一种高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒及应用的制作方法

1.本发明具体涉及一种高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒及应用。


背景技术：

2.人类乳头瘤病毒(hpv)是一种严重危害人类健康的病原体。在已经发现的140多种hpv中，其中20余种已证实与恶性肿瘤相关，即高危型hpv，包括hpv16、18、30、31、33、35、39、45、51、52、56、58、66、69型等，与宫颈癌、外阴癌、肛门癌，以及生殖器外的膀胱癌、食道癌、肺癌等恶性肿瘤相关，其中hpv16和hpv18是宫颈癌中最常见的型别，其次是hpv58、hpv52和hpv56。
3.检测hpv是子宫颈癌及口腔癌等早期诊断的重要指标。子宫脱落细胞被认为是hpv核酸检测的最有效的样本。但是该样本采集过程会对女性产生一定的创伤。经过长期实验跟踪，尿液中hpv含量几乎与脱落细胞一致。而且尿液样本无需医护人员采集，患者可轻松完成采集。经问卷调查显示，90％以上的女性更倾向于采集尿液样本，检测hpv。
4.目前，已经有多种检测hpv的方法，但是，针对高危型人类乳头瘤病毒的检测方法存在一些问题，比如检测方式较为麻烦，检测效率较低，难以达到快速、准确、高通量的目的。


技术实现要素：

5.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒及应用。
6.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种检测高危型人类乳头瘤病毒的引物及探针，所述引物和探针包括：
8.第一上游引物：5
’‑
tttgttactgtagtigataciac-3’9.第二上游引物：5
’‑
tttgtcacagttgtggataccac-3’10.第三上游引物：5
’‑
tttttaacagttgtagatactac-3’11.第一下游引物：5
’‑
gaaaaataaactgtaaatcatattc-3’12.第二下游引物：5
’‑
gaaaaataaactgtaaitcatactc-3’13.第三下游引物：5
’‑
gaaaaataaactgcaaitcatattc-3’14.其中“i”为脱氧次黄嘌呤核苷修饰；
15.检测hpv-16型taqman探针：
[0016]5’‑
fam-ctgccatatctacttcagaaact-mgb-3’[0017]
检测hpv-18型taqman探针：
[0018]5’‑
vic-ttctacacagtctcctgtacctg-bhq1-3’[0019]
检测hpv-31型taqman探针：
[0020]5’‑
rox-gtgctgcaattgcaaacagtgatac-bhq2-3’[0021]
检测hpv-33型taqman探针：
[0022]5’‑
rox-ctttatgcacacaagtaactagtgacag-bhq2-3’[0023]
检测hpv-35型taqman探针：
[0024]5’‑
rox-ctgctgtgtctactagtgacag-bhq2-3’[0025]
检测hpv-39型taqman探针：
[0026]5’‑
rox-ctatagagtcttccataccttctac-bhq2-3’[0027]
检测hpv-45型taqman探针：
[0028]5’‑
rox-cctgtgccaagtacatatgaccc-bhq2-3’[0029]
检测hpv-51型taqman探针：
[0030]5’‑
rox-actgctgcagtttccccac-bhq2-3’[0031]
检测hpv-52型taqman探针：
[0032]5’‑
rox-actttatgtgctgaggtgaaaaagg-bhq2-3’[0033]
检测hpv-56型taqman探针：
[0034]5’‑
rox-ctgctacagaacagttaagtaaatatg-bhq2-3’[0035]
检测hpv-58型taqman探针
[0036]5’‑
rox-tatgcactgaagtaactaaggaagg-bhq2-3’[0037]
检测hpv-59型taqman探针：
[0038]5’‑
rox-ctacttcttctattcctaatgtatacac-bhq2-3’[0039]
检测hpv-68型taqman探针：
[0040]5’‑
rox-ctgaatcagctgtaccagatgtttatg-bhq2-3’。
[0041]
进一步地，所述引物和探针还包括内参引物及探针，
[0042]
第四上游引物：5
’‑
agcctgttattttgtccta-3’[0043]
第四下游引物：5
’‑
atcccaattcatacggtag-3’[0044]
内参探针：5
’‑
cy5-tggttccttccttctggcttgtc-bhq2-3’。
[0045]
一种高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒，包括以上所述的引物及探针。
[0046]
进一步地，所述试剂盒还包括pcr检测混合液。
[0047]
进一步地，所述pcr检测混合液包括dutp，datp，dctp，dgtp，udg酶，hotstart taq dna polymerase，tris-hcl，nh4cl，kcl，tween，mgcl2。
[0048]
进一步地，所述pcr检测混合液包括dutp 200～1000nm，datp 100～500nm，dctp 100～500nm，dgtp 100～500nm，udg 1～5u，hotstart taq dna polymerase 1～10u，tris-hcl 10～50mm，nh4cl 5～10mm，kcl 50～120mm，tween 20 0.1％～1％；mgcl
2 2.5～5.0mm。
[0049]
在一些优选的方式中，将引物与探针加入pcr检测混合液后，第一上游引物、第二上游引物、第三上游引物的浓度均为100～500nm，第一下游引物、第二下游引物、第三下游引物的浓度均为100～500nm，hpv-16型taqman探针浓度为80～500nm，hpv-18型taqman探针浓度为100nm，其他剩余hpv探针浓度为80～300nm nm。内参引物(包括第四上游引物与第四下游引物)的浓度均为80nm，探针的浓度分别为50nm。
[0050]
进一步地，试剂盒还包括阳性标准品和/或阴性标准品。所述阳性标准品包括含有目的扩增序列的hpv-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68等13种高危基因型的合成质粒，所述阴性标准品为去rna酶水。
[0051]
以上所述的检测高危型人类乳头瘤病毒的引物及探针在制备人类乳头瘤病毒检
测试剂中的应用。
[0052]
以上所述的检测高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒在制备人类乳头瘤病毒检测试剂中的应用。
[0053]
本发明的有益效果是：
[0054]
(1)本发明的高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒能够对样品中hpv-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68等13种高危基因型进行检测，有助于对人类乳头瘤病毒引起的癌症的诊断与治疗。
[0055]
(2)本发明的试剂盒适用于一管式多重荧光定量pcr体系，检测hpv核酸；采用荧光报告基团fam、vic荧光区分hpv-16和hpv-18。
[0056]
(3)采用本发明的检测试剂盒，一次可以鉴别多种病毒，大大减少了工作量，提高了检测效率。
附图说明
[0057]
图1是hpv-16阳性标准品灵敏度检测结果图。
[0058]
图2是hpv-18阳性标准品灵敏度检测结果图。
[0059]
图3是hpv其他基因型阳性标准品灵敏度检测结果。
[0060]
图4样本检测结果(样本中hpv-16及hpv-18基因型阳性)。
具体实施方式
[0061]
为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本技术进行描述和说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。基于本技术提供的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0062]
在本技术中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本技术的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域普通技术人员显式地和隐式地理解的是，本技术所描述的实施例在不冲突的情况下，可以与其它实施例相结合。
[0063]
除非另作定义，本技术所涉及的技术术语或者科学术语应当为本技术所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本技术所涉及的“一”、“一个”、“一种”、“该”等类似词语并不表示数量限制，可表示单数或复数。本技术所涉及的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含；本技术所涉及的“连接”、“相连”、“耦接”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电气的连接，不管是直接的还是间接的。本技术所涉及的“多个”是指大于或者等于两个。“和/或”描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“a和/或b”可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。本技术所涉及的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序。
[0064]
以下实施例中所用试剂或仪器均可以通过市售购买获得，其中，1m＝1mol/l。
[0065]
一种检测高危型人类乳头瘤病毒的引物及探针，所述引物和探针包括：
[0066]
第一上游引物：5
’‑
tttgttactgtagtigataciac-3’(seq id no.1)
[0067]
第二上游引物：5
’‑
tttgtcacagttgtggataccac-3’(seq id no.2)
[0068]
第三上游引物：5
’‑
tttttaacagttgtagatactac-3’(seq id no.3)
[0069]
第一下游引物：5
’‑
gaaaaataaactgtaaatcatattc-3’(seq id no.4)
[0070]
第二下游引物：5
’‑
gaaaaataaactgtaaitcatactc-3’(seq id no.5)
[0071]
第三下游引物：5
’‑
gaaaaataaactgcaaitcatattc-3’(seq id no.6)
[0072]
其中“i”为脱氧次黄嘌呤核苷修饰；能与任何天然碱基a、g、c、t结合。
[0073]
检测hpv-16型taqman探针：
[0074]5’‑
fam-ctgccatatctacttcagaaact-mgb-3’(seq id no.7)
[0075]
本发明中，此处采用mgb修饰能提高探针的tm值。
[0076]
检测hpv-18型taqman探针：
[0077]5’‑
vic-ttctacacagtctcctgtacctg-bhq1-3’(seq id no.8)
[0078]
检测hpv-31型taqman探针：
[0079]5’‑
rox-gtgctgcaattgcaaacagtgatac-bhq2-3’(seq id no.9)
[0080]
检测hpv-33型taqman探针：
[0081]5’‑
rox-ctttatgcacacaagtaactagtgacag-bhq2-3’(seq id no.10)
[0082]
检测hpv-35型taqman探针：
[0083]5’‑
rox-ctgctgtgtctactagtgacag-bhq2-3’(seq id no.11)
[0084]
检测hpv-39型taqman探针：
[0085]5’‑
rox-ctatagagtcttccataccttctac-bhq2-3’(seq id no.12)
[0086]
检测hpv-45型taqman探针：
[0087]5’‑
rox-cctgtgccaagtacatatgaccc-bhq2-3’(seq id no.13)
[0088]
检测hpv-51型taqman探针：
[0089]5’‑
rox-actgctgcagtttccccac-bhq2-3’(seq id no.14)
[0090]
检测hpv-52型taqman探针：
[0091]5’‑
rox-actttatgtgctgaggtgaaaaagg-bhq2-3’(seq id no.15)
[0092]
检测hpv-56型taqman探针：
[0093]5’‑
rox-ctgctacagaacagttaagtaaatatg-bhq2-3’(seq id no.16)
[0094]
检测hpv-58型taqman探针
[0095]5’‑
rox-tatgcactgaagtaactaaggaagg-bhq2-3’(seq id no.17)
[0096]
检测hpv-59型taqman探针：
[0097]5’‑
rox-ctacttcttctattcctaatgtatacac-bhq2-3’(seq id no.18)
[0098]
检测hpv-68型taqman探针：
[0099]5’‑
rox-ctgaatcagctgtaccagatgtttatg-bhq2-3’(seq id no.19)
[0100]
进一步地，所述引物和探针还包括内参引物及探针：
[0101]
第四上游引物：5
’‑
agcctgttattttgtccta-3’(seq id no.20)
[0102]
第四下游引物：5
’‑
atcccaattcatacggtag-3’(seq id no.21)
[0103]
内参探针：5
’‑
cy5-tggttccttccttctggcttgtc-bhq2-3’(seq idno.22)。
[0104]
一种高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒，包括以上所述的引物及探针。本发明的
试剂盒适用于一管式多重荧光定量pcr体系，检测hpv核酸；采用荧光报告基团fam、vic荧光区分hpv-16和hpv-18，其他基因型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68不做具体区分。因为其他基因型临床要求不需要分型，只要检出即可。
[0105]
本发明以hpv l1基因为靶点，可以检测hpv-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68等13种高危基因型。本发明以hpv l1基因为靶点，敏感性比较好，本发明的试剂盒检测灵敏度高。
[0106]
在一些优选的方式中，所述试剂盒还包括pcr检测混合液。
[0107]
在一些优选的方式中，所述pcr检测混合液包括dutp，datp，dctp，dgtp，udg酶，hotstart taq dna polymerase，tris-hcl，nh4cl，kcl，tween，mgcl2。
[0108]
进一步地，所述pcr检测混合液包括dutp 200～1000nm，datp 100～500nm，dctp 100～500nm，dgtp 100～500nm，udg 1～5u，hotstart taq dna polymerase 1～10u，tris-hcl 10～50mm，nh4cl 5～10mm，kcl 50～120mm，tween 20 0.1％～1％(v/v)；mgcl
2 2.5～5.0mm；以上所述浓度为终浓度。
[0109]
在一些优选的方式中，所述pcr检测混合液包括dutp 750nm，datp 250nm，dctp 250nm，dgtp 250nm，udg 5u，hotstart taq dna polymerase 5u，tris-hcl 20mm，nh4cl 5mm，kcl 75mm，tween 20 0.1％(v/v)，mgcl
2 2.5mm；以上所述浓度为终浓度。
[0110]
在一些优选的方式中，将引物与探针加入pcr检测混合液后，第一上游引物、第二上游引物、第三上游引物的浓度均为100～500nm，第一下游引物、第二下游引物、第三下游引物的浓度均为100～500nm，hpv-16型taqman探针浓度为80～500nm，hpv-18型taqman探针浓度为100nm，其他剩余hpv探针浓度为80～300nm nm。内参引物(包括第四上游引物与第四下游引物)的浓度均为80nm，探针的浓度分别为50nm。
[0111]
在一些优选的方式中，试剂盒还包括阳性标准品和/或阴性标准品。所述阳性标准品包括含有目的扩增序列的hpv-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68等13种高危基因型的合成质粒，比如，人乳头瘤病毒l1基因分型参考品。所述阴性标准品为去rna酶水。
[0112]
以上所述的检测高危型人类乳头瘤病毒的引物及探针在制备人类乳头瘤病毒检测试剂中的应用。
[0113]
以上所述的检测高危型人类乳头瘤病毒检测试剂盒针在制备人类乳头瘤病毒检测试剂中的应用。
[0114]
(一)
[0115]
1)多重荧光定量pcr反应体系：
[0116]
30微升荧光定量pcr反应体系包含：上游引物各200nm，下游引物各200nm，hpv-16taqman探针100nm，hpv-18taqman探针100nm，其他剩余hpv探针80nm，dutp 750nm，datp 250nm，dctp 250nm，dgtp 250nm，udg 5u，hotstart taq dna polymerase 5u，tris-hcl 20mm，nh4cl 5mm，kcl 75mm，tween-20 0.1％(v/v)，mgcl
2 2.5mm。
[0117]
2)荧光pcr体系分装：
[0118]
将配制好的荧光定量pcr体系测试合格后，按30微升分装至反应芯片中。所述反应芯片可以采用现有技术中常用反应芯片即可。
[0119]
3)扩增程序如下：
[0120]
50℃，2分钟；95℃，2分钟；95℃，15秒，55℃，40秒(收集荧光)，共45个循环。
[0121]
4)结果分析：
[0122]
试剂盒有效性判定：
[0123]
阴性对照fam/vic/rox无扩增曲线，cy5通道有扩增曲线，且ct值《32，试剂有效。
[0124]
阳性对照：fam/vic/rox，有扩增曲线，且ct值《25。
[0125]
试剂有效，可以进行下一步分析。
[0126]
(二)灵敏度测定
[0127]
采用本发明的试剂盒进行检测灵敏度，采用以上所述的多重荧光定量pcr反应体系与扩增程序等进行扩增，
[0128]
阳性标准品为人乳头瘤病毒l1基因分型参考品(包括hpv-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68等13种高危基因型)，不同hpv基因型的重组质粒浓度均为108copies/ml，107copies/ml，106copies/ml，105copies/ml，104copies/ml，103copies/ml。
[0129]
检测结果如图1-3所示，图1为hpv-16阳性标准品灵敏度检测结果图；从左至右曲线对应的浓度分别为：108copies/ml，107copies/ml，106copies/ml，105copies/ml，104copies/ml，103copies/ml，本发明试剂盒检测hpv-16的灵敏度为103copies/ml。
[0130]
图2为hpv-18阳性标准品灵敏度检测结果图；从左至右曲线对应的浓度分别为：108copies/ml，107copies/ml，106copies/ml，105copies/ml，104copies/ml，103copies/ml，本发明试剂盒检测hpv-18的灵敏度为103copies/ml。
[0131]
图3为hpv其他基因型阳性标准品灵敏度检测结果；从左至右曲线对应的浓度分别为：108copies/ml，107copies/ml，106copies/ml，105copies/ml，104copies/ml，103copies/ml，本发明试剂盒检测hpv其他基因型的灵敏度为103copies/ml。
[0132]
(三)采用本发明的试剂盒进行检测的步骤如下：
[0133]
(1)样本采集：
[0134]
尿液样本采集：使用常州可尔生命科技有限公司的尿液采集器，按说明书要求，收集5ml首段尿液样本。
[0135]
脱落细胞采集：使用采集器由专业的医护人员采集宫颈脱落细胞样本。
[0136]
(2)样本处理：
[0137]
尿液样本处理：取5ml尿液样本，5000rpm离心10分钟；去上清，加入200微升的生理盐水重悬细胞备用。
[0138]
宫颈脱落细胞：取1ml宫颈脱落细胞样本，5000rpm离心10分钟，去上清，加入200微升的生理盐水重悬细胞备用。
[0139]
(3)核酸提取：
[0140]
取200微升重悬样本，于核酸提取仪器提取核酸；用100微升te缓冲液洗脱核酸。
[0141]
(4)加样：
[0142]
取20微升的提取的核酸，加入至含30微升荧光定量pcr反应体系的反应芯片中，盖好管盖，混匀后瞬时离心。
[0143]
(5)上机：
[0144]
把反应芯片放入到poct-pcr仪器中，选择hpv项目，点击开始反应。扩增程序如下：50℃，2分钟；95℃，2分钟；95℃，15秒，55℃，40秒(收集荧光)，共45个循环。
[0145]
(6)结果分析：
[0146]
fam/rox/vic有扩增曲线，且ct值《38为阳性。
[0147]
fam、vic、rox通道未检出，结果为阴性。
[0148]
具体检测实例
[0149]
本实施例中样本来自50例志愿者的尿液样本(已知其中一位志愿者为hpv患者，其他志愿者为hpv阴性)，按照以上所述样本处理方法与检测步骤进行检测，得到检测结果为：49例hpv阴性，1例hpv患者，而且该患者为hpv-16及hpv-18基因型阳性，其他基因型为阴性，如图4所示；该检测结果与现有技术中单一试剂盒的检测结果一致。
[0150]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例的所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0151]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。