一种用于海南岛油茶资源鉴定的SNP标记及检测方法

一种用于海南岛油茶资源鉴定的snp标记及检测方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学及植物分子育种技术领域领域，具体涉及一种用于海南岛油茶资源鉴定的snp标记及检测方法。


背景技术：

2.油茶主产和原产于中国，是中国重点发展的木本油料作物，与油菜籽、花生、大豆并称中国4种主要大宗油料作物。它的茶籽油富含不饱和脂肪酸(可达90％左右，比油橄榄高)，是高级食用油，同时具有良好的保健药用功效。油茶目前在中国的栽培面积约7000万亩，主要分布在中国的南方地区。油茶在海南俗称“山柚”，海南岛是中国油茶资源分布的最南缘。由于海南岛气候独特，海峡隔离，油茶又是异花授粉植物，在环境和遗传控制的双重作用下，海南岛山柚资源表型变异极为丰富且独特，茶油品质无苦味香稠度大，明显区别于内地茶油。经鉴定，海南岛油茶资源属于山茶属油茶组越南油茶的一个特殊类群。正是由于不同于内地的茶油品质，海南茶籽油在市场上的价格为内地的3-5倍。海南山柚作为海南省的一个极具特色的经济作物，发展势头良好，2021年栽培面积15万亩左右。
3.由于海南油茶产业良好的经济效益，在种苗市场有大量非本地油茶种源的种苗涌入海南。实践证明，这些种苗种源大部分适应海南岛的生长环境，出现造林成率低、生长极慢、开花结实低等问题。同时，即使有个别的油茶种源能适应海南生境长生，所产的茶籽油也不具备本地茶籽油的品质。此外，由于海南茶籽油价格高，每年有大量的非本地茶籽进入海南充当本地茶籽用于榨油，掺合入本地茶籽油，影响本地茶籽油的品质。这些极不利海南油茶特色油茶的健康可持续发展。同时，近年也出现海南本地油茶种苗被引种到内地种植的现象。实践证明，海南本地品种区域性较强，在内地的大部分地区不适宜种植。因此，如何鉴定海南岛油茶资源，建立快速高效的技术或体系，显得尤为急迫。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中的至少部分缺陷，本发明提供了一种用于海南岛油茶资源特异性鉴定的叶绿体snp及检测方法。对特异性snp所在的叶绿体基因组片段设计引物，对特异性snp进行检测，高效区分鉴定海南岛油茶种质资源。
5.本发明的第一个目的是提供鉴定海南岛油茶种质资源的基因组snp位点。
6.本发明的第二个目的是提供用于海南岛油茶种质资源鉴定的snp特异性引物。
7.本发明的第三个目的是提供一种海南岛油茶种质资源的鉴定方法。
8.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
9.s1、提取待测香花油茶(camellia osmantha)、小果油茶(c.oleifera var.monosperma)、普通油茶(c.oleifera)，以及越南油茶(c.vietnamensis)在海南岛及海南岛外分布种质资源的总基因组dna；
10.s2、以步骤s1提取的待测样品dna为扩增模板，以权利要求2中ycf1-4引物为扩增引物进行pcr扩增；pcr反应体系30μl：包括模板dna 30ng，dntps 0.20mmol/l，序列0.13μ
mol/l，taq dna聚合酶3.00u，ddh2o补至总体积30μl。
11.反应扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；
12.pcr扩增产物检测：pcr扩增产物在含8％goldview核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，在0.5
×
tbe缓冲液中电压100v电泳40min，跑胶结果在凝胶成像系统中拍照记录，以100bp dna为marker，扩增产物仅1个条带，且条带大小为183bp左右，即为目标条带。
13.s3、对步骤s2的pcr产物进行测序，测序方法为sanger一代常规测序。在扩增片段的第45个位点，种质碱基为“t”为海南岛内种质。
14.特异性引物命名为ycf1-4，包括一个正向引物和一个反向引物；
15.正向引物(编号1)的序列为：5'cgatcttgatccaggcctca3'；
16.反向引物(编号2)的序列为：5'acaacacacataaacataagggca3'。
17.本发明的有益之处在于：特异分子标记是不受环境和植物生长阶段影响，可准确高效检测特异植物资源的方法，通过对海南岛内外的越南油茶、小果油茶、普通油茶和香花油茶叶绿体基因组测序，并进行比较基因组学研究获得海南岛油茶资源高度物异的叶绿体snp位点，并开发snp位点检测引物，建立检测方法。利用山茶属油茶组材料对开发的标记与方法进行验证，利用该分子标记可显著提高海南岛油茶种质资源的分类鉴定准确性，对科学保护海南岛油茶种质资源，保障海南油茶特色产业发展，助力中国油茶产业有序发展，以及研究海南岛特色油茶资源起源进化，以及海南油茶分子育种具有重要意义。
18.为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为实施例1中扩增产物的跑胶图；
21.图2为实施例1中标记测序部分dna碱基峰图；
22.图3为实施例2中扩增产物的跑胶图；
23.图4为实施例2中标记测序部分dna碱基峰图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1：在不同主栽油茶组油茶物种种质资源中分子鉴定海南岛油茶种质资源
26.1.选取实验材料
27.取分布华南地区的油茶组油茶物种，其中越南油茶来自海南省7个居群、广东省2
个居群和广西壮族自治区3个居群，香花油茶来自广西壮族自治区1个居群，小果油茶来自广西壮族自治区2个居群，普通油茶来自广西壮族自治区2个居群和江西省1个居群，合计86个样本。通过本发明，对上述材料中的海南岛油茶资源进行分子鉴定。
28.2.海南油茶资源特异性鉴定的叶绿体snp及检测
29.2.1采用改良ctab法提取上述的不同油茶物种86个样本总dna；
30.2.2以步骤(1)提取的油茶待测样品dna为扩增模板，特异性引物命名为ycf1-4，包括一个正向引物和一个反向引物；
31.正向引物(编号1)的序列为：5'cgatcttgatccaggcctca3'；
32.反向引物(编号2)的序列为：5'acaacacacataaacataagggca3'，以所述ycf1-4作为扩增引物，进行pcr扩增；
33.2.3 pcr反应体系(30μl)：模板dna 30ng，dntps 0.20mmol/l，序列0.13μmol/l，taq dna聚合酶3.00u，ddh2o补至总体积30μl。
34.2.4反应扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶(含8％goldview核酸染料)上进行电泳，在0.5
×
tbe缓冲液中电压100v电泳40min跑胶结果在凝胶成像系统中拍照记录。
35.2.5对上述的pcr产物由天一辉远生物科技(广州)有限公司仪器abi3730xl测序，测序方法为sanger一代常规测序，所述叶绿体snp序列ycf1-4反向测序。
36.3.海南岛油茶资源特异性鉴定的叶绿体snp及检测分析
37.检测结果如表1、图1以及图2所示：
38.表1鉴别不同油茶物种资源的snp分析表
39.40.[0041][0042]
由表1可以明确表明：供试材料86份在扩增片段的第45个位点，不同物种的普通油茶、小果油茶、香花油茶及海南岛外的越南油茶种质均发生碱基突变为“g”，海南岛内种质在相应的位点碱基为“t”。
[0043]
由图1和图2可以明确表明：引物ycf1-4扩增叶绿体基因片段长度为183bp，扩增片段约第45个位点，hzp-1、hcx-1、snh-1和tpy-1等海南岛外不同物种油茶种质均发生碱基突变为“g”，zx-1、jx-1和mp-1等海南岛内种质在相应的位点碱基为“t”。结果表明，本专利所发明的扩增引物ycf1-4在不同油茶物种资源中可鉴定出海南岛油茶种质资源。
[0044]
实施例2：在不同地区越南油茶资源中分子鉴定海南岛油茶种质资源
[0045]
1.选取实验材料
[0046]
取分布供试材料为来自海南岛内外的33个越南油茶居群，其中包括海南岛所有老油茶林分布区的海南岛屯昌县、琼海市、五指山市等24个居群，广西壮族自治区梧州市、崇左市、玉林市的7个居群和广东茂名市高州市的2个居群，外类群为来自江西省赣州市的茶树居群，共计165份材料。通过本发明，对上述材料中的海南岛油茶资源进行分子鉴定。
[0047]
2.海南岛油茶资源特异性鉴定的叶绿体snp及检测
[0048]
2.1采用改良ctab法提取上述海南岛内外的越南油茶165个越南油茶样本总dna；
[0049]
2.2以步骤(1)提取的越南油茶待测样品dna为扩增模板，以所述ycf1-4作为扩增引物，进行pcr扩增；
[0050]
2.3 pcr反应体系(30μl)：模板dna30 ng，dntps 0.20mmol/l，序列0.13μmol/l，taq dna聚合酶3.00u，ddh2o补至总体积30μl。
[0051]
2.4反应扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶(含8％goldview核酸染料)上进行电泳，在0.5
×
tbe缓冲液中电压100v电泳40min.跑胶结果在凝胶成像系统中拍照记录。
[0052]
2.5对上述的pcr产物由天一辉远生物科技(广州)有限公司仪器abi3730xl测序，测序方法为sanger一代常规测序，所述叶绿体snp序列ycf1-4反向测序。
[0053]
特异性引物命名为ycf1-4，ycf1-4包括一个正向引物ycf1-4-1和一个反向引物ycf1-4-2；
[0054]
正向引物ycf1-4-1的序列为：5'cgatcttgatccaggcctca3'；
[0055]
反向引物ycf1-4-2的序列为：5'acaacacacataaacataagggca3'。
[0056]
3.海南岛油茶资源特异性鉴定的叶绿体snp及检测分析。
[0057]
检测结果如表2、图3以及图4所示：
[0058]
表2鉴别海南岛内外越南油茶种质资源的snp分析
[0059]
[0060]
[0061]
[0062][0063]
由表2可以明确表明，供试材料165份在扩增片段约第45个位点，海南岛外的越南油茶种质均发生碱基突变为“g”，海南岛内种质在相应的位点碱基为“t”。
[0064]
由图3和图4可以明确表明，结果说明：ycf1-4叶绿体基因片段长度为183bp(附图3)，拥有多态性位点数量s为5，单倍型数量h为8，单倍型多样性hd为0.619，核苷酸多样性pi为0.00612，watterson多样性参数theta-w为0.00653，dna片段遗传分化程度k为0.820。扩
增片段约第45个位点(附图4)，tpy-1、mdy-1、tjg-1和htdl-1等海南岛外的油茶种质均发生碱基突变为“g”，fh-1、nba-1和wb-1等海南岛内种质在相应的位点碱基为“t”。结果表明，本专利所发明的扩增引物ycf1-4可用于海南岛内外的越南油茶种质资源的遗传多样性和鉴定分析。
[0065]
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。