一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法。


背景技术：

2.牙周炎和牙髓炎是口腔科常见病,牙周组织和牙髓组织在解剖上相通,可相互感染。原发的牙髓病变可通过这些解剖因素波及牙周组织，而牙周组织的病变也可能影响牙髓。这也就是牙周牙髓联合病变的解剖学基础。因此一旦牙周或牙髓发生联合病变，容易相互扩散和影响，往往病变破坏范围较大、病程较长且迁延不愈，治疗难度大、周期长、费用高且预后不确切，容易导致牙齿缺失的结局，是临床上一个较为棘手的问题。
3.细胞的程序性死亡分为细胞凋亡、细胞焦亡、程序性细胞坏死、铁死亡等等，细胞焦亡(pyroptosis)通常是病原体感染时可能引发的细胞死亡的主要模式，其特征在于死亡细胞的破裂和由此产生的有效炎症诱导剂的释放，在细胞受感染的情况下还包括病原体及其不同成分，已有研究表明牙周炎的发生发展过程中伴随着焦亡的产生，此种效应导致了牙周膜干细胞的丧失、促进破骨细胞形成，加重了炎症程度；不仅如此，细胞焦亡还导致了根尖周炎的发生，并且焦亡的严重程度与根尖周炎的病情严重程度呈正相关。牙周牙髓联合病变作为口腔中较为严重的一种炎性疾病，其发生发展机制与焦亡及焦亡产物的相关性尚无报道。
4.细胞外囊泡是一组异质的细胞衍生膜结构，包括外泌体、微囊泡、凋亡小体等，存在于生物体液中并参与多种生理和病理过程。细胞外囊泡现在被认为是细胞间通讯的额外机制，允许细胞交换蛋白质、脂质和遗传物质。它介导的是一种远程的、长效的、低免疫原性的细胞间通讯新方式5，在细胞间通讯、疾病进展或作为生物标志物方面的作用引起了人们的极大兴趣。本课题组先前的研究发现细胞在焦亡的过程中会释放一些具有免疫调节功能的evs，我们暂且称之为焦亡囊泡(pyrop-evs)，并且已经成功在体外诱导牙周牙髓联合病变组织中的中间充质干细胞(mscs)发生焦亡。
5.mscs的免疫调节特性与炎症的状态有关，在轻微炎症中，mscs发挥抗炎作用，有助于炎症的清除，而在严重的疾病环境中，mscs也许发挥促炎作用，组织位置和炎性状态是mscs免疫调节特性的关键决定因素。目前许多类型的人牙组织来源mscs已被分离和表征，包括牙髓干细胞、脱落乳牙干细胞、牙周膜干细胞、牙囊祖细胞、牙槽骨来源的间充质干细胞、来自牙乳头的干细胞、牙胚祖细胞和牙龈间充质干细胞12。发现在牙周牙髓联合病变的肉芽组织中也存在mscs，其形态与增殖分化能力都与正常的牙周膜干细胞无明显差异。
6.根据目前的研究，猜想在牙周牙髓联合病变这样一个炎性环境中，往往伴随着mscs免疫调节特性的改变，目前从牙周牙髓联合病变的组织中已经成功分离出mscs，分析此种炎性环境下mscs的焦亡产物特性与探究牙周牙髓联合病变的致病机制密切相关。
7.因此应当认为，pyrop-evs在牙周牙髓联合病变的炎性微环境下对于颌骨骨髓间
充质干细胞的免疫调节功能及成骨分化能力具有影响，研究牙周牙髓联合病变组织的中间充质干细胞焦亡囊泡的是否在牙周牙髓联合病变疾病进展中发挥重要作用及其具体机制是急需解决的科学问题。


技术实现要素：

8.为解决背景技术提出的上述问题，本发明提出一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法。
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，所述方法包括以下步骤：(1)分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，利用焦亡诱导液诱导其焦亡，并提取其焦亡囊泡(pyrop-evs)悬液；(2)分离、培养人颌骨骨髓干细胞，将焦亡囊泡(pyrop-evs)以不同浓度梯度注射至人颌骨骨髓干细胞中共同培养，并检测其细胞的变化；(3)诱导小鼠溃疡性结肠炎后，将小鼠分为实验组和对照组，给实验组的小鼠注射不同浓度梯度的焦亡囊泡(pyrop-evs)悬液，给对照组的小鼠注射pbs缓冲液，并检测实验组和对照组小鼠的各项生理指标。
10.优选的，所述步骤1中分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞的方法为：选取根据临床体格检查及影像学资料，诊断为牙周牙髓联合病变，且无系统性疾病，身体状况良好的患者，拔除其患牙上附带的肉芽组织，剁碎、消化、培养、传代、冻存后使用。
11.优选的，所述步骤1中取p3代长势良好的人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，加入焦亡诱导液诱导其焦亡后，并鉴定细胞确实发生焦亡，利用差速离心的方法，分离焦亡囊泡。
12.优选的，所述步骤2中分离、培养人颌骨骨髓干细胞的方法为：选取临床因正颌手术或牙槽突修整手术中废弃的健康颌骨，将其清洗、剪碎、离心、培养、传代、冻存后使用。
13.优选的，所述步骤2中取长势良好的人颌骨骨髓干细胞分为两组，根据浓度梯度加入焦亡囊泡(pyrop-evs)悬液诱导24小时后；一组人颌骨骨髓干细胞，收集其上清液，提取上清液中的细胞蛋白后，进行elisa(酶联免疫吸附实验)和wb(免疫印迹)检测；另一组人颌骨骨髓干细胞，用成骨诱导液及成脂诱导培养后，进行茜素红染色、油红o染色。
14.优选的，所述步骤2中elisa(酶联免疫吸附实验)和wb(免疫印迹)检测时，检测细胞因子il-6或runx2或alp中的一种或多种。
15.优选的，所述步骤3中通过含有2.5％dss的无菌水喂养小鼠，诱导其患溃疡性结肠炎。
16.优选的，所述步骤3中检测的实验组和对照组小鼠的生理指标包括：疾病活动指数、组织学损伤指数、免疫指标的变化。
17.优选的，所述步骤3中检测实验组和对照组小鼠的生理指标时，操作方法为：在疾病进展最严重的小鼠体重下降约30％左右时，同时处死所有小鼠，收集小鼠血清、结肠、脾脏、肠系膜淋巴结；检测血清里炎症相关细胞因子；结肠长度测量、结肠he染色检测；脾脏研磨成单细胞悬液后，用流式细胞术检测淋巴细胞；肠系膜淋巴结用流式细胞术观察淋巴细胞的变化。
18.优选的，所述步骤1中诱导人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞焦亡的焦亡诱导
液由α-mem、lps、nigericin配制而成。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
20.本发明提供的牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，探究牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞焦亡囊泡的免疫调节功能影响及介导骨吸收机制，为寻找牙周牙髓联合病变的具体发生发展机制奠定基础，将来为发现口腔炎性病变致病因素提供新的见解，同时该方法整体步骤简单，易于操作。
附图说明
21.图1为本发明方法步骤1和步骤2的流程图；
22.图2为本发明步骤3的流程图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.如图1-2所示，本发明提出了一种牙周牙髓联合病变组织中间充质干细胞的焦亡产物在疾病发生发展中的机制研究方法，所述方法包括以下步骤：(1)分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，利用焦亡诱导液诱导其焦亡，并提取其焦亡囊泡(pyrop-evs)悬液；(2)分离、培养人颌骨骨髓干细胞，将焦亡囊泡(pyrop-evs)以不同浓度梯度注射至人颌骨骨髓干细胞中共同培养，并检测其细胞的变化；(3)诱导小鼠溃疡性结肠炎后，将小鼠分为实验组和对照组，给实验组的小鼠注射不同浓度梯度的焦亡囊泡(pyrop-evs)悬液，给对照组的小鼠注射pbs缓冲液，并检测实验组和对照组小鼠的各项生理指标。
25.所述步骤1中分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞的方法为：选取根据临床体格检查及影像学资料，诊断为牙周牙髓联合病变，且无系统性疾病，身体状况良好的患者，拔除其患牙上附带的肉芽组织，剁碎、消化、培养、传代、冻存后使用。
26.所述步骤1中取p3代长势良好的人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，加入焦亡诱导液诱导其焦亡后，利用差速离心的方法，分离焦亡囊泡。
27.需要说明的是，利用差速离心的方法，分离焦亡囊泡的方法为：首先第一次差速离心19小时后，弃第一次差速离心的上清液，对第一次离心后的沉淀继续加入焦亡诱导液，反应24小时后，进行第二次差速离心10分钟，将第二次差速离心的上清液继续进行第三次差速离心10分钟，将第三次差速离心的上清液继续进行第四次差速离心30分钟，弃第四次差速离心的上清液，将第四次差速离心的沉淀，进行第五次差速离心30分钟，弃第五次差速离心的上清液，第五次差速离心的沉淀即为分离出的焦亡囊泡。
28.需要说明的是，分离、培养人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞，利用焦亡诱导液诱导其焦亡后，需要做焦亡鉴定，具体包括如下步骤：
29.1.取第一次差速离心后的上清液做ldh检测；2.取第一次差速离心后的沉淀做western blot:gsdmd,asc,caspase 1；3.elisa:il-1β,il-18。根据焦亡鉴定的结果可调整差速离心的实验参数。
30.需要进一步说明的是，所述步骤1中诱导人牙周牙髓联合病变肉芽组织干细胞焦亡的药物由α-mem、lps、nigericin配制而成。
31.所述步骤2中分离、培养人颌骨骨髓干细胞的方法为：选取临床因正颌手术或牙槽突修整手术中废弃的健康颌骨，将其清洗、剪碎、离心、培养、传代、冻存后使用。
32.所述步骤2中取长势良好的人颌骨骨髓干细胞分为两组，根据浓度梯度加入焦亡囊泡(pyrop-evs)悬液诱导24小时后；一组人颌骨骨髓干细胞，收集其上清液，提取上清液中的细胞蛋白后，进行elisa(酶联免疫吸附实验)和wb(免疫印迹)检测；另一组人颌骨骨髓干细胞，用成骨诱导液及成脂诱导培养后，进行茜素红染色、油红o染色。需要说明的是，所述步骤2中elisa(酶联免疫吸附实验)和wb(免疫印迹)检测时，检测细胞因子il-6或runx2或alp中的一种或多种。
33.所述步骤3中通过含有2.5％dss的无菌水喂养小鼠，诱导其患溃疡性结肠炎。
34.具体地，溃疡性结肠炎模型表现：结肠充血、水肿、变短、变脆、重量长度比增加，出现不同程度的结肠溃疡，黏膜水肿、杯状细胞缺失、隐窝肿胀破坏，黏膜和黏膜下层出现不同程度的炎症细胞浸润，上皮细胞损伤。
35.所述步骤3中检测的实验组和对照组小鼠的各项生理指标包括疾病活动指数、组织学损伤指数、免疫指标的变化。
36.需要说明的是，所述疾病活动指数(dai)的评估包括体重、大便性状和血便；所述组织学损伤指数(hi)的评估：包括观察结肠内有无出血，溃疡等，同时取一小块组织常规石蜡包埋、切片、he染色，观察组织学改变并进行评分；所述免疫指标的变化：包括血清及结肠部位炎症细胞因子，如ifn-γ的变化情况。
37.具体地，所述步骤3中检测实验组和对照组小鼠的生理指标时，操作方法为：在疾病进展最严重的小鼠体重下降约30％左右时，同时处死所有小鼠，收集小鼠血清、结肠、脾脏、肠系膜淋巴结；检测血清里炎症相关细胞因子；结肠长度测量、结肠he染色检测；脾脏研磨成单细胞悬液后，用流式细胞术检测淋巴细胞；肠系膜淋巴结用流式细胞术观察淋巴细胞的变化。
38.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
39.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。