一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用

本发明涉及分子诊断，具体而言，涉及一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用。

背景技术：

1、肺癌是全球高发肿瘤，位居我国恶性肿瘤发病的首位。2015年我国新发肺癌病例约为78.7万例，占恶性肿瘤新发病例的20.03％，死亡人数约为63.1万例，占恶性肿瘤新发病例的26.99％。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,nsclc)是肺癌最常见的组织学类型，占肺癌患者的85％左右(sung h,ferlay j,siegel rl,et al.globalcancer statistics 2020:globocan estimates of incidence and mortalityworldwide for 36cancers in 185countries.ca cancer j clin 2021,71(3):209-249.)。由于早期症状隐匿、易转移，缺乏有效的监测手段，大部分患者就诊时多为中晚期，导致肺癌患者的5年生存率较低。

2、遗传变异和表观遗传学紊乱所导致的癌基因扩增或突变和肿瘤抑癌基因的沉默与功能丧失，在肺癌的发生进展中起着重要作用。与基因突变相比，表观遗传改变在肿瘤发生过程中的渐进性和可逆性对肺癌的早期检测和靶向治疗具有重要意义。目前研究较为明确的是启动子区cpg岛甲基化及组蛋白修饰的异常变化所致基因表达异常与功能紊乱，尤其是抑癌基因启动子区高甲基化已作为表观遗传标志物与药物靶点应用于肿瘤等疾病的分子诊断、治疗及预后评估等方面(oh jh,jung sh,hong sj,and rhyu mg,dnamethylation as surrogate marker for gastric cancer.j cancer prev 20:172-178,2015.)。

3、人胰蛋白酶(trypsin)在多种生理和病理过程中发挥重要作用，并通过调控其他蛋白活性的特定功能参与癌症进展，成为新型分子靶标。多项研究针对胰蛋白酶前体分子丝氨酸蛋白酶3(serine protease 3，prss3)与肿瘤的联系，已开发出prss3抑制剂以阻止其促癌作用(hockla a,miller e,salameh ma et al,.prss3/mesotrypsin is atherapeutic target for metastatic prostate cancer.molecular cancer research:mcr 2012,10(12):1555-1566.radisky es.prss3/mesotrypsin in prostate cancerprogression:implications for translational medicine.asian journal ofandrology 2013,15(4):439-440.)。

4、然而，prss3无论是作为促癌因子促进肿瘤转移和复发，还是作为抑癌因子抑制肿瘤生长，其在恶性肿瘤中的生物学功能一直没有定论。即使在相同类型的肿瘤如非小细胞肺癌中，也有关于prss3表达与功能的相反报告。一方面，研究表明prss3在转移性nsclc细胞中表达增加，且prss3的表达增加与病人不良预后相关。但另一面，却有研究显示，prss3在nsclc中呈现表观沉默，并促进细胞的增殖和转移，具有潜在的抑癌基因样作用，且与prss3呈现异常高甲基化相关(ma h,hockla a,mehner c,coban m,radisky es.prss3/mesotrypsin and kallikrein-related peptidase 5are associated with poorprognosis and contribute to tumor cell invasion and growth in lungadenocarcinoma.scientific reports 2019,9(1):1844.marsit cj,chinedu o,hadi d,kelsey kt.epigenetic silencing of the prss3 putative tumor suppressor gene innon-small cell lung cancer.molecular carcinogenesis 2010,44(2):146-150.)。

5、这些研究表明prss3在肿瘤发生发展过程中表达模式与功能表型呈现出争议性的“双向”作用，而且被认为是不同来源的组织细胞及其肿瘤微环境导致不同prss3表达与信号通路造成的。由于prss3剪接变异体序列的高度一致性，缺乏针对各异构体的特异抗体及精准检测方法，根据文献报道无法进一步确定肿瘤中prss3异常表达的剪接变异体及其异构体具体类型，提示prss3在肿瘤发生发展过程中表达与功能及其分子机制需进一步的深入系统研究。因此，研究prss3基因体甲基化对剪接变异体的调控机制，鉴定肺癌早期诊断相关标志物具有重要的科学意义和临床应用价值。

6、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用以解决上述技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、本发明提供了一种用于肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物，分子标记物包括胰蛋白酶3剪接变异体3和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2，胰蛋白酶3剪接变异体3的核苷酸序列如seq id no.1所示，转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、发明人发现胰蛋白酶3剪接变异体3(prss3-v3)和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2(mzf1-v2)在肺癌组织细胞表达明显降低，通过多色免疫组化分析表明，肺癌中prss3mrna的差异表达是由于prss3-svs的异常表达引起的，与癌旁组织相比，肿瘤组织中的prss3-v3的表达减少。而敲除prss3基因后，肿瘤细胞的增殖明显减慢，克隆形成明显减少，迁移能力明显减弱。而在过表达prss3的不同剪接变异体后，细胞生物学功能呈现明显不同，其中过表达prss3-v3基因后肿瘤细胞增殖、克隆形成数及迁移细胞数均明显降低，而细胞过表达prss3-v1或v2后，增殖、克隆形成及迁移较对照均显著增加。经体内裸鼠成瘤实验验证，prss3-v3呈现出抑癌基因的作用。表明prss3-v3基因可以作为肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物。

5、经mzf1的剪接变异体敲除实验以及染色质免疫共沉淀实验，结果表明：mzf1-v2可以与prss3-v3基因的启动子区域特异性结合，可以上调prss3-v3基因的表达。由此，可以通过检测mzf1-v2和prss3-v3基因的表达水平，进而实现肺癌诊断、化疗或预后检测。

6、本发明还提供了一种检测分子标记物的物质在制备肺癌诊断药物或预后检测制剂中的应用。

7、在本发明应用较佳的实施方式中，上述物质为检测分子标记物的引物或试剂。上述检测引物或试剂为液体溶液、冻干粉剂或半固态制剂。

8、在一种可选的实施方式中，上述物质中还包括缓冲液或其他助剂、冻干保护剂。

9、在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测胰蛋白酶3剪接变异体3的引物序列如seq id no.3-4所示，检测转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的引物序列如seq idno.5-6所示。

10、prss3-v3的反转录扩增引物如下(nm_001197097.3，扩增大小为140bp，扩增产物如seq id no.24所示)；

11、上游引物(seq id no.3)：5’-gtgcgccattggttttccat-3’；

12、下游引物(seq id no.4)：5’-gcagaagtgggagccagaat-3’。

13、mzf1-v2的反转录扩增引物如下(nm_198055.2，扩增大小为339bp，扩增产物如seqid no.25所示)：

14、上游引物(seq id no.5)：5’-gggggcatcttctcccca-3’；

15、下游引物(seq id no.6)：5’-caccttgccacatacatcgc-3’。

16、采用上述mzf1-v2的反转录扩增引物对逆转录得到的cdna进行荧光定量pcr，荧光定量pcr反应条件如下：50℃2min，95℃10min，95℃15s；60℃1min；40个循环，收集荧光；95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

17、在一种可选的实施方式中，prss3-v3的反转录扩增条件与mzf1-v2的反转录扩增条件相同。

18、本发明还提供了一种检测上述分子标记物的物质在制备肺癌诊断或预后检测试剂盒中的应用。

19、在本发明应用较佳的实施方式中，上述物质为检测分子标记物的引物或试剂；检测胰蛋白酶3剪接变异体3的引物序列如seq id no.3-4所示，检测转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的引物序列如seq id no.5-6所示。

20、本发明还提供了一种分子标记物作为药物靶点在肺癌诊断、化疗和预后检测药物中的应用：转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2通过上调胰蛋白酶3剪接变异体3的表达，抑制肺癌的进程。

21、经实验验证，prss3-v3呈现出抑癌基因的作用，而mzf1-v2可以与prss3-v3基因的启动子区域特异性结合，可以上调prss3-v3基因的表达。表明prss3-v3基因和mzf1-v2可以作为药物靶点用于肺癌诊断、或预后检测的药物。

22、在本发明应用较佳的实施方式中，上述肺癌为非小细胞肺癌，上调表达是上调非小细胞肺癌细胞系及组织的胰蛋白酶3剪接变异体3的表达。

23、在本发明应用较佳的实施方式中，上述相对于正常细胞，胰蛋白酶3剪接变异体3和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2在肺癌细胞中的表达均呈现逐渐下降模式prss3-v3low/mzf1-v2low。

24、需要说明的是，上述表达下降包括不限于：与正常细胞相比，肺癌细胞中prss3-v3和mzf1-v2的表达水平有稍有下降或明显的下降。prss3-v3和mzf1-v2的表达水平的下降比例相同或不同。

25、经验证，转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2通过上调控胰蛋白酶3剪接变异体3的表达实现抑癌作用。

26、本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供了一种用于肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物，通过检测mzf1-v2和prss3-v3基因的表达水平，进而实现肺癌诊断、化疗或预后检测。分子标记物的提出，在提高化疗敏感性的个体化精准治疗应用中具有重要的科学意义和临床价值，不仅为肺癌患者的个体化精准治疗提供了有效的分子靶标，还为干预新策略提供了新的依据。此外，分子标记物的提出还提供了更可靠的肺癌诊断和预后预测手段。