一种新型DCLK1抑制剂及其制备方法和应用

一种新型dclk1抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种新型dclk1抑制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.急性肺损伤(acute lung injury，ali)是一种由于多种致伤因素导致的肺泡上皮细胞及血管内皮细胞损伤的急性炎症反应。其病理特征是肺部有大量中性粒细胞聚集，同时伴有趋化因子(如cxcl-8，ena-78)、促炎细胞因子(如il-6，tnf-α)、急性期感应物(如crp、lipocalin)、基质重塑酶(如mmp-9)等炎症反应物的释放。严重的中性粒细胞炎症通常会损害肺泡-毛细管屏障，从而导致非心源性肺水肿以及通气/血流比例失调。ali临床表现为严重的呼吸困难、呼吸急促以及耐药性低氧血症。当ali发展至严重阶段，极有可能发展成急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ards)。
3.脓毒症(sepsis)是由于宿主对感染的反应失调而引起的一种复杂疾病，并伴有急性器官功能障碍，其发病率和死亡率都极高。身体任何一部分的感染都有可能引起脓毒症，临床上最常见于的感染部位是肺部，其次是腹部、血液、肾脏和泌尿生殖道。脓毒症的特征是宿主对感染的全身反应失调，当高度保守的微生物病原体被固有免疫系统细胞上的识别受体识别后，机体会激活nf-κb并释放大量中性粒细胞，并导致促炎和抗炎介质如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，tnf-α)、细胞白介素1(interleukin-1，il-1)、il-2、il-6等的极速增加。
4.急性肺损伤和脓毒症都属于急性炎症的范畴，其共同点是都可在机体局部或者整体上发生炎症反应。脓毒症会引起血管内皮通透性增加，导致血管内液流失过多，血管血压降低，进而导致组织水肿，严重损害器官功能，有可能进一步发展成急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征。然而，临床上针对急性肺损伤和脓毒症的治疗通常是利用抗生素和糖皮质激素等控制感染，而它们都存在副作用大、愈后差等缺陷。虽然在临床上有新的治疗方法不断出现，如通过抑制炎症因子减轻炎症反应、通过改善氧合来纠正缺氧以及促进肺内液体的吸收等，但是因为疗效不佳和成本较高等原因无法得到推广，因此，寻找新的治疗靶点并设计相关小分子抑制剂对于急性炎症的治疗尤为必要。
5.当前，有关小分子抑制剂在炎症调控中的应用已经广泛报道，如trichostatin(tsa)，一种常见的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，hdac)抑制剂，可通过抑制nf-κb的激活来减少由脂多糖(lipopolysaccharid，lps)诱导的tnf-α的释放；tasaka s等人报道了rock参与由盲肠结扎穿刺(cecal ligation-peferation，clp)引起的脓毒症和lps诱导的肺部炎症后血管通透性的调节，对大鼠预先给药rock抑制剂y-27632后，化脓性肺的湿干比例增加趋势被逆转；gorovoy m和yu y等人发现rock下游通路中lim激酶1和肌球蛋白轻链激酶(mlck)均参与了lps诱导的炎症反应。
6.目前已报道的可引发炎症的信号通路有多种，常见的有nf-κb通路(图8)、mapk通路、tlr通路以及jak-stat通路等，其中nf-κb通路最为经典。课题组前期的研究发现双肾上
腺皮质素样激酶1(doublecortin-like kinase 1，dclk1)对炎症因子的响应值超高，认为其有可能成为炎症调控通路中一个潜在的靶点，并对其进行了一系列通路验证和抑制剂优化的研究。
7.dclk1是一种具有c末端的丝氨酸/苏氨酸结构域的微管相关蛋白，最初的研究表明它是与微管聚合和神经元迁移密切关联的关键调节因子。它是公认的15种最常见的胃癌驱动基因之一，并在人类其他各种肿瘤中高度突变，已被确定为结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、肾透明细胞癌等多种癌症的肿瘤干细胞标志物。目前已报道dclk1可参与多种细胞通路的调节，如通过pi3k/akt途径上调sp1的表达、通过激活nf-κb通路促进emt表达。gray等人发现了一种富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，lrrk2)抑制剂lrrk2-in-1，该化合物与lrrk2的kd值为20nm，而nathaniel weygant课题组发现与lrrk2相比，该化合物对dclk1表现出具有相对选择性的亲和力(kd＝5nm)。目前，已有研究表明化合物lrrk2-in-1对胰腺癌、结肠癌均有较好的体内外抗肿瘤活性，然而其在抗急性炎症方面的研究尚未报道。另外，也有文献报道与lrrk2-in-1结构类似的一种bmk1/erk5抑制剂xmd8-92、一种选择性的alk抑制剂nvp-tae684对dclk1也具有一定的抑制活性，但只有lrrk2-in-1对dclk1表现出最好的抑制活性。
8.关于本发明的新型dclk1抑制剂，目前还未见报道。


技术实现要素：

9.本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，克服现有药物治疗的缺陷，提供一种新型dclk1抑制剂。
10.本发明的第二个目的是，提供一种上述新型dclk1抑制剂的制备方法。
11.本发明的第三个目的是，提供一种上述新型dclk1抑制剂的用途。
12.本发明的第四个目的是，针对现有技术的不足，提供一种药物组合物。
13.为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
14.一种新型dclk1抑制剂，所述的新型dclk1抑制剂为通式(i)的化合物或它们药学上可接受的盐：
[0015][0016]
其中，x为以下基团之一，
[0017][0018]
r1为以下基团之一，
[0019][0020]
r2和r3可分别为甲基、乙基、丙基、环戊烷基、环丁烷基、环丙烷基、三氟甲基、三氟乙基、三氟丙基、哌嗪基、哌啶基、杂环基团或氢原子等，
[0021]
y为各种卤素和甲基、乙基取代的苯环、六元杂环、五元杂环，其中杂环为：哌嗪、吡咯、吡唑、呋喃、噻吩、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、吡啶、嘧啶、吡嗪或哒嗪。
[0022]
作为本发明的优选技术方案，所述新型dclk1抑制剂为：
[0023]
1)2-((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0024]
2)2-((2-甲氧基-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0025]
3)2-((2-甲氧基-4-(4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基并[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0026]
4)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-n-异戊基-3-甲氧基苯甲酰胺；
[0027]
5)1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-甲醛；
[0028]
6)2-((2-甲氧基-4-(哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0029]
7)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(哌啶-4-基)苯甲酰胺；
[0030]
8)2-((4-(4-氨基哌啶-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0031]
9)2-((4-(3-氨基吡咯烷-1-羰基-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0032]
10)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(哌啶-3-基)苯甲酰胺；
[0033]
11)2-((4-(3-氨基哌啶-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0034]
12)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(吡咯烷基-3-基)苯甲酰胺；
[0035]
13)2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺[4.4]壬烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0036]
14)2-((2-甲氧基-4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0037]
15)2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0038]
16)2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺并[3.5]壬烷-7-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0039]
17)2-((2-甲氧基-4-(2,6-二氮杂螺并[3.3]庚烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0040]
18)n-(4-氨基丁基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺；
[0041]
19)2-((2-甲氧基-4-(3-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0042]
20)2-((2-甲氧基-4-(4-丙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0043]
21)2-((4-(4-丙烯酰基哌嗪-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮；
[0044]
22)n-(1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙酰胺；
[0045]
23)n-(1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙烯酰胺；
[0046]
24)n-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺；
[0047]
25)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-4-基)苯甲酰胺；
[0048]
26)n-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺；
[0049]
27)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-3-基)苯甲酰胺；
[0050]
或
[0051]
28)2-((2-甲氧基-4-(4-丙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮。
[0052]
作为本发明的优选技术方案，所述药学上可接受的盐为通式(i)的化合物与下列酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、乳酸、柠檬酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、酒石酸、丙酮酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸。
[0053]
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0054]
如上所述的新型dclk1抑制剂的制备方法，制备方法如下：
[0055]
a.化合物i溶于1,4-dioxane中，在dipea作用下与化合物ii反应得到化合物iii；
[0056]
b.化合物iii与铁粉溶于醋酸中，在60℃加热条件下反应得到化合物iv；
[0057]
c.化合物iv与r3在nah的作用下，在室温条件下反应得到化合物v；
[0058]
d.化合物v与x-r1溶于1,4-dioxane中，在x-phos、pd2(dba)3、k2co3作用下回流反
[0059]
应得到所述的新型dclk1抑制剂。
[0060]
化合物i:
[0061][0062]
化合物ii:
[0063][0064]
化合物iii:
[0065][0066]
化合物iv:
[0067][0068]
化合物v:
[0069][0070]
其中dipea为n,n-二异丙基乙胺，x-phos为二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯。
[0071]
化合物x、y、r1、r2、r3可通过商业渠道购买。
[0072]
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0073]
如上任一所述所述的新型dclk1抑制剂在制备新型dclk1抑制剂中的应用。
[0074]
如上任一所述所述的新型dclk1抑制剂在制备治疗炎症或与dclk1表达有关的肿瘤的药物中的应用。
[0075]
优选地，所述与dclk1表达有关的肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、肾癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、骨髓增生异常综合症、淋巴瘤、食管癌、胃肠道癌、骨肉瘤、中枢或外周神经系统的肿瘤；所述与dclk1表达有关的炎症为脓毒症、败血症、急性肺损伤或各种糖尿病并发症等。
[0076]
本发明优点在于：
[0077]
1、本发明的化合物表现出良好的dclk1酶抑制活性，通过抑制dclk1蛋白，实现对炎症及肿瘤的抑制，能够明显的延缓急性炎症的发生发展，可以应用于各种急慢性炎症。
[0078]
2、首次报道dclk1与炎症的关系，首次发现该类化合物对炎症的治疗效果。
[0079]
3、该类化合物作为首次报道的dclk1抑制剂，具有进一步的开发和研究价值。
附图说明
[0080]
图1是dclk1抑制剂对正常细胞的毒性测试；
[0081]
图2是dclk1抑制剂对细胞水平炎症因子的影响；
[0082]
图3是高活性dclk1抑制剂对炎症因子剂量依赖性的影响；
[0083]
图4是高活性dclk1抑制剂对nf-κb通路中相关蛋白的作用；
[0084]
图5是高活性dclk1抑制剂对急性肺损伤模型小鼠肺部病理学的改善；
[0085]
图6是高活性dclk1抑制剂对急性肺损伤模型小鼠的治疗作用；
[0086]
图7是高活性dclk1抑制剂对脓毒症模型小鼠的治疗效果；
[0087]
图8是引发炎症的nf-κb通路。
具体实施方式
[0088]
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0089]
以下实施例所涉化合物的1h nmr，
13
c nmr和ms数据详见表1。表1中序号1-28为化合物编号，不仅一一对应于表1中的序号，同时也对应下面的实施例1-28制备的具体化合物。附图中化合物8a-8z以及8aa、8ab分别对应化合物1-26以及27、28。
[0090]
表1优选化合物1h nmr，
13
cnmr和ms数据
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100][0101]
实施例1 2-((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0102]
步骤a.2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯甲酸甲酯的合成：
[0103]
将2-(甲基氨基)苯甲酸甲酯(1g，6.1mmol)和2,4-二氯-5-硝基嘧啶(1.4g，7.3mmol)溶于1,4-二氧六环(50ml)中，搅拌下缓慢滴加dipea(1.6g，12.4mmol)，在50℃条件下搅拌5h以上。待反应完全后，将反应液减压浓缩得到粗产品，然后经硅胶柱层析(hexane:etoac＝15:1-10:1)分离纯化得到黄色固体1.6g，收率：82％。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ:8.72(s,1h),7.93(dd,j＝8.3,1.6hz,1h),7.65-7.76(m,1h),7.46-7.59(m,2h),4.03-4.26(m,2h),3.47(s,3h),1.19(t,j＝7.1hz,3h)。
[0104]
步骤b.2-氯-11-甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成：
[0105]
将2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯甲酸甲酯(1g，3.1mmol)溶于20ml醋酸中，搅拌下依次加入铁粉(0.87g，15.5mmol)，dipea(0.8g，6.2mmol)，60℃下搅拌过夜。tlc检测反应完全后，过滤剩余的铁粉，将滤液加入500ml冰水中，有大量白色固体析出，抽滤，滤饼于50℃条件下烘干，无需纯化直接进行下一步反应。得到白色固体0.7g，收率：93％。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ:10.48(s,1h),8.15(s,1h),7.72(d,j＝7.5hz,1h),7.59(t,j＝7.5hz,1h),7.28(d,j＝8.0hz,1h),7.22(t,j＝7.5hz,1h),3.34(s,3h)。
[0106]
步骤c.2-氯-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成：
[0107]
将2-氯-11-甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(1.0g，3.8mmol)溶于干燥dmf(20ml)中，-10℃条件下分批加入nah(120mg，4.7mmol)，反应0.5h后，再缓慢滴加碘甲烷(660mg，4.7mmol)，然后将反应转移至室温条件下继续搅拌4h。待原料完全反应后，将反应液倒入冰水(400ml)中，搅拌5min，有大量白色固体析出，抽滤，滤饼于50℃烘干至恒重，无需进一步纯化。得到白色固体0.8g，收率80％。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ:8.60(s,1h),7.71(dd,j＝7.8,1.5hz,1h),7.51-7.62(m,1h),7.29(d,j＝8.3hz,1h),7.22(t,j＝7.7hz,1h),3.42(s,3h),3.34(s,3h)。
[0108]
步骤d.2-((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成：
[0109]
2-氯-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(1.0g，3.6mmol)，(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(1.1g，4.3mmol)，x-phos(154mg，0.32mmol)，pd2(dba)3(293mg，0.32mmol)，k2co3(1.5g，10.8mmol)充分溶于干燥的1,4-二氧六环(20ml)中，105℃回流5h以上，注意操作过程中尽可能少暴露在空气和潮湿环境中。tlc检测反应结束后，用硅藻土将反应液中的固体过滤出来，将反应液减压蒸馏，得到的粗产品经硅胶柱层析(hexane/etoac＝2/1-1/1)分离纯化得到白色固体0.6g，收率：35％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ:8.47(d,j＝7.9hz,1h),8.1(s,1h),7.82(d,j＝7.8hz,1h),7.76(s,1h),7.40(t,j＝8.1hz,1h),7.11(t,j＝8.42hz,1h),7.06(d,j＝8.3hz,1h),6.98-7.03(m,2h),3.91(s,3h),3.59-3.76(m,4h),3.47(s,3h),3.40(s,3h),2.38-2.49(m,4h),2.32(s,3h)；hrms(esi,positive)m/z calcd for c
26h30
n7o3[m+h]
+
:488.2405；found 488.2413.
[0110]
实施例2 2-((2-甲氧基-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0111]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(吗啉)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物2)。
[0112]
实施例3 2-((2-甲氧基-4-(4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基并[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0113]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基并[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物3)。
[0114]
实施例4 4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-n-异戊基-3-甲氧基苯甲酰胺的合成
[0115]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为4-氨基-n-异戊基-3-甲氧基苯甲酰胺，得到白色固体化合物，即为4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-n-异戊基-3-甲氧基苯甲酰胺(化合物4)。
[0116]
实施例5 1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b]
[1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-甲醛的合成
[0117]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为1-(4-氨基-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-甲醛，得到白色固体化合物，即为1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-甲醛(化合物5)。
[0118]
实施例6 2-((2-甲氧基-4-(哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0119]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(哌嗪-1-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物6)。
[0120]
实施例7 4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(哌啶-4-基)苯甲酰胺的合成
[0121]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为4-氨基-3-甲氧基-n-(哌啶-4-基)苯甲酰胺，得到白色固体化合物，即为4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(哌啶-4-基)苯甲酰胺(化合物7)。
[0122]
实施例8 2-((4-(4-氨基哌啶-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0123]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-氨基哌啶-1-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((4-(4-氨基哌啶-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物8)。
[0124]
实施例9 2-((4-(3-氨基吡咯烷-1-羰基-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0125]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(3-氨基吡咯烷-1-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((4-(3-氨基吡咯烷-1-羰基-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物9)。
[0126]
实施例10 4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(哌啶-3-基)苯甲酰胺的合成
[0127]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(四氢嘧啶-1(2h)-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(哌啶-3-基)苯甲酰胺(化合物10)。
[0128]
实施例11 2-((4-(3-氨基哌啶-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0129]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(3-氨基哌啶-1-基)甲酮，得到白色固体化
合物，即为2-((4-(3-氨基哌啶-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物11)。
[0130]
实施例12 4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(吡咯烷基-3-基)苯甲酰胺的合成
[0131]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为4-氨基-3-甲氧基-n-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺，得到白色固体化合物，即为4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(吡咯烷基-3-基)苯甲酰胺(化合物12)。
[0132]
实施例13 2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺[4.4]壬烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0133]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(2,7-二氮杂螺[4.4]壬-2-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为13 2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺[4.4]壬烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物13)。
[0134]
实施例14 2-((2-甲氧基-4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0135]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物14)。
[0136]
实施例15 2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0137]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(2,7-二氮杂螺[3.5]壬-2-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物15)。
[0138]
实施例16 2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺并[3.5]壬烷-7-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0139]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(2,7-二氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(2,7-二氮杂螺并[3.5]壬烷-7-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物16)。
[0140]
实施例17 2-((2-甲氧基-4-(2,6-二氮杂螺并[3.3]庚烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0141]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(2,6-二氮杂螺并[3.3]庚烷-2-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物17)。
[0142]
实施例18 n-(4-氨基丁基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧
啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺的合成
[0143]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为4-氨基-n-(4-氨基丁基)-3-甲氧基苯甲酰胺，得到白色固体化合物，即为n-(4-氨基丁基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(化合物18)。
[0144]
实施例19 2-((2-甲氧基-4-(3-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0145]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为(4-氨基-3-甲氧基苯基)(3-甲基哌嗪-1-基)甲酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物19)。
[0146]
实施例20 2-((2-甲氧基-4-(4-丙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0147]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为1-(4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)丙-1-酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(4-丙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物20)。
[0148]
实施例21 2-((4-(4-丙烯酰基哌嗪-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0149]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为1-(4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮，得到白色固体化合物，即为2-((4-(4-丙烯酰基哌嗪-1-羰基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物21)。
[0150]
实施例22 n-(1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙酰胺的合成
[0151]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为n-(1-(4-氨基-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙酰胺，得到白色固体化合物，即为n-(1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙酰胺(化合物22)。
[0152]
实施例23 n-(1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙烯酰胺的合成
[0153]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为n-(1-(4-氨基-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙烯酰胺，得到白色固体化合物，即为n-(1-(4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰基)哌啶-4-基)丙烯酰胺(化合物23)。
[0154]
实施例24 n-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺的合成
[0155]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为n-(1-丙烯酰哌啶-4-基)-4-氨基-3-甲氧基苯甲酰胺，得到白色固
体化合物，即为n-(1-丙烯酰基哌啶-4-基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(化合物24)。
[0156]
实施例25 4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-4-基)苯甲酰胺的合成
[0157]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为4-氨基-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-4-基)苯甲酰胺，得到白色固体化合物，即为4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-4-基)苯甲酰胺(化合物25)。
[0158]
实施例26 n-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺的合成
[0159]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为n-(1-丙烯酰哌啶-3-基)-4-氨基-3-甲氧基苯甲酰胺，得到白色固体化合物，即为n-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(化合物26)。
[0160]
实施例27 4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-3-基)苯甲酰胺的合成
[0161]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为4-氨基-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-3-基)苯甲酰胺，得到白色固体化合物，即为4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[e]嘧啶基[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(1-丙酰基哌啶-3-基)苯甲酰胺(化合物27)。
[0162]
实施例28 2-((2-甲氧基-4-(4-丙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮的合成
[0163]
参考实施例1的合成方法，将实施例1中的中间体(4-氨基-3-甲氧基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮替换为1-(4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)丙-1-酮，得到白色固体化合物，即为2-((2-甲氧基-4-(4-丙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,11-二甲基-5,11-二氢-6h-苯并[e]嘧啶[5,4-b][1,4]二氮杂-6-酮(化合物28)。
[0164]
实施例29本发明化合物对dclk1激酶抑制活性的测试
[0165]
步骤a：配制1
×
kinase buffer；
[0166]
步骤b：向384孔板中加入100倍终浓度的化合物250nl；
[0167]
步骤c：用1
×
kinase buffer配制2.5倍终浓度的激酶溶液，在化合物孔和阳性对照孔中分别加2.5倍终浓度的激酶溶液10μl，在阴性对照孔中入1
×
kinase buffer 10μl；
[0168]
步骤d：反应板振荡混匀后，于20℃条件下孵育10min；
[0169]
步骤e：用1
×
kinase buffer配制5/3倍终浓度的atp和kinase substrate的混合溶液，向每孔中加入混合溶液(15μl)，起始反应；
[0170]
步骤f：将384孔板振荡混匀后室温孵育60min；
[0171]
步骤g：加入终止检测液(30μl)停止激酶反应，振荡混匀；
[0172]
步骤h：用caliper ez reader读取转化率。
[0173]
计算公式：
[0174][0175]
其中：conversion％
sample
是样品的转化率读数；conversion％
min
：阴性对照孔均值，代表不含酶的转化率读数；conversion％
max
：阳性对照孔比值均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。
[0176]
拟合量效曲线：以浓度的log值作为x轴，百分比抑制率为y轴，采用分析软件graphpad prism 5的log(inhibitor)vs.response
–
variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的ic
50
值。
[0177]
计算公式：y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((logic
50-x)*hillslope))
[0178]
实验结果：本发明化合物的ic
50
值如表2所示，测试化合物表现出中等到优秀的抑制活性。
[0179]
表2目标化合物对dclk1的抑制活性(单位nmol/l)
[0180][0181]
实施例30本发明化合物的体外抗炎活性测试
[0182]
步骤a：icr小鼠腹腔巨噬细胞提取和培养
[0183]
实验前3天对每只小鼠每天注射5％肉汤(巯基乙醇酸钠)(2ml)，可获得较多的腹腔巨噬细胞。细胞提取按照以下步骤：
[0184]
a)将小鼠处死，在75％乙醇中浸泡2-3min，转移至超净台。仰卧固定在解剖板上，再用乙醇擦拭腹部皮肤，用手术剪剪开腹部皮肤，暴露腹肌层(注意不要破坏腹肌层)，再用乙醇消毒腹部肌层；
[0185]
b)用5ml注射器抽取含1％双抗的rpmi1640培养基(5ml)注入腹腔，前后左右轻晃小鼠身体，再用注射器抽取细胞悬液，转移至离心管。再重复三次；
[0186]
c)将收集的细胞悬液以1
×
103rpm离心5min后，弃去上清液，用含双抗的rpmi1640培养基(10ml)吹打细胞，在1
×
103rpm条件下离心5min；
[0187]
d)用含10％胎牛血清和1％双抗的rpmi1640培养基(5ml)吹打均匀，取细胞悬液(10μl)再稀释10倍至100μl，置于细胞计数板上计数；
[0188]
e)计算实验所需细胞数，将细胞悬液稀释后直接转移至96孔板或6孔板中，于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中孵育12h后可进行实验。
[0189]
步骤b：酶联免疫测试法(elisa)检测炎症因子含量
[0190]
在6孔板中每孔加入浓度为8
×
104个/ml的细胞悬液2ml，在37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中孵育12h后，将培养基吸出，加入已配好的化合物2ml。再孵育1h后，加入1μl 0.5mg/ml的lps溶液，继续孵育72h。elisa法检测炎症因子tnf-α和il-6可参照elisa试剂盒说明书上的方法进行，主要步骤如下。
[0191]
a)标准品配制：用标准品稀释液将标准品按照最大浓度为2000pg/ml的浓度2倍稀释为8个浓度；
[0192]
b)每个孔中分别加入配制好的各个浓度的标准品和待测样品100μl，于37℃条件下孵育1h；
[0193]
c)吸除孔内液体，除空白外每孔加入检测抗体100μl，37℃孵育1h；
[0194]
d)吸除孔内液体，在每孔中加入洗涤液(洗涤液以双蒸水稀释25倍使用，200μl)静置2min，吸除，重复3次后晾干；
[0195]
e)除空白外，向每个孔中加入酶标试剂100μl，37℃孵育60min；
[0196]
f)吸除孔内液体，在每孔中加入洗涤液200μl静置2min，吸除，重复3次后晾干；
[0197]
g)向每孔分别加入显色剂a和b各90μl，混匀，置于37℃避光孵育15min后加入终止液50μl终止反应；
[0198]
h)立即使用酶标仪检测，读取波长为450nm条件下每个孔的od值。用elisacalc软件，计算出所测炎症因子的浓度。
[0199]
结果显示(图2)，大部分化合物(如化合物8b、8h、8k、8n、8p、8t、8u、8v、8w、8x)对于两种炎症因子的释放具有较好的抑制效果，尤其对tnf-α的抑制作用更佳，显著优于先导化合物lrrk2-in-1(p《0.01)。
[0200]
实施例31本发明dclk1抑制剂对正常细胞的毒性
[0201]
步骤a：将新鲜提取的小鼠原代巨噬细胞按照浓度为8
×
104个/ml加入96孔板中(100μl)，置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中孵育12h；
[0202]
步骤b：吸出培养基，每孔加入预先配好的不同浓度的化合物100μl，继续孵育72h；
[0203]
步骤c：弃去96孔板中的培养基，每孔加入浓度为5mg/ml的mtt溶液20μl，继续在37℃条件下孵育4h，每个孔加入溶解液100μl，在酶标仪中震荡10min左右，读取波长为490nm或570nm条件下的od值。用graphpad prism 7软件拟合出ic
50
。
[0204]
实验结果：本发明化合物对正常小鼠腹腔巨噬细胞的毒性影响(图1)。
[0205]
实施例32本发明化合物的急性肺损伤实验
[0206]
步骤a：小鼠分组及ali模型建立
[0207]
a)lps溶液的制备：精密称取40mg的lps溶于10ml生理盐水中，使用前充分震荡使完全溶解；
[0208]
b)icr小鼠麻醉：按照100μl/g的剂量给小鼠腹腔注射5％水合氯醛，待小鼠稍微麻醉后将其固定，经口插入静脉留置针；
[0209]
c)每只小鼠滴注lps溶液50μl，滴完打入0.2ml的空气使lps完全打入气管；
[0210]
分组：随机分为以下6组(每组10只)：
①
control组：经气管导管滴入生理盐水50μl，2h后对其尾静脉注射生理盐水0.1ml；
②
lps组：经气管导管滴入lps溶液50μl，2h后对其尾静脉注射生理盐水0.1ml；
③
阳性对照组：经气管导管滴入lps溶液50μl，2h后按照5mg/kg的剂量对其尾静脉注射阳性药。
[0211]
步骤b：肺泡灌洗液(balf)总细胞和中心粒细胞计数
[0212]
a)按照100μl/g的剂量给小鼠腹腔注射5％水合氯醛，待小鼠稍微麻醉后将其固定，经口插入静脉留置针；
[0213]
b)沿小鼠腹腔正中线剪开皮毛，剪断下腔静脉处死小鼠，剪开左右肋骨和胸膜，充分暴露肺和心脏；
[0214]
c)小心分离出气管，插入静脉留置针，用细线在右肺门处结扎；
[0215]
d)将静脉留置针连接至注射器，将预冷的pbs注入左肺中，每次0.5ml，重复3次(每次至少回收80％以上灌洗液)；
[0216]
e)将收集的肺泡灌洗液置于4℃离心机中，1
×
103rpm的转速离心10min；
[0217]
f)收集上清液并分装至1.5ml的离心管中并保存于-80℃冰箱中待测；
[0218]
g)加入pbs 1ml于沉淀物中并充分吹匀，取混匀后的细胞悬液100μl滴入计数板中，显微镜下计数总细胞数；
[0219]
h)另取重悬细胞团液滴入细胞甩片机中进行涂片，甲醇固定，瑞士-吉姆萨染色，显微镜下记下连续200个细胞中中性粒细胞的个数。
[0220]
步骤c：肺泡灌洗液总蛋白浓度测定
[0221]
a)取出冻存的肺泡灌洗液，充分溶解后涡旋使混匀；
[0222]
b)将蛋白质标准品用pbs稀释成0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml八个浓度；
[0223]
c)向每个孔中分别加入蛋白标准品和待测样品20μl，然后按照工作液a:b＝50:1的比例，每个孔中加入200μl工作液；
[0224]
在37℃振板5min，再孵育25min，570nm下检测每个孔的od值。
[0225]
步骤d：肺湿/干比(w/d)测定
[0226]
将小鼠右肺上页分离出来，尽可能擦干其表面的血渍，用电子天平称重即得湿肺重量；称完后，将其置于直径为2cm的小皿中，50℃条件下烘至肺组织重量不再变化，再用电子天平称重即得干肺重量。计算肺湿/干比重。
[0227]
实验结果：在小鼠气管滴注lps 2h后，化合物8n和8v分别以5mg/kg和10mg/kg两种剂量进行尾静脉给药，24h后处死小鼠，观察其肺部病理学变化。结果显示，肺湿干比显著减
小(图5a)，与阳性药lrrk2-in-1效果相当；肺泡灌洗液的中性粒细胞数(图5b)、蛋白浓度(图5c)和总细胞数(图5d)在两个化合物两种剂量下均有减少，化合物8n的抗炎活性优于8v，明显优于阳性药lrrk2-in-1，与lps空白组相比具有显著性差异。此外，两个化合物在5mg/kg剂量下的抗炎活性均优于10mg/kg给药剂量，推测可能是由大剂量给药产生的毒性造成的，有待进一步实验证实。
[0228]
实施例33本发明化合物的脓毒症活性测试
[0229]
步骤：随机选取6-8周icr小鼠50只，随机分为以下5组，每组10只：
①
control组：经气管导管滴入生理盐水50μl，2h后对其尾静脉注射生理盐水0.1ml；
②
lps组：经气管导管滴入lps溶液50μl，2h后对其尾静脉注射生理盐水0.1ml；
③
阳性对照组：经气管导管滴入lps溶液50μl，2h后按照5mg/kg的剂量对其尾静脉注射阳性药lrrk2-in-1 0.1ml；
④
待测药物小剂量组：经气管导管滴入lps溶液50μl，2h后按照5mg/kg的剂量对其尾静脉注射待测化合物0.1ml；
⑤
待测药物大剂量组：经气管导管滴入lps溶液50μl，2h后按照10mg/kg的剂量对其尾静脉注射待测化合物0.1ml。
[0230]
造模前对小鼠禁食一晚上，自由饮水。记录每组老鼠的体重后给药，30min后按照15mg/kg的剂量腹腔注射lps溶液。每两天给药一次，观察10天小鼠的生存状态，记录其存活率。
[0231]
结果：化合物8n对小鼠ali的治疗效果要优于化合物8v，且小剂量下治疗效果更优。基于此，我们进一步设置三种剂量(2.5mg/kg，5mg/kg，10mg/kg)考察化合物8n对由lps诱导的脓毒症模型小鼠生存期的影响。结果显示(图7)，化合物8n在2.5mg/kg剂量下的抗炎活性与阳性药lrrk2-in-1在相当；在5mg/kg的剂量下，表现出最优治疗效果，显著优于lps空白组(p《0.01)，优于阳性药lrrk2-in-1；与小鼠ali模型相似，化合物8n在10mg/kg的剂量下，活性较差，推测可能是化合物8n的治疗窗口较窄造成的，有待于进一步考察。以上实验结果证明化合物8n可以提高脓毒症小鼠的生存期。
[0232]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。