用于表达目标多肽的重组微生物及其制备方法、用途

本公开属于生物技术和基因工程，具体涉及一种重组微生物、重组微生物的制备方法和在表达目标多肽中的应用，以及一种制备目标多肽的方法。

背景技术：

1、t7表达系统是基于t7 rna聚合酶(t7 rna polymerase，t7 rnap)及其特异性识别的t7启动子建立起来的一种高效表达系统，是一种广泛应用的外源蛋白表达系统。t7表达系统最早应用于大肠杆菌内外源基因的表达，其主要由两部分组成：1)整合于大肠杆菌基因组上的t7 rna聚合酶基因，并且t7 rna聚合酶基因位于lacuv5启动子的下游，受乳糖操纵子(lactose operon)系统的调控；2)含有t7启动子的质粒，外源基因被构建到含有t7启动子的质粒上。上述的t7表达系统受iptg的诱导，能够在大肠杆菌内实现外源基因的高效表达。

2、目前，t7表达系统在多种微生物中被开发利用，包括枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)，乳酸乳球菌(lactococcus lactis)，假单胞菌(pseudomonas)等。然而，t7表达系统在应用于枯草芽孢杆菌时，还存在诸多问题。

3、引用文献1中在枯草芽孢杆菌内整合受木糖诱导型启动子控制的t7 rna聚合酶，表达目标蛋白的外源基因受t7启动子控制。但是，通过上述方法改造的枯草芽孢杆菌只有在添加利福平的条件下才能实现目标蛋白的表达，并且目标蛋白的表达水平仅能达到约70mg/ml的水平。

4、引用文献2中在枯草芽孢杆菌atcc6051a内应用t7表达系统。为改善细胞的转化效率，首先在基因组上整合由木糖诱导型启动子控制的comk基因，使细胞形成感受态细胞，外源基因易于导入细胞内；然后敲除枯草芽孢杆菌内的胞外蛋白酶基因apre和npre，减少了蛋白酶的产生和分泌，防止了生成的目标蛋白被降解；最后，在上述改在后的宿主的基础上，引入t7表达系统。t7表达系统包括在基因组上整合受木糖诱导型启动子控制的t7 rna聚合酶的表达盒，和由t7启动子控制的表达外源基因的游离质粒。通过上述方法，成功实现了α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的表达，最高酶活可达194.8±4.1u/ml。但其存在如下明显缺陷：一方面，comk基因和t7 rna聚合酶表达基因均使用木糖诱导型启动子控制，因此菌株在培养过程中一直处于感受态状态，导致菌株内基因不稳定；另一方面，木糖不仅能作为诱导剂使用，还会作为碳源被菌株利用，从而导致诱导条件不稳定。

5、引用文献3中将表达目标蛋白的外源基因和t7 rna聚合酶基因均整合在枯草芽孢杆菌的基因组上，以解决遗传不稳定问题。其中，菌株内t7 rna聚合酶的表达受iptg诱导型启动子控制。但是，由于外源基因的拷贝数低或表达元件不匹配等原因，目标蛋白的表达量仍处于较低水平。此外，通过该方法构建重组菌株也存在生物转化效率低，染色体遗传操作复杂、繁琐等问题。

6、因此，如何构建能够高效、稳定表达目标蛋白的重组枯草芽孢杆菌，是目前亟需解决的重要问题。

7、引用文献：

8、引用文献1，conrad b,savchenko rs,breves r,hofemeister j(1996)at7promoter-specific,inducible protein expression system for bacillussubtilis.mol gen genet250:230-236

9、引用文献2，ji m,li s,chen a,liu y,xie y,duan h,shi j,sun j(2021)awheat bran inducible expression system for the efficient production of alpha-l-arabinofuranosidase in bacillus subtilis.enzyme microb technol 144:109726.

10、引用文献3，castillo-hair sm,fujita m,igoshin oa,tabor jj(2019)anengineered b.subtilis inducible promoter system with over 10000-fold dynamicrange.acs synth biol8:1673-1678.

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、鉴于现有技术中存在的问题，例如，目前应用t7表达系统的重组芽孢杆菌存在目标蛋白的表达水平低、重组菌株的遗传稳定性差和诱导稳定性差等问题。为此，本公开提供了一种重组微生物，能够显著提高目标多肽的表达量，实现对任意类型的多肽、蛋白的简单高效表达，并且具有遗传稳定高的优点，解决了芽孢杆菌对外源蛋白的表达量低、无法稳定表达的问题，适合芽孢杆菌对蛋白、酶等大规模的工业化生产。

3、用于解决问题的方案

4、(1)一种重组微生物，其中，所述重组微生物包括：

5、a)整合于所述重组微生物的基因组内的第一基因表达盒，以及

6、b)游离存在于所述重组微生物的细胞内的第二基因表达盒；

7、其中，所述重组微生物来源于芽孢杆菌；

8、所述第一基因表达盒包含用于编码t7 rna聚合酶的第一编码基因，和用于起始所述第一编码基因转录的第一调控元件，所述第一调控元件选自组成型启动子或其具有启动子活性的突变体；

9、所述第二基因表达盒包含用于编码目标多肽的第二编码基因，和被所述t7 rna聚合酶特异性识别的第二调控元件，所述第二调控元件用于起始所述第二编码基因的转录。

10、(2)根据(1)所述的重组微生物，其中，所述重组微生物来源于枯草芽孢杆菌。

11、(3)根据(1)或(2)所述的重组微生物，其中，所述组成型启动子选自组成型强启动子或其具有启动子活性的突变体；可选地，所述组成型强启动子选自如下任意一种的启动子或其具有启动子活性的突变体：p43启动子、papre启动子、pgroes启动子、pylb启动子、psigx启动子。

12、(4)根据(1)-(3)任一项所述的重组微生物，其中，所述第二调控元件选自t7启动子或t7 lac启动子；优选地，所述第二基因表达盒连接于所述重组微生物内的游离型表达载体上；更优选地，所述游离型表达载体的拷贝数≤10。

13、(5)根据(4)所述的重组微生物，其中，所述第二调控元件为t7 lac启动子，所述第二基因表达盒与lac基因表达盒可操作地连接。

14、(6)根据(1)-(5)任一项所述的重组微生物，其中，所述t7 rna聚合酶包含如下(i)-(ii)组成的组中任一项所示的氨基酸序列：

15、(i)如seq id no：1所示的氨基酸序列，

16、(ii)如seq id no：1所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且编码具有t7 rna聚合酶活性的多肽的突变体序列；

17、可选地，所述第一编码基因包含如下(iii)-(iv)组成的组中任一项所示的核苷酸序列：

18、(iii)如seq id no：2所示的核苷酸序列，

19、(iv)与(iii)所示的核苷酸序列相比，具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；

20、可选地，所述第一调控元件包含如下(v)-(vi)组成的组中任一项所示的核苷酸序列：

21、(v)如seq id no：3-4任一项所示的核苷酸序列，

22、(vi)与(v)所示的核苷酸序列相比，具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；

23、可选地，所述第二调控元件包含如下(vii)-(viii)组成的组中任一项所示的核苷酸序列：

24、(vii)如seq id no：5-6任一项所示的核苷酸序列，

25、(viii)与(vii)所示的核苷酸序列相比，具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％序列同一性的核苷酸序列。

26、(7)根据(1)-(6)任一项所述的重组微生物，其中，所述目标多肽包括葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，磷酸葡萄糖异构酶，c4-差向异构酶，磷酸酶，磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，异淀粉酶，葡萄糖苷转移酶、葡萄糖激酶，α-淀粉酶，β-淀粉酶，β-葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖异构酶，l-阿拉伯糖异构酶，d-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，d-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶中的至少一种。

27、(8)根据(1)-(7)任一项所述的重组微生物，其中，所述重组微生物还具有如下c)-f)中至少一项所示的特性：

28、c)降低或消失的芽孢生成相关基因的表达水平，或其编码蛋白的蛋白活性；

29、d)降低或消失的表面活性肽合成相关基因的表达水平，或其编码蛋白的蛋白活性；

30、e)降低或消失的胞外蛋白酶相关基因的表达水平，或其编码蛋白的蛋白活性；

31、f)增强的感受态相关基因的表达水平，或其编码蛋白的蛋白活性；

32、可选地，所述芽孢生成相关基因为spoiiac基因；

33、可选地，所述表面活性肽合成相关基因为srfac基因；

34、可选地，所述胞外蛋白酶相关基因选自apre基因和npre基因中的至少一种；

35、可选地，所述感受态相关基因为comk基因；优选地，所述重组微生物内的所述comk基因与pxyla启动子可操作地连接。

36、(9)一种根据(1)-(8)任一项所述的重组微生物的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：

37、选择来源于芽孢杆菌的出发菌株，将第一基因表达盒整合到所述出发菌株的基因组中，得到中间菌株；

38、向中间菌株中转入包含第二基因表达盒的游离型表达载体，得到重组微生物。

39、(10)根据(9)所述的方法，其中，所述方法还包括如下至少一个的步骤：

40、敲除或敲减所述重组微生物内芽孢生成相关基因；

41、敲除或敲减所述重组微生物内表面活性肽合成相关基因；

42、敲除或敲减所述重组微生物内胞外蛋白酶相关基因；

43、向所述重组微生物的基因组上整合感受态相关基因；

44、可选地，所述芽孢生成相关基因为spoiiac基因；

45、可选地，所述表面活性肽合成相关基因为srfac基因；

46、可选地，所述胞外蛋白酶相关基因选自apre基因和npre基因中的至少一种；

47、可选地，所述感受态相关基因为comk基因；

48、优选地，所述重组微生物内的所述comk基因与pxyla启动子可操作地连接。

49、(11)根据(1)-(8)任一项所述的重组微生物，或根据(9)-(10)任一项所述的方法制备的重组微生物在表达目标多肽，或制备用于表达目标多肽的产品中的用途；

50、可选地，所述目标多肽包括葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，磷酸葡萄糖异构酶，c4-差向异构酶，磷酸酶，磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，异淀粉酶，葡萄糖苷转移酶、葡萄糖激酶，α-淀粉酶，β-淀粉酶，β-葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖异构酶，l-阿拉伯糖异构酶，d-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，d-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶中的至少一种。

51、(12)一种制备目标多肽的方法，其中，所述方法包括利用如(1)-(8)任一项所述的重组微生物，或根据(9)-(10)任一项所述的方法制备的重组微生物进行发酵反应的步骤；

52、可选地，所述方法还包括：从所述发酵反应液中分离目标多肽的步骤。

53、优选地，在诱导剂存在的条件下进行所述发酵反应。

54、发明的效果

55、在一些实施方式中，本公开提供的重组微生物，通过优化芽孢杆菌表达系统，能够显著提高目标多肽的表达量，实现对任意类型的多肽、蛋白的简单高效表达，并且本公开中重组微生物的遗传稳定高，能够实现对目标多肽的稳定表达，解决了芽孢杆菌对外源蛋白的表达量低、无法稳定表达的问题，适合芽孢杆菌对蛋白、酶等大规模的工业化生产。

56、在一些优选的实施方式中，本公开对枯草芽孢杆菌进行改造，得到了能够稳定、高效表达目标多肽的重组微生物。

57、在一些实施方式中，第一基因表达盒由组成型强启动子控制t7 rna聚合酶的编辑基因的表达，第一基因表达盒整合于芽孢杆菌的基因组上，可稳定高效表达t7 rna聚合酶，不受诱导剂影响。第二基因表达盒连接于重组微生物胞内的游离载体上，受t7 rna聚合酶转录调控，实现对异源目标多肽的稳定、高效表达。

58、在一些实施方式中，本公开提供的重组微生物，通过对芽孢杆菌中与芽孢生成相关基因、表面活性肽合成相关基因、胞外蛋白酶相关基因、感受态相关基因等的进一步调控，可进一步提高重组微生物转化产生目标多肽的效率，减少目标多肽的降解。

59、在一些实施方式中，本公开提供的重组微生物，能够进行高密度发酵，显著提高各类外源蛋白的产量。

60、在一些实施方式中，本公开提供的制备重组微生物的方法，具有基因操作步骤简单、易于实施等优点，可简单、高效实现对芽孢杆菌表达系统的改造。

61、在一些优选的实施方式中，本公开提供的制备重组微生物的方法，可简单、高效实现对枯草芽孢杆菌表达系统的改造。

62、在一些实施方式中，本公开提供的制备目标多肽的方法，利用本公开中的重组微生物，可实现对目标多肽的高密度发酵，高效、稳定获得大规模产量的各种类型的外源目标多肽。