一种花生WRKY转录因子AhWRKY30及其在烟草抗青枯病中的应用

一种花生wrky转录因子ahwrky30及其在烟草抗青枯病中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种花生wrky转录因子ahwrky30及其在烟草抗青枯病中的应用。


背景技术：

2.花生（arachis hypogaea l.）是世界四大油料之一的大宗经济作物，对保障我国粮油安全具有重要作用。由青枯雷尔氏菌（ralstonia solanacearum）引起的青枯病是严重影响花生产量的维管束细菌性病害，发生范围遍及我国13个花生主要生产种植区，可造成花生减产10-30%，严重危害时可导致大幅度减产甚至绝收。培育和种植高抗青枯病的花生品种是防治青枯病的最绿色安全、经济有效的方法，因此挖掘抗病相关候选基因并明确其抗病功能对花生抗青枯病品种的选育和遗传改良具有重要理论指导意义。
3.wrky类转录因子是一类植物特有的且数量庞大的转录因子家族，仅在模式植物拟南芥中就有90个wrky类转录因子。wrky家族转录因子包含由约60 个高度保守的氨基酸残基组成的wrky 保守结构域，该保守域含有wrkygqk结构和非典型的锌指结构（cx4
–
5cx22
–
23hxh 或 cx7cx23hxc），进一步根据wrkygqk结构个数、c端锌指结构特征及初级氨基酸序列分为wrky i类、wrky ii类（iia、iib、iic、iid 和 iie）与wrky iii类。在拟南芥中，大部分wrky类转录因子能够响应病原菌侵染，如wrky3和wrky4正调控植株对腐生真菌性病害的抗性；wrky38和wrky48负调控植株对细菌性病害的抗性，这暗示wrky类转录因子在植物抗病性具有十分重要的作用[93]。随着研究的深入，发现wrky类转录因子蛋白在抗病反应中能够特异性地识别并结合目标基因的 w-box（(t)tgacc/t）元件或相似元件 wle1（tgac）、wls（gtcta），从而转录激活或抑制相关基因表达来正调控或负调控响应植物抗病性。水稻wrky6与wrky68能与下游报告基因pr1启动子区w-box结合，正向转录激活相关防卫基因表达而增强植株对病原菌的抗性。拟南芥wrky7/11/17通过w-box元件与转录因子bzip28启动子结合而抑制bzip28的转录激活，同时诱导ja信号通路相关基因的表达及抑制sa信号通路相关基因的表达,从而负调控拟南芥对pstdc3000的抗性。此外，wrky类转录因子还是植物免疫调控网络中许多方面的核心组成部分，涉及pti、eti及sar。在拟南芥中，病原菌侵袭时，植株通过prrs识别pamps而触发pti，并通过启动mapk级联信号转导途径的mekk1-mkk1/2-mpk4模块使mpk4-mks1-wrky33复合物的解离，并释放wrky33和mks1，mks1磷酸化wrky33促使wrky33与pad3的启动子区域结合而激发pad3的表达，最终表现抗病性。在大麦中，病原菌侵袭时，植物未激活的r蛋白mla通过rar1、sgt1 和 hsp90改变构象激活后识别病原菌效应子avra触发eti，同时激活的mla通过cc结构域与抑制的wrky1/2发生作用而解除wrky1/2的抑制作用，即受抑制的mapk级联途径触发的pti解除，从而激发防御相关基因的表达而表现抗病。
[0004]
本发明基于前期花生抗青枯病qtl-seq定位锁定的候选区域，结合转录组数据筛选出在抗病品种中受青枯菌诱导上调表达，在感病品种中受青枯菌诱导下调表达的候选转
录因子ahwrky30，构建过量表达载体经农杆菌介导转化烟草可显著增强对青枯菌的抗性，推测ahwrky30基因可能参与花生对青枯菌的防御反应，可为植物抗青枯病遗传改良提供基因资源。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了一种花生wrky转录因子ahwrky30及其在烟草抗青枯病中的应用，将为植物抗青枯病基因工程的提供基因资源，具有重要的应用前景。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种花生wrky转录因子ahwrky30基因，其cds序列长度为1086 bp，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0007]
一种花生wrky转录因子ahwrky30基因编码的蛋白，所述花生wrky转录因子ahwrky30基因编码361个氨基酸的蛋白，具体氨基酸序列如seq id no.2 所示；所述蛋白含wrky 保守结构域wrkygqk和一个锌指结构cx7cx23hxc，属于wrky iii类转录因子。
[0008]
一种含有上述花生wrky转录因子ahwrky30基因的超量表达载体。
[0009]
进一步的，上述超量表达载体的构建方法：基于gateway系统通过bp反应构建入门载体pdonr207-ahwrky30，再经过lr反应构建camv 35s启动子驱动的植物超表达载体pk7wg2.0-ahwrky30。
[0010]
上述花生wrky转录因子ahwrky30基因在植物抗青枯病基因工程中的应用；所述植物包括但不限于烟草、花生。
[0011]
上述花生wrky转录因子ahwrky30基因编码的蛋白在植物抗青枯病中的应用。
[0012]
上述包含上述花生wrky转录因子ahwrky30基因的超量表达载体在植物抗青枯病基因工程中的应用。
[0013]
本发明基于前期花生抗青枯病qtl-seq定位锁定的候选区域，结合转录组数据筛选出的在抗病品种中受青枯菌诱导上调表达，在感病品种中受青枯菌诱导下调表达基因。blast分析表明该基因为花生wrky转录因子中wrky30，命名为ahwrky30。花生ahwrky30基因过量表达能够显著提高烟草对青枯菌的抗性，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。
[0014]
本发明的有益效果在于：基于前期花生抗青枯病qtl-seq定位锁定的候选区域，结合转录组数据筛选出的在抗病品种中受青枯菌诱导上调表达，在感病品种中受青枯菌诱导下调表达的wrky转录因子ahwrky30，经过pcr克隆获得编码该蛋白的cdna序列，通过基于gateway系统的bp和lr反应构建camv 35s启动子驱动ahwrky30基因植物表达载体pk7wg2.0-ahwrky30，将其转化gv3101农杆菌，通过叶盘法将其导入感病烟草品种红花大金元上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种抗性鉴定，结果证明ahwrky30可以正向调控烟草对青枯菌的抗性。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病植物新品种提供了基因资源，具有重要的应用价值。
附图说明
[0015]
图1为基于gateway系统的花生ahwrky30超量表达载体的构建示意图。
[0016]
图2为花生ahwrky30在抗、感青枯病花生品种中的表达差异。*，**分别表明两两均
值差异显著（p《0.05）和差异极显著（p《0.01）；h2o为接种无菌水处理，rs为接种青枯菌处理。
[0017]
图3为花生ahwrky30超量表达（ahwrky30-oe）转基因烟草中增强对青枯菌侵染的抗性。
具体实施方式
[0018]
实施例1 花生wrky转录因子ahwrky30的筛选根据前期花生抗青枯病qtl-seq定位锁定的候选区域，结合转录组数据筛选出的在抗病品种中受青枯菌诱导上调表达，在感病品种中受青枯菌诱导下调表达基因。blast分析表明该基因为花生wrky转录因子中wrky30，命名为ahwrky30。
[0019]
根据其ahwrky30基因预测的cds序列设计引物，进行聚合酶联反应扩增该基因，结果表明，ahwrky30基因的cds序列含有1086个碱基对，编码361个氨基酸，其核苷酸序列如seq id no.1所示。ahwrky30编码的蛋白含wrky 保守结构域wrkygqk和一个锌指结构cx7cx23hxc，属于wrky iii类转录因子，其编码的氨基酸序列如seq id no.2 所示。
[0020]
实施例2构建ahwrky30超量表达载体根据ahwrky30全长基因cds序列，设计特异性引物（ahwrky30-attb1-f: 5
’‑
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggaacaagttagtattgttggtg-3’，ahwrky30-attb2-r: 5
’‑
ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaggagtttatggagtaataattatc-3’）以抗青枯病栽培种花生粤油92的cdna为模板进行pcr扩增，采用takara公司高保真酶primestar
®
max进行扩增，pcr反应体系：1
ꢀµ
l的cdna为模板，10
ꢀµ
l的 2
×
primestar
®
max mix，正反引物各0.5
ꢀµ
l，补水至20
ꢀµ
l。反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 30 s， 60℃ 30 s，72℃ 2 min，28个循环。pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收，将目的基因片段与pdonr207空载连接进行bp反应：纯化后的ahwrky30产物1 μl（80~100 ng），pdonr207空载体1 μl，bp酶0.25 μl，25℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序，测序正确的克隆提取质粒，构建入门载体pdonr207-ahwrky30。将入门载体质粒和植物超量表达载体pk7wg2.0进行lr反应：pdonr207-ahwrky30质粒1 μl（80~100 ng），pk7wg2.0空载1 μl，lr酶0.25 μl，25℃连接过夜，转化大肠杆菌，验证阳性克隆，构建植物超表达载体pk7wg2.0-ahwrky30。pk7wg2.0-ahwrky30超量表达载体的构建过程示意图如图1所示。
[0021]
实施例3 ahwrky30在抗、感青枯病花生品种青枯菌侵染后的表达模式分析为了分析ahwrky30基因在抗、感青枯病花生品种响应青枯菌（青枯雷尔氏菌（ralstonia solanacearum））侵染的表达差异，本发明分别接种青枯病菌处理高抗青枯病的花生品种 yy92 和易感青枯病的花生品种xhxl的6~8叶期的花生幼苗，采取实时荧光定量pcr方法分析ahwrky30受青枯菌诱导的表达情况。设计该基因的荧光定量pcr引物（ahwrky30-qpcr-f：5
’‑
gaagctttgatagagaagatactttc-3’，ahwrky30-qpcr-r：5
’‑
tgctttgtccacattgacatagtc-3’）。采用ctab法提取青枯菌（青枯雷尔氏菌（ralstonia solanacearum））侵染前后花生叶片总rna，根据primescript
™ꢀ
reverse transcriptase逆转录酶（takara）说明书将1
ꢀµ
g的总rna进行逆转录合成单链cdna，将单链cdna稀释10倍，2
ꢀµ
l为模板，以ahactin为内参基因（ahactin-f:5
’‑
gaggagaagcagaagcaagttg-3’, ahactin-r: 5
’‑
agacagcatatcggcactcatc-3’），采用abi7500实时荧光定量pcr仪进行定量pcr反应，
按照takara公司sybr
®ꢀ
premix ex taq
™
试剂盒方案操作，20
ꢀµ
l的反应体系包括10
ꢀµ
l 2
×
sybr premix ex-taq buffer，正反引物各0.5
ꢀµ
l，补水到20
ꢀµ
l。qrt-pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃ 15s， 60℃ 15 s，72℃ 30s，40个循环。相对表达量采用2
‑△△
ct
（livak）法计算。其中
△△
ct= (ct
gene
ꢀ‑ꢀ
ct
actin
)
处理
ꢀ‑ꢀ
(ct
gene
ꢀ‑ꢀ
ct
actin
)
对照
。结果显示在抗病品种yy92上，ahwrky30基因的表达在接种72 h内呈现上调的趋势，在青枯菌诱导瞬间上调约1.8倍，3 h、24 h、和48 h分别上调2.51倍、2.56倍和3.23倍，72h上调至最大约3.46倍；在感病品种xhxl上，ahwrky30基因的表达在接种72 h内整体呈现先上调再下调的趋势，在1 h、3 h、6 h和12 h分别上调4.41倍、1.84倍、4.33倍和2.44倍，在48 h和72 h下调1.56倍，这表明该基因在抗、感品种受青枯菌的侵染表达差异明显，尤其在抗病品种中上调显著，预测该基因可能参与正向调控花生对青枯菌的抗性（图2）。
[0022]
实施例4 超量表达ahwrky30转基因烟草对青枯菌的抗性分析将实施例2中超表达载体pk7wg2.0-ahwrky30转化农杆菌gv3101，通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化至感青枯病烟草红花大金元，通过卡那霉素筛选和转基因分子鉴定获得阳性转基因株系，共获得了65株ahwrky30-oe转基因阳性烟草植株。通过伤根灌根法和叶脉注射法对野生型和t0代转基因烟草进行青枯菌接种处理，置于高温高湿条件下生长以便青枯菌发病，15 d后观察发病情况。根据烟草青枯病发病程度等级统计野生型与转基因烟草的发病情况，并根据所得数据计算各自的病情指数。结果表明ahwrky30基因超量表达转基因烟草植株相对于野生型对照对青枯菌的抗性显著增强，野生型烟草出现整株萎蔫甚至死亡。通过叶脉注射法和伤根灌根法对转基因植株接种青枯菌35 d后的病情指数分别为37.77%、33.95%，而野生型植株的病情指数分别为57.77%、53.70%，说明过表达ahwrky30可以明显增强烟草对青枯病的抗性（图3）。
[0023]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。