一种基因修饰的干细胞及用作组织工程与再生医学种子细胞的用途的制作方法

1.本发明涉及干细胞领域，涉及干细胞增殖，具体涉及一种基因修饰的干细胞及用作组织工程与再生医学种子细胞的用途。


背景技术：

2.间充质干细胞(mscs)最初是从骨髓单核细胞中分离出来，后从脐带、胎盘、关节滑液、脂肪、胰岛、真皮、牙龈、外周血、肩胛下囊等多种组织中获得。因具有独特的增殖、多向分化潜能、营养能力、归巢/迁移和免疫抑制等生物学功能，而日益受到重视，成为组织工程与再生医学的理想的种子细胞。
3.人脐带间充质干细胞(hucmscs)是存在于脐带中的一类间充质干细胞，最初在脐带血中被发现，后逐渐从脐带的华通氏胶和血管周围组织中获得。hucmscs参与人体修复的方式主要有：细胞分化、免疫调节、分泌多种细胞因子。
4.hucmscs越来越多地参与组织器官的重建，但是组织工程与再生医学对种子细胞的数量具有较高的需求。提高种子细胞的增殖活性可以更好地满足组织工程与再生医学的需求。
5.高迁移率族蛋白n2(high mobility group n2，hmgn2)是高迁移率族蛋白n(high mobility group n，hmgn)家族成员，是一种广泛存在于真核生物染色质内的非组蛋白。hmgn2能够改变染色体的结构和功能，调节基因的表达，在抗病毒、抗炎症、胚胎发育和肿瘤发生演化过程中都发挥重要作用。研究发现，hmgn2可抑制人口腔鳞状细胞癌、子宫肌瘤、肺癌、骨肉瘤等肿瘤细胞的增殖，而在白血病肿瘤细胞、乳腺癌肿瘤细胞、小肠癌细胞中，hmgn2却异常高表达，这种高表达可能与细胞过度增殖相关，说明hmgn2在不同肿瘤中可能发挥着不同的作用(高迁移率族蛋白n2在肿瘤中的研究进展，现代肿瘤医学，2016年10月)。
6.hmgn2对hucmscs功能的影响还不清楚，尚无相关文献报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了提供一种基因修饰的干细胞及用作组织工程与再生医学种子细胞的用途，该基因修饰的干细胞具有更高的增殖活性和迁移活性，可以更好地满足组织工程需求。
8.实现上述目的的技术方案如下：
9.一种增殖活性和迁移活性增强的间充质干细胞，该间充质干细胞高表达hmgn2。
10.优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
11.上述间充质干细胞用作组织工程与再生医学种子细胞的用途。
12.促进hmgn2表达用于增强间充质干细胞的增殖活性和迁移活性的用途。
13.有益效果：
14.本发明发现，高表达hmgn2的人脐带间充质干细胞具有更强的增殖活性和迁移活
性，且多向分化试验证明该高表达hmgn2的人脐带间充质干细胞依然具有良好的多项分化能力，因此，该基因修饰的人脐带间充质干细胞可以更好地满足组织工程需求。
附图说明
15.图1为人脐带间充质干细胞表面标志物的流式鉴定结果；
16.图2为western blot检测结果；
17.图3为各组hucmscs迁移变化；
18.图4为多向分化染色鉴定结果，其中：a为茜素红s染色液染色结果，b为油红-o染色液染色结果，c为阿利辛蓝染色液染色结果。
具体实施方式
19.一、试验材料
20.hucmscs购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。
21.hucmscs完全培养基购自上海雅吉生物科技有限公司。
22.hucmscs成骨诱导分化培养基(附茜素红s染色液)、成脂诱导分化培养基(附油红-o染色液)和成软骨诱导分化培养基(附阿利辛蓝染色液)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
23.携带gfp报告基因和hmgn2基因的腺病毒ad-hmgn2、仅携带gfp报告基因的腺病毒ad-gfp由汉恒生物科技(上海)有限公司构建。pcr引物委托上海生工合成。
24.总rna提取试剂盒购自北京凯诗源生物科技有限公司，逆转录试剂盒购自takara公司，hmgn2抗体购自abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg购自中杉金桥公司。
25.cck8试剂盒购自同仁化学。
26.二、试验方法
27.1、hucmscs复苏培养
28.将冻存的hucmscs按照常规方法复苏后用hucmscs完全培养基在37℃、5％co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，每2～3天换液1次，待细胞克隆长至约85％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化并传代。取传代hucmscs，用0.25％胰蛋白酶消化，pbs终止消化，离心收集细胞，pbs洗涤并重悬至2
×
106/ml；各流式管加入190μl细胞悬液和10μl萤光素标记的单克隆抗体cd73、cd90、cd105、cd14、cd34、cd45，混匀后室温避光孵育45min，用pbs洗去未结合抗体并重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。每管样品设立同型阴性对照。
29.2、分组、基因转染和rt-pcr、western blot验证
30.取生长状态良好的hucmscs分为正常对照组、hmgn2转染组和转染对照组。正常对照组的hucmscs不进行转染操作，hmgn2转染组的hucmscs转染携带gfp报告基因和hmgn2基因的腺病毒ad-hmgn2，转染对照组hucmscs转染仅携带gfp报告基因的腺病毒ad-gfp。基因转染操作按常规腺病毒转染操作方法进行，先将生长状态良好的hucmscs接种于6孔板，待细胞汇合至75％左右时，进行腺病毒感染，感染4h后弃去培养基，pbs洗涤，更换为新的hucmscs完全培养基，24h后在荧光倒置显微镜下观察出现绿色荧光代表转染成功。转染成功后使用rt-pcr检测各组hucmscs中hmgn2 mrna表达，使用western blot检测各组hucmscs中hmgn2蛋白的表达。
31.rt-pcr检测各组hucmscs中hmgn2 mrna表达：
32.收集各组hucmscs，用总rna提取试剂盒分别提取总rna，进行逆转录获得cdna，以此为模板进行扩增反应。gapdh为内参。引物设计和pcr反应程序参照文献(表达hmgn2融合蛋白的重组t细胞对肿瘤细胞杀伤作用的探索，郑州大学，2017年)。2-δδct
法计算hmgn2mrna的相对表达水平，以正常对照组hmgn2 mrna相对表达水平计为1。
33.western blot检测各组hucmscs中hmgn2蛋白表达：
34.收集各组hucmscs，总蛋白提取试剂盒分别提取总蛋白，使用bca蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，上样30μg，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，100v1.5h后将蛋白转移至pvdf膜，配制5％脱脂奶粉室温封闭pvdf膜2h，洗膜后用兔抗人hmgn2一抗4℃孵育过夜，继续洗膜后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg二抗室温孵育2h，洗膜3次，加ecl混合溶液，曝光、显影，以β-actin作为内参。
35.3、hucmscs增殖活性检测
36.取生长状态良好的hucmscs，按上述方法分组、转染，获得正常对照组、hmgn2转染组和转染对照组hucmscs。消化，洗涤，用hucmscs完全培养基重悬，制成密度为5
×
104/ml的细胞悬浮液，按照每孔100μl的接种量接种于96孔板，每组5个复孔，置于37℃、5％co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，培养24、48h后，每孔加入10μl的cck8试剂，孵育4h后在酶联免疫检测仪450nm波长处测定每孔吸光度值，取5孔平均值。
37.4、hucmscs迁移活性检测
38.取生长状态良好的hucmscs，按上述方法分组、转染，获得正常对照组、hmgn2转染组和转染对照组hucmscs。消化，洗涤，用hucmscs完全培养基重悬，制成密度为5
×
104/ml的细胞悬浮液，按照每孔2ml的接种量接种于6孔板，置于37℃、5％co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，12h后用1ml枪头于孔板底划一道均匀横线，重新开始计时，分别于0h、24h后在显微镜下观察并测量划痕宽度，按如下公式计算各组细胞迁移率。
39.迁移率(％)＝(0h划痕距离-24h划痕距离)
÷
0h划痕距离
×
100％
40.5、多向分化能力检测
41.5.1成骨分化
42.取hmgn2转染组细胞，用hucmscs成骨诱导分化培养基诱导培养9d，弃去上清液，pbs洗涤3次，加入4℃多聚甲醛固定15min，pbs洗涤3次，加入茜素红s染色液染色1h，显微镜下观察红色结节，并拍照记录。
43.5.2成脂分化
44.取hmgn2转染组细胞，用hucmscs成脂诱导分化培养基诱导培养9d，弃去上清液，pbs洗涤3次后，加入4℃多聚甲醛固定15min后，pbs洗涤3次，加入油红-o染色液染色20min，显微镜下观察油滴，并拍照记录。
45.5.3成软骨分化
46.取hmgn2转染组细胞，用hucmscs成软骨诱导分化培养基诱导培养9d，弃去上清液，pbs洗涤3次后，加入4℃多聚甲醛固定15min后，pbs洗涤3次，加入阿利辛蓝染色液染色40min，显微镜下观察软骨粘多糖，并拍照记录。
47.6、统计学分析
48.采用软件spss 17.0进行统计学分析处理，计量数据以均数
±
标准差表示，组间比
较采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
49.三、试验结果
50.1、hucmscs复苏培养
51.流式细胞仪检测分析结果如图1所示，强烈表达cd73、cd90、cd105，不表达cd14、cd34、cd45，符合hucmscs表面免疫标志物特征。
52.2、基因转染验证
53.rt-pcr、western blot检测结果分别如表1和图2所示，与正常对照组相比，hmgn2转染组中hmgn2 mrna、hmgn2蛋白表达水平明显升高，转染对照组未见明显升高。
54.表1各组hucmscs中hmgn2 mrna相对表达水平
55.组别hmgn2 mrna相对表达水平正常对照组1.00
±
0.09hmgn2转染组2.45
±
0.21转染对照组1.01
±
0.12
56.3、hucmscs增殖活性
57.cck8法检测结果如表2所示，与正常对照组相比，hmgn2转染组中od450nm明显升高，转染对照组未见明显升高。od450nm与细胞数量成正比，这说明hmgn2转染组hucmscs具有更强的细胞增殖活性。
58.表2各组od450nm
[0059][0060]
4、hucmscs迁移活性
[0061]
细胞迁移结果如表3和图3所示，与正常对照组相比，hmgn2转染组中hucmscs迁移活性明显增强，转染对照组未见明显增强。
[0062]
表3各组hucmscs迁移率
[0063]
组别迁移率(％)正常对照组16.8
±
0.9hmgn2转染组78.9
±
1.4转染对照组16.6
±
1.0
[0064]
5、hucmscs多向分化能力
[0065]
hmgn2高表达hucmscs的成骨、成脂和成软骨诱导分化结果如图4所示，茜素红s染色液染色结果、油红-o染色液染色结果以及阿利辛蓝染色液染色结果均为阳性，说明hmgn2高表达hucmscs在不同诱导培养基的培养下依然能定向分化为不同的细胞，依然维持多向
分化能力。
[0066]
综上，高表达hmgn2的人脐带间充质干细胞具有更强的增殖活性和迁移活性，且多向分化试验证明该高表达hmgn2的人脐带间充质干细胞依然具有良好的多项分化能力。