基于微流控芯片-PCR技术检测布鲁氏菌的方法及系统与流程

基于微流控芯片-pcr技术检测布鲁氏菌的方法及系统
技术领域
1.本发明是关于一种检测布鲁氏菌的方法及系统，具体而言，是关于一种基于微流控芯片-pcr技术检测布鲁氏菌的方法及系统。


背景技术：

2.布鲁氏菌(brucella，亦称布鲁氏杆菌)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，其侵入机体会引起传染-变态反应性的人兽共患的传染病——布鲁氏菌病。布鲁氏菌病临床上以长期发热、多汗、乏力、关节疼痛、肝脾及淋巴结肿大为特点，人群易感。对病原及早、快速、准确地检测并确诊至关重要。检测出布鲁氏菌是诊断布鲁氏菌病的金标准，然而，由于布鲁氏菌培养营养要求高，生长缓慢，采用传统培养检测方法往往会延误诊断及早期治疗，故不能成为诊断布鲁氏菌病的主要方法。目前布鲁氏菌病的诊断以实验室检查为主，结合流行病史、临床表现、影像学手段等综合判断。
3.现有检测布鲁氏菌的常用技术均存在一定局限性，如血液培养技术耗时长、检出率低；虎红平板凝集、试管凝集特异性不高；补体结合试验敏感性低；传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)检测技术，血液中布鲁氏菌核酸提取过程繁琐，提取效率不高，稳定性不好；此外，封闭检测不能得到扩增片段的大小，提高灵敏性的同时污染风险也自然提高。虽然布鲁氏菌的检测技术已经有了很大的发展，但是，仍然没有一种单一的方法能在任何情况下进行快速、准确地诊断。
4.微流控芯片-pcr(microfluidic chip pcr，mc-pcr)技术可将样品制备、反应、分离、检测、扩增、分析等集成到一块几平方厘米的芯片上并自动完成，具有快速、高通量、低消耗，灵敏、特异等特点。微流控芯片-pcr技术已经成功应用于hpv、结核、肿瘤、呼吸道病毒、乙肝等疾病的检测。
5.然而，目前并没有基于mc-pcr技术的布鲁氏菌检测方法的应用报道。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供一种基于微流控芯片-pcr技术检测布鲁氏菌的方法。
7.本发明的另一目的在于提供一种基于微流控芯片-pcr技术检测布鲁氏菌的系统。
8.本发明的另一个目的在于提供一种实现所述检测方法的引物及探针组合物。
9.一方面，本发明提供了一种检测布鲁氏菌的方法，该方法包括对待测样本进行目的dna的提取、pcr扩增以及反向斑点杂交，其中：
10.目的dna的提取：采用nai磁珠法对待测样本进行目的dna的提取；
11.pcr扩增：以提取获得的dna为模板，采用针对布鲁氏菌bcsp-31基因设计的引物，进行pcr扩增；
12.反向斑点杂交：pcr扩增产物在杂交膜上进行反向斑点杂交；其中，杂交膜上固定有针对布鲁氏菌bcsp-31基因设计的检测探针。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法中，所述待测样本可
以为来自个体的离体样本，也可以是环境样本。所述来自个体的离体样本可以为血液样本(例如血清样本)。根据本发明的一些具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法，是非诊断目的的。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法，nai磁珠法中，针对每50μl待测样本，采用的提取试剂包括1.5-6mol/l的nai裂解液，蛋白酶k，磁珠，以及异丙醇。在本发明的一些具体实施方案中，nai磁珠法提取目的dna时，优选控制裂解时间为2min。
15.在本发明的一些具体实施方案中，优选地，针对每50μl待测样本，采用的提取试剂包括50μl ddh2o、100μl nai裂解液、5μl pk、5-20μl磁珠以及20-100μl异丙醇。
16.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法中，所述目的dna的提取利用微流控芯片技术全自动进行，或是手工提取。在一些具体实施方案中，手工提取过程优选包括：
17.在离心管中加入待测样本，并加入裂解液nai，混匀，并加入蛋白酶k，进行孵育；
18.在上述离心管中加入磁珠和异丙醇，混匀；
19.将离心管放于磁力架上静置，待magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，并根据需要进行漂洗；
20.离心管开盖室温晾干，加入洗脱液，孵育；
21.将离心管放于磁力架上静置，待magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
22.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法，pcr扩增过程中，针对布鲁氏菌bcsp-31基因设计的引物具有如seq id no.1和seq id no.2所示序列。
23.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法，pcr扩增过程中，采用15μpcr反应体系，包括：dna聚合酶(2
×
taq master mix)7.5ul，正、反向引物各1.5μl(0.5μmol/μl)，ddh2o 1.5μl，核酸模板3μl；反应循环参数：95℃预变性3min，95℃10s、50℃30s、72℃30s，45个热循环，72℃终延伸1min。
24.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法中，所述pcr扩增过程利用微流控芯片技术全自动进行。
25.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法，反向斑点杂交过程中，针对布鲁氏菌bcsp-31基因设计的检测探针具有如seq id no.3所示序列。
26.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法中，所述反向斑点杂交过程利用微流控芯片技术全自动进行。
27.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法，反向斑点杂交过程中，杂交膜上还固定有质控探针。
28.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法中，杂交膜优选划分为多个点位，优选至少12个点位，在本发明的一些具体实施方案中，杂交膜划分为32个点位。各探针采用微量点样技术被固定在杂交膜的不同点位上，其中检测探针至少1个点，空白对照探针、内参质控探针gb各至少1个点，显色质控探针重复至少3个点。
29.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的方法，是利用微流控核酸芯片与全自动核酸芯片检测仪配套完成。可采用现有技术中任何可行的微流控核酸芯片与
全自动核酸芯片检测仪。在本发明的一些具体实施方案中，采用北京博晖创新提供的微流控核酸芯片与全自动核酸芯片检测仪。
30.具体地，本发明的检测方法中，微流控核酸芯片根据布鲁氏菌特定基因设计的特异性引物，可以扩增出布鲁氏菌的目的片段，检测仪将扩增产物转移到芯片的检测区，在检测区杂交膜上包被有布鲁氏菌的检测探针，如果扩增产物中含有目的基因则能够被芯片上的探针捕获，再加入酶液和显色液后，如果在杂交膜的特定位置出现蓝色的斑点，可判断出样本中含有布鲁氏菌，如果在特定的位置不会出现蓝色斑点，则样本中不含布鲁氏菌。
31.另一方面，本发明还提供了一种用于实现本发明所述检测布鲁氏菌的方法的检测系统，该检测系统可以是检测仪器设备、虚拟装置或是检测试剂盒等。具体地，该检测系统包括：
32.用于实现所述目的dna的提取的提取试剂材料；
33.用于实现所述pcr扩增的扩增试剂材料；
34.用于实现反向斑点杂交的试剂材料。
35.根据本发明的具体实施方案，本发明的检测布鲁氏菌的检测系统还包括分析单元，所述分析单元按照以下方法对反向斑点杂交结果进行分析判断：
36.如果杂交膜的显色质控探针点有阳性斑点，内参质控点有阳性斑点，且有检测探针阳性斑点出现，提示样本为布鲁氏菌阳性；或者
37.如果杂交膜的显色质控探针点有阳性斑点，内参质控点有阳性斑点，且无检测探针阳性斑点出现，提示样本为布鲁氏菌阴性。
38.另一方面，本发明还提供了一种用于实现本发明所述检测布鲁氏菌的方法的引物和检测探针组合物，其特征在于，所述引物具有如seq id no.1和seq id no.2所示序列；所述检测探针具有如seq id no.3所示序列。
39.在本发明的一些具体实施方案中，本发明比较了mc法与离心柱法、磁珠法及手工法提取布鲁氏菌核酸效率；比较了微流控全自动核酸检测(mc-pcr)与基因测序、实时荧光定量核酸扩增检测(qpcr)、taqman探针法检测80例布鲁氏菌试管凝集实验阳性血清的符合率；评估mc-pcr法检测布鲁氏菌的重复性、准确性、特异性、最低检出限。结果表明，本发明的mc法提取布鲁氏菌核酸在27个循环就达到设定的阈值，效率优于大多成品试剂盒，差异有统计学意义(p《0.05)；mc-pcr与基因测序kappa值0.659、与qpcr kappa值0.777，检测具有高度一致性；mc-pcr与基因测序、taqman探针法、qpcr检测阳性结果符合率为100％、100％和97.3％；重复性、精密度、准确性好，mc-pcr检测人胚胎肾hek293细胞，eb病毒、巨细胞病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌的临床样本或培养物，检测阴性率100％，mc-pcr检出布鲁氏菌质粒最低检出限为825copies/ml(检出率20/22＝90.9％)，优于taqman探针法、qpcr法。这些结果表明，本发明的mc-pcr检测布鲁氏菌核酸的方法，其重复性、精密度、准确性、特异性、检出限的性能均优于一般布鲁氏菌核酸检测试剂盒，且检测方法安全、快捷、及时、精准，本发明的检测技术的应用将提高布鲁氏菌病诊断率和诊断准确率，对布鲁氏菌病的防治起到重要作用。
附图说明
40.图1为本发明的mc-pcr检测系统使用前的试剂放置示意图。
41.图2为本发明的微流控探针排布示意图。图中，bc代表空白对照探针，sp代表显色质控探针，gb代表内参质控探针，bs代表布鲁氏菌检测探针。
42.图3为本发明的微流控芯片结果判定示意图。
43.图4为本发明的精密度参考品微流全流程检测结果。
44.图5为八种磁珠ct值统计图表。
45.图6为八种磁珠qpcr试验溶解曲线图。
46.图7为布鲁氏菌核酸qpcr扩增曲线图。
47.图8为布鲁氏菌核酸qpcr溶解曲线图。
48.图9为研究组1与对照组1核酸提取方法qpcr实验结果柱状分析图。
具体实施方式
49.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中未特别注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或商厂说明书建议的操作进行。
50.实施例中，80例布鲁氏菌试管凝集实验阳性患者血液样本采集自2020年1月1日至2021年2月28日期间呼伦贝尔市传染病医院，其中临床诊断确诊布鲁氏菌病56例。血液样本采集后，离心分离血清2ml。布鲁氏菌悬液及阴性血清样本由内蒙古林业总医院检验科提供。试管凝集阳性样本及布鲁氏菌悬液均采用56℃/30分钟进行灭活，-80℃冷藏。装有布鲁氏菌悬液的离心管及试管凝集阳性的血清样本均在二级生物安全实验室内的生物安全柜内完成实验操作。布鲁氏菌质粒采用北京睿博兴科生物技术有限公司的合成质粒。
51.实施例1
52.本实施例中提供了一种基于mc-pcr技术的布鲁氏菌检测技术，其中是将北京博晖创新布病检测微流控核酸芯片与北京博晖创新全自动核酸芯片检测仪(型号bhf-vi)配套使用用于检测布鲁氏菌。
53.本实施例中，所用试剂，消耗品及主要成分见表1。
54.表1
[0055][0056][0057]
备注：
①
以上液体试剂组分装量偏差不超过标称规格的
±
10％；
[0058]
②
不同批次布鲁氏菌核酸检测试剂盒不得混用；
[0059]
③
裂解液与显色液需注意避光保存。
[0060]
④
外标质控品包含阳性对照和阴性对照，在每次实验过程中均需处理，方法同样
本操作。
[0061]
本实施例中，具体检测过程包括：
[0062]
1.实验前准备
[0063]
1)打开核酸芯片检测仪(按照仪器说明书操作)。
[0064]
2)裂解液使用前，24人份需要加入5ml纯化水，上下颠倒5-10次后，充分震荡混匀1分钟；12人份需要加入3ml纯化水，上下颠倒5-10次后，充分震荡混匀1分钟；4人份需要加入1ml纯化水，上下颠倒5-10次后，充分震荡混匀1分钟。
[0065]
备注：试剂盒已提供用于稀释所需的纯化水，无需单独准备。
[0066]
请不要把剩余的水放入试剂放置区。
[0067]
试剂放置区为全新的纯化水。
[0068]
3)将试剂盒内的各组分充分平衡至室温并混匀，依次放置在仪器的试剂放置区对应位置；安装芯片。
[0069]
4)试剂放置如图1所示。
[0070]
2.实验过程：
[0071]
仪器自动吸取50μl-100μl待测样本加入微流控芯片加样孔，关闭仪器舱门。
[0072]
运行布鲁氏菌核酸检测试剂盒(生物芯片法)操作程序，在微泵的驱动下，
[0073]
分别进行目的dna的提取、针对目的dna进行的pcr扩增和反向斑点杂交。程序运行的基本过程如表2所示。
[0074]
表2
[0075][0076]
具体地，上述过程中：
[0077]
2.1核酸提取
[0078]
50μl待测样本+50μl ddh2o+100μl裂解液+5μl pk+10μl磁珠+100μl异丙醇，6m裂解液，裂解2min。
[0079]
其中，待测样本为来自待测个体的血液样本，采集后，离心分离血清2ml。采用56℃/30分钟进行灭活，-80℃冷藏。
[0080]
2.2pcr扩增
[0081]
采用15μpcr反应体系，主要包括：诺唯赞高纯度耐热dna聚合酶(2
×
taq master mix)7.5ul，正、反向引物(bcsp31-b4、bcsp31-b5)各1.5μl(0.5μmol/ul)ddh2o:1.5u核酸模板3ul。反应循环参数：95℃预变性3min，95℃10s、50℃30s、72℃30s，45个热循环，72℃终延伸1min。
[0082]
bcsp31-b4：tggctcggttgccaatatcaa(seq id no.1)。
[0083]
bcsp31-b5：cgcgcttgcctttcaggtctg(seq id no.2)。
[0084]
2.3反向斑点杂交
[0085]
采用微量点样技术，将检测探针bs(bcsp31-p2)与质控探针固定在杂交膜上。参见图2所示，可将杂交膜按位置划分为32个点位，其中空白对照、内参质控探针gb各1个点，显色质控探针重复3个点。
[0086]
bcsp31-p2：aaatcttccaccttgcccttgccatca(seq id no.3)。
[0087]
2.4微流控芯片结果判定(ccd扫描分析实验结果)
[0088]
实验过程中设立阴阳性对照，实验结果应符合以下要求：试剂盒内的阳性对照必须在布鲁氏菌bs，内参质控点的gb和sp位置处均出现阳性斑点，否则说明实验失败，提示核酸提取、pcr扩增或杂交失败。试剂盒内的阴性对照必须在gb和sp位置出现阳性斑点，其他位置均不能出现阳性斑点，否则有可能发生污染。
[0089]
微流控芯片结果判定可参见图3。其中：
[0090]
阳性结果判定：杂交膜的sp点(3个)均有阳性斑点，内参质控点(1个)gb点有阳性斑点，且有bs探针阳性斑点出现，提示样本为布鲁氏菌阳性；
[0091]
阴性结果判定：杂交膜的sp点(3个)均有阳性斑点，内参质控点(1个)gb点有阳性斑点，且无bs探针阳性斑点出现，提示该样本为布鲁氏菌阴性；
[0092]
其他可能结果说明：若杂交膜的空白对照点或阴性对照点为阳性，提示实验过程可能发生污染，实验不成功，需重复试验；若杂交膜的sp点(3个)无阳性斑点，提示显色失败，实验不成功，需重复试验；若杂交膜的sp点(3个)有阳性斑点，但内参质控点的gb点无阳性斑点，提示样本内参杂交失败，需对该样本做重复试验，若重复试验gb点仍无阳性，则判定样本采集不符合要求。
[0093]
评估实验1：本发明的mc-pcr检测布鲁氏菌核酸的性能评估
[0094]
重复性使用mc-pcr检测北京睿博兴科生物技术有限公司合成布鲁氏菌质粒浓度1000copies/ml精密度参考品；精密度使用mc-pcr检测100cfu/ml布鲁氏菌悬液；准确性使用mc-pcr检测北京睿博兴科生物技术有限公司合成布鲁氏菌质粒浓度1000copies/ml阳性参考品及人胚胎肾hek293细胞浓度1.0*105copies/ml阴性参考品；特异性使用mc-pcr检测浓度2.5*105copies/mleb病毒、浓度2.1*105copies/ml人巨细胞病毒、浓度3.0*106copies/ml金黄色葡萄球菌、浓度1.8*106copies/ml肺炎链球菌14型、浓度1.0*105copies/m人胚胎肾hek293细胞。
[0095]
采用spss26统计软件对结果进行统计分析，各组间率采用百分比(％)表示多组间比对采用卡方检验，不同检验方法之间的一致性采用kappa检验分析。p《0.05具有统计学意义。当0.0～0.20极低的一致性、0.21～0.40一般的一致性、0.41～0.60中等的一致性、0.61～0.80高度的一致性和0.81～1几乎完全一致。
[0096]
重复性：检测布氏菌质粒精密度参考品浓度1000copies/ml，重复22次，结果均可以检出布氏菌；见表3。
[0097]
精密度：检测100cfu/ml布氏菌悬液，重复10次，结果均可以检出布鲁氏菌；见图4。
[0098]
准确性：检测1000copies/ml阳性参考品及人胚胎肾hek293细胞浓度1.0*105copies/ml阴性参考品符合率为100％。
[0099]
特异性：检测人胚胎肾hek293细胞，eb病毒、巨细胞病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄
球菌的临床样本或培养物，检测阴性率100％；
[0100]
检出限：布氏菌质粒最低检出限为825copies/ml(检出率20/22＝90.9％)，其敏感性优于另外两种试剂盒。见表3。
[0101]
表3、研究组2与对照组2布氏菌核酸最低检出限实验比较
[0102]
浓度copies/mlmc-pcr/人份taqman探针/人份qpcr/人份1000022/2220/2020/20500022/2220/2020/20100022/2215/2019/2082520/225/205/20最低检出限825copies/ml5000copies/ml1000copies/ml
[0103]
注：taqman探针法和qpcr法试剂盒最低检测限为结合本实验情况及其说明书确认其最低检测限。
[0104]
评估实验2：本发明的mc-pcr检测方法中所用引物探针的优势
[0105]
由于血液样本中布鲁氏菌含量较低，提高微流控芯片检测布鲁氏菌的检出率的两个关键因素，一是提取高核酸提取效率，另一是提高扩增效率。
[0106]
本发明中，使用oligo7和allele id 6软件针对布鲁氏菌病bcsp-31基因设计了多对验证引物探针，最终选择出3组引物探针(见表4)，采用北京睿博兴科生物技术有限公司合成；设计合成含有布鲁氏菌病dna的大肠杆菌质粒，采用北京睿博兴科生物技术有限公司合成质粒。对3组引物分别在abi 7500实时荧光定量检测仪上进行qpcr实验。证明本发明的bcsp31-b4、bcsp31-b5、bcsp31-p2是适合微流控芯片pcr加反向斑点杂交的引物探针序列。
[0107]
表4
[0108][0109]
qpcr实验条件：凝集试验阳性血清样本使用天根试血液基因组dna提取试剂盒(离心柱348-2)剂提取后的核酸为模板。qpcr采用15ul反应性体系：2x chamq universal sybr green qpcr master mix):7.5ul，正、反向引物各:1.5ul(0.5μmol/ul)ddh2o:1.5ul,核酸
模板3ul。反应循环参数：95℃预变性3min，95℃10s、50℃30s、72℃30s，45个热循环，72℃终延伸1min.在qpcr循环的第一步72℃时收集荧光信号。检测通道为sybr。荧光参数设定为none。荧光定量pcr扩增采用美国abi 7500software实时荧光定量pcr仪对提取的产物检测。实验结果显示：bcsp-31b4、b5引物扩增曲线ct值较好，溶解曲线峰值较好。
[0110]
微流控杂交验证：微流控芯片pcr扩增反应体系采用诺唯赞高纯度耐热dna聚合酶(2
×
taq master mix)，其他反应体系与荧光定量pcr相同，反应循环参数与荧光定量pcr相同。编写相应反应体系与扩增条件应用北京博晖创新核酸芯片检测仪(型号bhf-vi)进行微流控全流程实验检测。实验结果显示：bcsp-31b4,b5引物和p2探针，检测稳定性和检出率最好。
[0111]
评估实验3：本发明的mc-pcr检测方法中nai磁珠法提取目的dna的优势
[0112]
目前传统的血液中布鲁氏菌核酸检测试剂盒多数是以手工提取为主要方法，提取过程繁琐，提取效率不高，稳定性不好，此外，封闭检测不能得到扩增片段的大小，提高灵敏性的同时污染风险也自然提高。在血液中能否高效的提取布鲁氏菌核酸是研究的关键。本发明中，选取四种现有能够提取布鲁氏菌核酸的提取方法进行比较，表明本发明的mc-pcr检测方法中nai磁珠法提取目的dna的优势。
[0113]
选取四种裂解方法：ste磁珠法、nai磁珠法、ctab磁珠法、天根柱纯化法4中方法进行提取效率对比实验，提取流程按照文献所述提取步骤完成，磁珠法统一选择(海狸)磁珠，提取产物进行之前qpcr反应体系及循环参数进行扩增检出。每份样品：200ul血清中均含有2*106cfu布鲁氏菌。
[0114]
实验结果ct值表明提取效率：天根柱纯化》nai磁珠法》ctab磁珠法》ste磁珠法；溶解曲线表明天根柱纯化法、nai磁珠法及catb磁珠法提取到布鲁氏菌基因组dna，且证实了布鲁氏菌引物的特异性。本发明的nai提取效率最佳为1.57*106copies)/(2*106cfu)。
[0115]
结果nai磁珠法提取到的布鲁氏菌基因组dna能通过微流控杂交平台检测出；上述结果中检测的最低拷贝数为19600copies/ml，可进一步降低浓度进行微流控平台检。
[0116]
评估实验4：不同nai提取体系的比较
[0117]
原实验固定量：50ul血清+50ulddh2o+100ulnai6mol/ml+5ul pk+5ul海狸磁珠+50ul异丙醇，实验计划设立四种优化条件，每种条件选取四种不同优化参数。每份样品：50ul血清中均含有5*105cfu布鲁氏菌，提取后产物进行qpcr实验。
[0118]
a.不同异丙醇加入量(a1-a4:75、50、35、20ul)
[0119]
b.不同裂解时间(b1-b4:2、5、10、20min)
[0120]
c.不同nai浓度(c1-c4:1.5、3、4.5、6mol/l)
[0121]
d.不同磁珠用量(d1-d4:5、10、15、20ul)
[0122]
实验结果表明：
[0123]
a组实验：异丙醇增加到75ul后对ct值影响明显，显著的降低了ct。
[0124]
b组实验：裂解时间2-5min范围内ct值小，相差不大，但是》5分钟(10与20min)不如2-5。
[0125]
c组实验：nai 6mol/ml ct值最好。
[0126]
d组实验：磁珠5-10-15ulct值相差不大，增加到20ul后效果变差。
[0127]
纵观所有对比：异丙醇对ct影响值最大。异丙醇加样量优化实验后结果异丙醇为
100ul时提取效果最佳。
[0128]
综合提取优化实验：nai法采用50ul血清+50uldd h2o+100ul nai 6mol/ml+5ul pk+10ul海狸磁珠+100ul异丙醇为最佳提取条件。
[0129]
微流控芯片手工提取流程见表5。
[0130]
表5
[0131]
[0132][0133]
评估实验4：微流控芯片布鲁氏菌病检测试剂优化
[0134]
选取市场上不同厂家扩增效率较好的十一种pcr扩增mix和不同厂家提取效率较好的八种磁珠，进行对比实验。
[0135]
将布鲁氏菌阳性质粒稀释至1.65e cps/ml和0.825cps/ml浓度作为样本，每种浓度两个重复样本，分别使用十一种mix(见表6)，进行微流控qpcr及杂交实验。
[0136]
表6市场上十一种成品mix表
[0137]
dna kit)及研发的布氏菌核酸手动提取试剂作为对照组1，严格按照试剂盒说明书在生物安全柜内操作。
[0149]
比较研究组1与对照组1提取布鲁氏菌核酸实验结果
[0150]
研究组1与对照组1核酸溶解曲线图纵坐标峰值所对应的横坐标一致，呈现单一的溶解峰，温度相同，表示为相同的扩增产物。见图7。
[0151]
研究组1布鲁氏菌核酸最早在27个循环就达到设定的阈值，核酸的提取效率排第二，差异有统计学意义(p《0.05)。见图8，图9。
[0152]
评估实验6：符合性检测实验
[0153]
采用80例试管凝集试验阳性血清为样本，使用新布鲁氏菌核酸检测试剂在北京博晖创新核酸芯片检测仪上进行自动提取、扩增(扩增反应循环参数与上述荧光定量检测实验一致)、反向斑点杂交、显示和结果分析为研究组2。
[0154]
布鲁氏菌核酸全自动提取试剂提取的产物由华大基因北京公司进行基因测序、硕世生物科技布鲁氏菌核酸检测试剂盒(荧光pcr法货号：jb20115n)、上海之江生物科技布鲁氏菌核酸检测试剂盒(taqman探针法)严格按照试剂盒说明书在生物安全柜内提取目的核酸，后使用abi 7500software实时荧光定量pcr仪进行检测的结果为对照组2。
[0155]
实验结果显示，基因测序的kappa值为0.659，与mc-pcr具有高度的一致性，mc-pcr与基因测序阳性结果符合率100％，总符合率82.5％；qpcr的kappa值为0.7767，与mc-pcr具有高度的一致性，mc-pcr与市售的qpcr试剂盒阳性结果符合率97.3％，总符合率88.8％。*测序为阴性，**测序后为阳性说明mc-pcr与测序结果更符合，其准确性和检出率优于市售的qpcr试剂盒；taqman探针法kappa值为0.1034及临床诊断kappa值为0.115，与mc-pcr具有极低的一致性。见表7。
[0156]
表7、研究组2与对照组2检测80例布鲁氏菌试管凝集实验阳性样本结果比较
[0157][0158]
注1：
①
阳性符合率。
②
阴性符合率。
③
总符合率。注2：测序方法为一代测序，包含利用巢式pcr扩增后的测序。
[0159]
本发明的研究结果表明mc-pcr与基因测序、qpcr检测布鲁氏菌病核酸具有高度一致性，mc-pcr与基因测序、taqman探针法、qpcr检测阳性结果符合率为100％、100％和97.3％，1例qpcr阳性、mc-pcr阴性样本基因测序为阴性结果，8例qpcr阴性、mc-pcr阳性样本测序后为阳性结果，mc-pcr与基因测序结果更符合，说明mc-pcr检出阳性的结果更准确。因为mc-pcr在pcr扩增后又进行了rdb。rdb是将针对bcsp31基因组设计的引物的探针包被
在芯片检测区的杂交膜上，若扩增产物中含有目的基因，则可被芯片上的探针捕获，与膜上探针相结合，结合形成复合物，特异性强，经酶和显色反复润洗，形成可见的斑点，就可判断出感染布鲁氏菌核酸，这可显著降低假阳性率和假阴性率。通过rdb技术不仅可以提高布鲁氏菌核酸的检测效率，还增加了实验的特异性和准确性。mc-pcr阳性率高是其提取布鲁氏菌核酸效率高且三种试剂盒中mc-pcr检出限最低825拷贝，对布鲁氏菌检测最敏感，当血清中布鲁氏菌的浓度高于100cfu/ml的时就能被检测到这对布鲁氏菌病的早期诊断以及鉴别布鲁氏菌病慢性期与急性期都有帮助。与临床诊断具有较低的一致性，分析是临床医生常根据试管凝集实验和临床症状对布鲁氏菌病进行诊断，但对一些试管凝集实验试验阳性且有与布鲁氏菌感染症状相似的患者无法准确诊断是否为布鲁氏菌病的再次感染，导致这当中会出现一部分假阳性的病例。由于布鲁氏菌病血清免疫学凝集实验检测方法，对血清中抗体包括igm和igg进行检测，可能会与其他细菌存在着一定量交叉反应，导致假阳性率偏高，特异性不强，同时血清抗体在体内可以长时间存在，即使一些患者痊愈，且没有症状，但对其血清进行检测仍然会出现一些较高滴度抗体的情况
[29]
，由于国家诊断标准的局限性，误诊漏诊不可避免。mc-pcr技术检测100cfu/ml布鲁氏菌悬液重复10次，检测布鲁氏菌质粒精密度参考品浓度1000copies/ml，重复22次，结果均可以检出布鲁氏菌。检测1000copies/ml阳性参考品及人胚胎肾hek293细胞浓度1.0*105copies/ml阴性参考品符合率为100％，检测人胚胎肾hek293细胞，eb病毒、巨细胞病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌的临床样本或培养物，检测阴性率100％，评估检测性能均优良。
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应当指出的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。