id no:162、seq id no:171、seq id no:180、seq id no:189、seq id no:198、seq id no:207、seq id no:216、seq id no:225、seq id no:234、seq id no:243、seq id no:252、seq id no:261、seq id no:270、seq id no:279、seq id no:288、seq id no:297、seq id no:306、seq id no:315、或其组合。
94.在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的针对新型冠状病毒的纳米抗体的核酸分子。本发明的核酸可为rna、dna或cdna。
95.本发明的第四方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有本发明的第三方面所述的多核苷酸。
96.在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、aav病毒、逆转录病毒、或其组合。
97.本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明的第三方面所述的多核苷酸。
98.在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
99.在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
100.本发明的第六方面，提供一种产生针对新型冠状病毒的纳米抗体的方法，包括步骤：
101.(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养如本发明的第五方面所述的宿主细胞，从而获得含针对新型冠状病毒的纳米抗体的培养物；
102.(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体；和
103.(c)任选地，对步骤(b)获得的针对新型冠状病毒的纳米抗体进行纯化和/或修饰。
104.本发明的第七方面，提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
105.(a)本发明第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体，或如本发明第二发明所述的针对新型冠状病毒的抗体；和
106.(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或vlp，或其组合。
107.在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
108.(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：tc-99m、ga-68、f-18、i-123、i-125、i-131、in-111、ga-67、cu-64、zr-89、c-11、lu-177、re-188，或其组合；和/或
109.(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：lu-177、y-90、ac-225、as-211、bi-212、bi-213、cs-137、cr-51、co-60、dy-165、er-169、fm-255、au-198、ho-166、i-125、i-131、ir-192、fe-59、pb-212、mo-99、pd-103、p-32、k-42、re-186、re-188、sm-153、ra223、ru-106、na24、sr89、tb-149、th-227、xe-133、yb-169、yb-177，或其组合。
110.在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
111.在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))或任何形式的纳米颗粒。
112.在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明的第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体的vhh链。
113.在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明的第一方面所述针对新型冠状病毒的纳米抗体vhh链。
114.本发明的第八方面，提供了本发明的第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对新型冠状病毒的抗体的用途，用于制备：(1)预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov2感染引起的疾病的药物；(2)检测新型冠状病毒sars-cov2的试剂。
115.在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂，较佳地，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
116.在另一优选例中，所述诊断试剂用于：检测样品中的新型冠状病毒sars-cov2 s蛋白或其片段。
117.本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
118.(i)如本发明的第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体、如本发明的第二方面所述的针对新型冠状病毒的抗体，或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物；和
119.(ii)药学上可接受的载体。
120.本发明的第十方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
121.(i)如本发明的第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体，或如本发明的第三方面所述的针对新型冠状病毒的抗体；和
122.(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
123.在另一优选例中，所述的标签序列包括fc标签、ha标签和6his标签。
124.在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于sars-cov2。
125.本发明的第十一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明的第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体，或如本发明的第二方面所述的针对新型冠状病毒的抗体，或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物。
126.在本发明的第十二方面，提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov2感染引起的疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体、如本发明的第二方面所述的针对新型冠状病毒的抗体，或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物。
127.在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。
128.在另一优选例中，所述的新型冠状病毒sars-cov2感染引起的疾病为肺炎。
129.在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中新型冠状病毒sars-cov2、新型冠状病毒sars-cov2 s蛋白、或其片段的方法，所述方法包括步骤：
130.(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体、如本发明的第二方面所述的针对新型冠状病毒的抗体，或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物接触；
131.(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在新型冠状病毒sars-cov2、新型冠状病毒sars-cov2 s蛋白、或其片段。
132.在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
133.在本发明的第十四方面，提供了一种针对新型冠状病毒感染的诊断方法，包括步骤：
134.(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体、如本发明的第二方面所述的针对新型冠状病毒的抗体，或如本发明的第七方面所述的免疫偶联物接触；和
135.(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象为新型冠状病毒确诊患者。
136.在另一优选例中，所述的样品为血液样品或咽拭子样品，或其他组织器官中的样品。
137.在本发明的第十五方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体、如本发明的第二方面所述的针对新型冠状病毒的抗体，所述的方法包括：
138.(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞；和
139.(b)从培养物中分离出所述的重组多肽。
140.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
141.图1a、1b、1c和1d分别显示了facs检测候选抗体对ace2/sars-cov2 s-rbd阻断活性的检测检测结果。
142.图2显示了elisa检测候选纳米抗体与sars-cov1 s-rbd结合结果。
143.图3显示了elisa检测候选纳米抗体与sars-wiv1 s-rbd结合结果。
144.图4显示了elisa检测候选纳米抗体与mers s-rbd结合结果。
145.图5a、5b、5c、5d、5e、5f、5g、5h、5i、5j、5k、5l、5m和5n分别显示了elisa检测候选纳米抗体与不同s蛋白突变体的结合。
146.图6显示了facs检测候选纳米抗体对sars-wiv1 s-rbd/ace2的阻断活性结果。
147.图7a、7b、7c、7d、7e、7f、7g和7h分别显示了facs检测候选纳米抗体对不同s蛋白突变体与ace2相互作用的阻断活性结果。
148.图8显示了候选纳米抗体对真病毒的中和活性检测结果。
149.图9显示了facs检测候选纳米抗体组合对ace2/sars-cov2 s-rbd的阻断活性结果。
具体实施方式
150.本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得多个针对新型冠状病毒的纳米抗体。具体地，本发明利用人源的sars-cov2 s蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将sars-cov2 s蛋白分子偶联在酶标板上，展示sars-cov2 s蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了sars-cov2 s蛋白特异性的纳米抗体基因。此外，相关实验结果表明，本发明获得的针对新型冠状病毒的纳米抗体能够有效地与sars-cov2 s蛋白结合，同时阻断与其配体的相互作用。在此基础上完成了本发明。
151.术语
152.如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的针对新型冠状病毒的纳米抗体”、“本发明针对新型冠状病毒的纳米抗体”、“针对新型冠状病毒的纳米抗体”、“针对新型冠状病毒的纳米抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于sars-cov2 s蛋白(包括人sars-cov2 s蛋白)的抗体。
153.本发明的纳米抗体的抗体编号以及对应的序列编号如下表1所示。
154.表1
[0155][0156][0157]
注：表中各个数值表示序列编号，即“1”表示“seq id no:1”，表中显示的cdr1、
cdr2、cdr3、fr1、fr2、fr3、fr4的序列编号为其氨基酸序列的编号。
[0158]
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0159]
如本文所用，术语“单域抗体”、“vhh”、“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdab，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(vhh)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(vhh)。
[0160]
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nih publ.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0161]
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的针对新型冠状病毒的纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0162]
如本文所用，术语“重链可变区”与“vh”可互换使用。
[0163]
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region,cdr)”可互换使用。
[0164]
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括三个互补决定区cdr1、cdr2、和cdr3。
[0165]
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
[0166]
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合sars-cov2 s蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
[0167]
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地
至少95％同源性。
[0168]
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(cdr)，将该段间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。
[0169]
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带cdr的抗体重链可变区的分子，只要其cdr与此处鉴定的cdr具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
[0170]
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
[0171]
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6his标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0172]
本发明抗体指具有sars-cov2 s蛋白结合活性的、包括上述cdr区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述cdr区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
[0173]
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0174]
本发明还提供了其他多肽，如包含抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0175]
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表2进行氨基酸替换而产生。
[0176]
表2
[0177]
最初的残基代表性的取代优选的取代
ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
[0178]
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
[0179]
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0180]
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0181]
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0182]
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。
[0183]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
[0184]
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0185]
本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0186]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。
[0187]
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
[0188]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0189]
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0190]
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
[0191]
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
[0192]
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如il-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))等。
[0193]
sars-cov2 s蛋白
[0194]
冠状病毒(cov)具有单链、非节段的正极性rna基因组，其病毒含有4种主要结构蛋白：核衣壳(n)蛋白、跨膜(m)蛋白、包膜(e)蛋白和刺突(s)蛋白。其中刺突蛋白s对病毒附着、融合、进入、传播发挥关键作用，包含n端负责病毒受体结合的s1亚基和c端负责病毒-细胞膜融合的s2亚基，s1可细分为n-末端结构域(ntd)和受体结合结构域(rbd)。冠状病毒首先通过病毒rbd和细胞膜受体(ace2/dpp4)结合，触发s2亚基构象变化，病毒融合侵入细胞。
[0195]
药物组合物
[0196]
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
[0197]
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0198]
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0199]
针对新型冠状病毒的纳米抗体
[0200]
在本发明中，所述针对新型冠状病毒的纳米抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。
[0201]
在本发明的一个优选例中，所述针对新型冠状病毒的纳米抗体包括一条或多条具有如seq id no:8、seq id no:17、seq id no:26、seq id no:35、seq id no:44、seq id no:53、seq id no:62、seq id no:71、seq id no:80、seq id no:89、seq id no:98、seq id no:107、seq id no:116、seq id no:125、seq id no:134、seq id no:143、seq id no:152、seq id no:161、seq id no:170、seq id no:179、seq id no:188、seq id no:197、seq id no:206、seq id no:215、seq id no:224、seq id no:233、seq id no:242、seq id no:251、seq id no:260、seq id no:269、seq id no:278、seq id no:287、seq id no:296、seq id no:305、seq id no:314所示的氨基酸序列的vhh链。
[0202]
标记的抗体
[0203]
在本发明的一个优选例中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
[0204]
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，针对sars-cov2 s蛋白的抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的抗体。
[0205]
本发明的针对新型冠状病毒的纳米抗体能够有效结合sars-cov2 s蛋白。
[0206]
检测方法
[0207]
本发明还涉及检测sars-cov2 s蛋白蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中sars-cov2 s蛋白蛋白的水平。
[0208]
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细
胞保存液中的含细胞的样本。
[0209]
试剂盒
[0210]
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
[0211]
本发明还提供了用于检测sars-cov2 s蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别sars-cov2 s蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
[0212]
应用
[0213]
如上所述，本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与sars-cov2 s蛋白相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对sars-cov2 s蛋白的临床诊断、预防和治疗。
[0214]
本发明的主要优点包括：
[0215]
(a)本发明抗体能够特异性结合人sars-cov2；
[0216]
(b)本发明抗体具有良好的ace2/sars-cov2 s-rbd阻断活性；
[0217]
(c)本发明抗体能够结合新冠病毒的多种突变体；
[0218]
(d)本发明抗体对sars-cov2真病毒中和活性较高；
[0219]
(e)本发明抗体经雾化前后质量稳定。
[0220]
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(sambrook和russell等人，分子克隆：实验室手册(molecular cloning-a laboratory manual)(第三版)(2001)cshl出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0221]
实施例中对照抗体vhh72来源于已发表文章daniel wrapp等.单域camelid抗体有效中和betaconavirus的结构基础[j].细胞,2020,181(6)。
[0222]
实施例1：sars-cov2 s蛋白特异性纳米抗体的筛选
[0223]
为了获得特异性针对人sars-cov2 s蛋白的纳米抗体，首先利用哺乳动物细胞hek293f瞬转表达人sars-cov2 s蛋白，经亲和纯化后用于骆驼免疫。简要地，将纯化的sars-cov2 s蛋白免疫两只新疆双峰驼，7次免疫结束后从骆驼外周血中分离total rna，随后反转录和pcr扩增出vhh基因，再将vhh基因克隆至噬菌体载体pmecs上，转化至tg1中构建成噬菌体展示文库。构建的文库库容分别为4.7
×
109cfu、3.3
×
109cfu、1.3
×
109cfu、1.3
×
108cfu，插入率分别为100％、91.7％、95.8％、95.8％。随后进行文库筛选，4个文库均经3轮筛选获得含抗体基因的噬菌体富集。从每个文库挑选400颗克隆进行pe-elisa鉴定，将获得的阳性克隆进行测序，最终获得206种序列不同的纳米抗体。挑选上清液初筛具有阻断活性的的纳米抗体(35株)利用大肠杆菌表达，表达方法参见专利2018101521076实施例4中的方法描述。
[0224]
实施例2：sars-cov2 s蛋白纳米抗体对ace2/s-rbd的阻断活性检测
[0225]
将培养好的293f/ace2稳转细胞分装至96孔板中，每孔3e5个细胞，3000rpm离心3min去掉上清液，加入稀释好的各抗体及s-rbd-biotin蛋白孵育20min，抗体浓度从160ug/ml开始3倍梯度，共稀释12个梯度。离心弃上清，加入稀释的sa-pe抗体，4℃孵育20min。再次
离心弃上清，每孔加入200ul pbs重悬细胞，流式细胞仪检测样本pe信号。
[0226]
结果如图1a-1d所示，结果表明：32株候选抗体具有良好的ace2/sars-cov2 s-rbd阻断活性。
[0227]
实施例3：候选纳米抗体与不同类型病毒s蛋白的结合活性鉴定
[0228]
将1ug/ml sars-cov1 s-rbd蛋白、mers s-rbd蛋白、sars wiv1 s-rbd蛋白包被酶标版过夜。pbst洗5遍，每孔加入300ul 1％bsa室温封闭2小时。pbst洗5遍，然后将梯度稀释的sars-cov2 s-rbd纳米抗体加入室温孵育1小时。pbst洗5遍，加入100ul稀释的mouse anti-ha antibody室温孵育1小时。pbst洗5遍，加入100ul碱性磷酸酶标记的抗鼠抗体，37℃放置30分钟。加入显色液显色，酶标仪在405nm处测吸光值。
[0229]
纳米抗体与sars-cov1 s-rbd结合的结果如图2所示，所有候选纳米抗体能识别sars-cov-1s-rbd。
[0230]
纳米抗体与sars-wiv1 s-rbd结合的结果如图3所示，nb16-68和nb11-59能够识别sars wiv1 s-rbd。
[0231]
纳米抗体与mers s-rbd结合的结果如图4所示，所有抗体不识别mers s-rbd。
[0232]
实施例4：纳米抗体与不同s蛋白突变体的结合鉴定
[0233]
根据已报到的新冠病毒在传播过程中出现的sars-cov2 s-rbd突变位点(v483a、g476s、a435s、r408i、v367f、n354d、v341i、q321l、s359n、q409e、k458r、i472v、y508h、h519p、k378r)，将制备好的各突变体蛋白以1ug/ml包被酶标版过夜。pbst洗5遍，每孔加入300ul 1％bsa室温封闭2小时。pbst洗5遍，然后将梯度稀释的sars-cov2 s-rbd纳米抗体加入室温孵育1小时。pbst洗5遍，加入100ul稀释的mouse anti-ha antibody室温孵育1小时。pbst洗5遍，加入100ul碱性磷酸酶标记的抗鼠抗体，37℃放置30分钟。加入显色液显色，酶标仪在405nm处测吸光值。
[0234]
结果如图5a-5n所示，nb16-75不能与突变体n354d结合，其余候选的纳米抗体均能与多种突变体结合。
[0235]
实施例5：候选纳米抗体阻断sars wiv1 s-rbd与ace2的活性检测
[0236]
挑选阻断型纳米抗体进行sars wiv1 s-rbd/ace2阻断活性鉴定。将培养好的293f/ace2稳转细胞分装至96孔板中，每孔3e5个细胞，3000rpm离心3min去掉上清液，加入稀释好的各抗体及sars wiv1 s-rbd-biotin蛋白孵育20min。离心弃上清，加入稀释的sa-pe抗体，4℃孵育20min。再次离心弃上清，每孔加入200ul pbs重悬细胞，流式细胞仪检测样本pe信号。
[0237]
结果如图6所示，候选抗体nb11-59和nb16-68具有良好的阻断活性，且阻断活性优于对照抗体vhh72。
[0238]
实施例6：候选纳米抗体阻断不同s蛋白突变体与ace2的活性检测
[0239]
挑选阻断型纳米抗体进行s-rbd突变体阻断活性鉴定。将不同突变体蛋白进行生物素标记，用于阻断活性检测。将培养好的293f/ace2稳转细胞分装至96孔板中，每孔3e5个细胞，3000rpm离心3min去掉上清液，加入稀释好的各抗体及生物素标记的的突变体蛋白孵育20min。离心弃上清，加入稀释的sa-pe抗体，4℃孵育20min。再次离心弃上清，每孔加入200ul pbs重悬细胞，流式细胞仪检测样本pe信号。
[0240]
结果如图7a-7h所示，7个sars-cov2-s-rbd纳米抗体均能阻断多种突变体与293f/
ace2细胞的结合，且都阻断效果均优于对照抗体vhh72。
[0241]
实施例7：候选抗体与protein a的结合测定
[0242]
将1mg/ml候选纳米抗体与100ul protein a亲和柱混合室温孵育30min，然后离心取上清测定蛋白含量。
[0243]
结果如下表3所示：多个抗体能与protein a亲和柱结合。
[0244]
表3纳米抗体与protein a结合效率
[0245]
[0246][0247]
实施例8：候选纳米抗体的tm值测定
[0248]
取2μl 200
×
sypro orange protein gel stain染料与38μl 1mg/ml待检纳米抗体混合，冰上避光孵育15分钟。每个供试品3个复孔，每孔10μl加入pcr管中，置于q-pcr仪上(25℃保持30s，melt curve 25℃to 98℃，每5s增加0.5℃，扫描模式为fam)检测。
[0249]
结果统计如下表4所示。
[0250]
表4纳米抗体的tm值
[0251]
[0252][0253]
实施例9：候选纳米抗体的真病毒中和实验
[0254]
将vero e6细胞以1.5e5个/每孔接种到24孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。用含2％fbs的dmem培养基(2-dmem)梯度稀释抗体。用2％fbs+dmem培养基将sars-cov2病毒液稀释。将稀释的病毒液每孔250μl加到等体积稀释的抗体中，充分混合后置于37℃培养箱中孵育1小时。去除24孔板中vero细胞的培养基，加入200μl抗体-病毒混合液。将孔板置于37℃5％co2培养箱中孵育1小时。去除孵育后的抗体-病毒混合液，用0.5ml pbs洗一遍细胞后，加入0.5ml用2％fbs+dmem稀释的0.9％羧甲基纤维素，置于37℃5％co2培养箱中培养3天。用20％甲醛-pbs加到培养好的细胞孔中孵育1小时，灭活病毒和固定细胞。用水冲洗细胞去除甲醛-pbs及羧甲基纤维素。每孔中加入结晶紫溶液孵育10分钟。用水冲洗孔板以去除结晶紫溶液。将24孔板倒置在纸巾上，使其完全干燥，拍照并统计噬斑数量。根据抗体稀释度计算抗体中和病毒的效价。
[0255]
结果如图8所示，7株候选抗体均具有真病毒阻断活性，其中nb11-59、nb16-68的活性最优，nb16-52、nb15-61次之。
[0256]
实施例10：抗体组合对ace2/s-rbd的阻断活性检测
[0257]
依据鸡尾酒疗法原理，将候选纳米抗体两两组合后，检测其对ace2/s-rbd的阻断作用。将培养好的293f/ace2稳转细胞分装至96孔板中，每孔3e5个细胞，3000rpm离心3min去掉上清液，加入稀释好的组合抗体(抗体两两组合，混合后的抗体终浓度为1ug/ml)及2.5ug/ml s-rbd-biotin蛋白孵育20min。离心弃上清，加入稀释的sa-pe抗体，4℃孵育20min。再次离心弃上清，每孔加入200ul pbs重悬细胞，流式细胞仪检测样本pe信号。
[0258]
结果如图9所示，部分候选抗体组合后具有更好的阻断活性。
[0259]
实施例11：抗体雾化前后纯度鉴定
[0260]
选取抗体nb11-59、nb16-68配置为10mg/ml，使其置于ph7.5的10mm tris缓冲液中，同时添加0.05％吐温80。吸取3ml抗体置于飞利浦inspire go雾化器中，开启雾化器雾化，同时用50ml离心管收集雾化后的液体。取雾化后液体样品进行hplc-sec检测。
[0261]
检测结果统计如下表5所示。
[0262]
表5纳米抗体雾化前后sec结果
[0263][0264]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0265]
本发明序列信息如下所示
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