一种甲壳素/壳聚糖基止血材料的制备方法

本发明涉及天然高分子材料及生物医用材料领域，具体涉及一种甲壳素/壳聚糖基止血材料的制备方法。

背景技术：

1、甲壳素是自然界中含量仅次于纤维素的天然多糖，广泛存在于虾蟹等甲壳动物、各类昆虫的表皮及鱿鱼等软体动物中。和纤维素类似，甲壳素也有良好的生物相容性，可以制成膜、微球、水凝胶等形式用于药物缓释、组织工程等领域，其分子链中的羟基能发生醚化、氧化、酯化反应而制备特异性功能的材料。分子链中氮元素的存在还能使甲壳素高温炭化后可得到氮掺杂的炭材料。但强氢键和半结晶结构使甲壳素难以溶于水和常见的有机溶剂，严重限制了甲壳素的实际应用。目前，溶解甲壳素的的离子液体体系存在严重的环境危害，而naoh-尿素体系需要冷冻-解冻循环数次，因此，寻找环保且高效的溶解体系对于制备甲壳素新材料至关重要。

2、壳聚糖是将甲壳素脱乙酰化得到的产物，其脱乙酰度通常大于50％，它不仅保留了甲壳素的生物学特性，其中的氨基让壳聚糖成为自然界中唯一的阳离子多糖，广泛用于染料吸附、生物医用等领域，已有研究表明，壳聚糖上带正电的氨基能与带负电的红细胞间形成强相互作用而使壳聚糖能富集血液中的的红细胞，成为良好的止血材料，且这种相互作用受壳聚糖脱乙酰度、分子量的影响(adv.healthcare mater.2020,2000951)。此外，氨基能与细菌细胞膜键接更紧密，这种相互作用能在细菌细胞周围形成不可渗透层并抑制重要溶质的运移，壳聚糖尤其是低分子量壳聚糖和壳聚糖低聚体还能入侵细菌细胞核，抑制rna和蛋白质合成，产生抗微生物性；酸性条件下氨基被质子化后能降低感染部位的ph产生镇痛效果，由于聚阳离子性，壳聚糖的镇痛性要优于甲壳素(international journal ofbiological macromolecules102(2017)380–383)。目前溶解壳聚糖多用酸体系，但低ph易造成皮肤组织坏死，还容易产生急性炎症反应如器官枯竭，醋酸体系中醋酸残留会有生物毒性，且成型后产品的脆性对深伤口出血或腔内出血止血效果不理想。

3、意外事故或军事战争中的大出血不仅会影响机体氧气和营养物质的运输，导致昏迷休克、伤口感染，严重者还会面临死亡的风险，因此开发安全高效的止血材料，不仅能提高院前急救重伤者的存活率，对于身体内的非控制性出血也非常有必要。目前的止血材料主要分为天然高分子材料如氧化纤维素、海藻酸钠、壳聚糖、明胶，无机材料如沸石、介孔硅，合成高分子如聚丙烯酸类、聚酰胺类等，医疗领域常用止血材料的形式包括水凝胶、膜、海绵、纳米颗粒等。根据作用机理，目前止血材料的止血机制主要有三种，如多孔沸石类材料的吸液富集作用，吸水树脂膨胀后对伤口的封闭作用、带电材料对凝血系统的刺激作用。尽管在材料的应用和作用机理方面已有较多研究，且hemcon、combat等材料使用已较为成熟，美国revmedx公司研发的xstat是由纤维素和壳聚糖制成的微型棉药，能在数秒内处理好致命枪伤，但这些材料不可避免地存在使用风险，如沸石的热效应造成的组织热凝固能促进凝血，但也会引起机体发热或异物反应，胶原蛋白类材料过度溶胀会压迫神经系统，多糖类止血材料只在轻度出血创面的应用中效果显著，且缺少科学系统的止血实验评估；此外，目前关于快速止血产品研究还较少，市售的止血纱布止血功效较为单一，而粉末或微球止血产品在处理伤口时不仅需要较大用量，还难以清理完全，具有流入血液造成血栓的风险，因此如何使患者创口高效、快速、安全止血也是亟待解决的难题。

4、三维多孔材料是一类以空气为介质，质轻、高孔隙度、高比表面积的材料，近年来以其独特的结构和优异的理化性质在隔热(sci.adv.2018；4:eaas8925)、吸附(acs nano2018,12,5,4462–4468)、电学(natl sci rev,2019,vol.6,no.2)、航空航天、生命科学等多种领域展现巨大潜力。多孔材料的制备中最重要的是除去溶剂的过程，即干燥过程，因为多孔材料在干燥过程中孔内和孔壁上产生的毛细管力会强烈影响凝胶的网络结构，造成骨架收缩甚至坍塌，进而影响多孔材料的最终形态。常用的干燥方式有室温干燥、超临界干燥和冷冻干燥，其中冷冻干燥以经济简易、安全高效的操作而广受青睐。但是大尺寸的水凝胶在冷冻干燥过程中往往由于形成冰晶时体积膨胀导致水凝胶内部结构被破坏，干燥后易出现破裂、收缩甚至整个结构完全坍塌的现象。

5、如何制备安全高效的多功能止血材料一直是研究的重点，而多孔材料有着天然的吸液优势，但如何保证干燥过程中孔结构的完整性也是需要解决的难题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种甲壳素/壳聚糖基止血材料的制备方法，通过低温冷冻在化学交联的碱凝胶中预先形成大孔，不仅能最大程度减少对材料力学性能的影响，大孔还能减少干燥过程中的毛细管力，并将蜂窝结构保留在多孔材料中，有利于后续快速吸液过程。

2、本发明实现目的所采用的方案是：一种甲壳素/壳聚糖基止血材料的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)采用质量分数为20wt％以上的碱水溶液在60-170℃的条件下处理甲壳素，通过控制脱乙酰度，得到脱乙酰度为不超过50％的甲壳素与碱水溶液的混合物或脱乙酰度为高于50％的壳聚糖与碱水溶液的混合物；

4、(2)当步骤(1)中得到脱乙酰度为不超过50％的甲壳素与碱水溶液的混合物时，将混合物温度降为不超过30℃，并将碱水溶液调整为碱浓度为5wt％～30wt％，加入稳定剂，得到甲壳素溶液；当步骤(1)中得到脱乙酰度为高于50％的壳聚糖与碱水溶液的混合物时，将混合物温度降为不超过30℃，并将碱水溶液调整为碱浓度为2wt％～30wt％，加入稳定剂，得到壳聚糖溶液；

5、(3)向步骤(2)得到的甲壳素溶液或壳聚糖溶液中加入交联剂并持续搅拌，离心脱泡后，放置至形成部分化学交联的甲壳素碱凝胶或壳聚糖碱凝胶；

6、(4)将步骤(3)中得到的甲壳素碱凝胶或壳聚糖碱凝胶进行冷冻，解冻后将凝胶浸泡于非溶剂中再生，水洗后得到甲壳素水凝胶或壳聚糖水凝胶；

7、(5)将步骤(4)中得到的甲壳素水凝胶或壳聚糖水凝胶除去液体，即得到甲壳素基止血材料或壳聚糖基止血材料。

8、优选地，所述步骤(1)中，采用的碱为氢氧化钾或氢氧化钠。其中甲壳素与碱水溶液的质量比为1：(10-20)。

9、优选地，所述步骤(2)中，甲壳素溶液或壳聚糖溶液的中甲壳素或壳聚糖的浓度均为1wt％～10wt％。

10、优选地，所述步骤(2)中，稳定剂为尿素、硫脲、聚乙烯醇中的一种或多种，甲壳素溶液或壳聚糖溶液中稳定剂的浓度为0～20wt％。

11、优选地，所述步骤(2)中，调整混合物中碱浓度的方法为以下方法中的任意一种：a、向步骤(1)所得混合物中加入水稀释使碱的浓度降低；b、将步骤(1)中的混合物经过过滤、水洗、干燥后加入到目标浓度的碱的水溶液中，使碱的浓度降低；c、将步骤(1)中混合物的碱浓度调整为20wt％～60wt％，并将混合液温度降低到不超过30℃放置一段时间，再加入冰块或冰水使碱浓度稀释至5wt％～30wt％。

12、优选地，所述步骤(2)中，当步骤(1)中得到脱乙酰度为高于50％的壳聚糖与碱水溶液的混合物时，调整混合物中碱浓度的方法还包括以下方法中的任意一种：d、除去步骤(1)混合物中的碱水溶液，将所得固体成分由弱碱水溶液溶解得到壳聚糖溶液，所述弱碱为碳酸氢盐水溶液；e、除去步骤(1)混合物中的碱水溶液，将所得固体成分用稀酸水溶液溶解，再加入适量碱中和，搅拌得到壳聚糖溶液。

13、优选地，所述方法d中，弱碱水溶液为单一碳酸氢盐水溶液或多种碳酸氢盐水溶液的混合物，所述方法e中，稀酸为无机酸、有机酸中的一种或多种的混合物，所述稀酸水溶液的浓度为1wt％～4wt％，中和的碱为碱性氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵中的至少一种，所述方法d和e得到的壳聚糖溶液中，稳定剂的浓度为2wt％～20wt％。

14、一般，采用方法d制备壳聚糖溶液时，壳聚糖溶液中碳酸氢盐的浓度为2wt％～10wt％，采用方法e制备壳聚糖溶液时，壳聚糖溶液中中和碱的浓度为2wt％～30wt％。

15、优选地，所述的稀酸为盐酸、硝酸、甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸中的一种或多种的混合物。

16、优选地，所述步骤(3)中，交联剂为环氧类化合物、缩水甘油醚类化合物、丙烯酸酯类化合物中的任意一种，交联剂与甲壳素或壳聚糖单体的摩尔比为0.1～5:1。

17、优选地，所述的交联剂为环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双酚a二缩水甘油醚聚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二丙烯酸中的一种或多种的混合物。

18、优选地，所述步骤(4)中，非溶剂为水、盐水溶液、可溶于水的低粘度有机液体中的任一种或多种的混合液体。

19、所述盐为含有一价阳离子、阴离子或二价阳离子、阴离子的盐；所述可溶于水的低黏度有机液体是醇类、酮类、酯类中的至少一种，所述酯类为甲酸甲酯、乙酸乙酯；所述醇类为甲醇、乙醇；所述酮类为丙酮。

20、优选地，还包括步骤(6)，将步骤(5)得到的甲壳素基多孔材料或壳聚糖基多孔材料进行压缩，将多孔材料压缩至初始高度的0～80％。干燥后的甲壳素基多孔材料或壳聚糖基多孔材料经过压缩后可通过自膨胀效应达到止血效果。

21、所述步骤(5)中，将甲壳素水凝胶或壳聚糖水凝胶除去液体的方式是二氧化碳超临界干燥或冷冻干燥，二氧化碳超临界干燥的具体步骤为先将步骤(4)中的甲壳素水凝胶或壳聚糖水凝胶用无水乙醇或丙酮完全置换，然后再超临界二氧化碳干燥；冷冻干燥的具体步骤为先将步骤(4)中的甲壳素水凝胶或壳聚糖水凝胶用浓度为0-80wt％的叔丁醇-水溶液置换后冷冻干燥。

22、优选地，在所述甲壳素基止血材料或壳聚糖基止血材料中加入活性成分，所述活性成分包括抗菌消炎成分或止血成分。

23、所述抗菌消炎成分包括富勒烯、氧化石墨烯、纳米金、纳米银、络合碘、甲硝唑、洁尔灭、抗生素；所述止血成分包括、凝血酶、白芨、三七等。

24、所述活性成分加入的方式为以下三种方式中的任意一种：a：将步骤(4)中的水凝胶在除去液体前先用含有活性成分的液体浸泡后再进行冷冻干燥；b：向步骤(5)中干燥后的止血材料喷洒含有活性成分的溶液后再进行冷冻干燥；c：将步骤(5)中干燥后的止血材料浸泡在含有活性成分的液体，然后再进行冷冻干燥。

25、本发明的制备方法，冷冻过程中，冰晶的生长会将碱凝胶中的溶质挤压富集到冰晶之间并诱发溶质相和溶剂相间发生相分离，完全冷冻后体系内会形成富溶剂相和富溶质相，解冻后原本冰晶生长的区域会形成孔道并被液体填充，溶质会局部紧密堆积形成孔壁，干燥过程中孔道内的液体逐渐被除去，由于预先在凝胶中形成了大孔结构，因此干燥时凝胶内部毛细管张力显著降低，并将多孔结构保留在最终的材料中，避免了网络骨架剧烈收缩而导致材料结构收缩甚至坍塌。另一方面，与物理交联相比，化学交联不仅会削弱高分子链间的氢键和疏水相互作用并将高分子结晶区溶胀，增大孔径并提高碱凝胶在冷冻解冻过程中的稳定性，避免碱凝胶在解冻后又回到溶液状态；柔性的化学网络还赋予了材料自膨胀性，使材料在压缩后能快速吸液并回弹并保持稳定的湿弹性；而再生过程形成的物理交联结构保证了材料良好的机械性能，保证材料在使用过程中的结构完整性。

26、本发明具有以下优点和有益效果：

27、(1)本发明中所使用的甲壳素原料来源广泛，属于可降解的天然高分子材料，与人体有良好的生物相容性。这些天然材料的使用还能解决海洋废弃物的污染问题。

28、(2)本发明所使用的溶剂体系绿色环保，能高效均匀溶解不同脱乙酰度的甲壳素/壳聚糖且形成的溶液性质稳定，碱性体系还能避免酸性条件下壳聚糖的快速降解。

29、(3)本发明的制备方法制备的止血材料将多孔结构与天然高分子的生物学特性结合，保留了多孔材料轻质多孔的结构特点和天然高分子材料的生物相容性，并借助柔性的化学网络赋予材料自膨胀的特性和优异的机械性能，并具有良好的亲水性，让材料同时具备三种止血机制，能保证在吸液时的结构完整性，避免材料在止血过程中被血流冲散而造成栓塞的风险，因而有效地扩展了多孔材料和可再生资源的应用范围。

30、(4)本发明的制备方法制备的止血材料利用多孔结构快速吸液并富集血液成分，其中甲壳素/壳聚糖分子链上的氨基还能通过电荷相互作用促进凝血，而压缩后的自膨胀吸液过程能起到堵塞伤口的作用，并保证材料能制成多种形式而匹配不规则形状的伤口，展现甲壳素/壳聚糖在生物医用材料领域的应用。

31、(5)本发明所制备的止血材料不仅有多重止血功效，与活性成分复合后各组分的性能并不受影响，而复合材料的止血效果能进一步提升。