一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体的制作方法

1.本发明涉及农业微生物技术领域，具体为一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体。


背景技术：

2.鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(riemerella anatipestifer)引起的水禽及火鸡等家禽的细菌性疾病，在自然条件下，该病主要通过污染的饲料、飞沫和尘土等，经呼吸道和消化道或皮肤伤口感染，也能通过种蛋进行垂直传播，一年四季都有发生，给养殖业带来了不可估量的经济损失，目前鸭疫里默氏杆菌在全国均有流行，血清型也不尽相同，我国主要流行的血清型为ra1型，不同血清型的菌株之间无交叉保护作用，给疫苗预防增加了很大难度，所以利用抗生素进行预防和治疗成为控制鸭疫里默氏杆菌感染和流行的重要手段，但近年来抗生素不合理的使用很大程度上增加了多重耐药菌株的出现和传播，再加上国家减抗限抗令的颁布与实施，因此临床上亟需寻找出一种新的防治鸭传染性浆膜炎的制剂。
3.噬菌体是一种感染细菌、真菌、放线菌、藻类等微生物的病毒，在发现之初就被用来治疗细菌性感染，并且取得了良好效果，噬菌体作为抗菌剂，具有如下优于抗生素的特性：
4.(1)噬菌体具有很强的专一性，不会对机体正常菌群造成损害；
5.(2)高频率的突变使得噬菌体能够与宿主细菌共同进化，极大地减少了获得的抗性；
6.(3)噬菌体广泛存在于自然环境中，使得新噬菌体的分离和开发相对快速且成本低；
7.(4)噬菌体个体微小，可渗透药物分子无法穿透的区域，例如血脑屏障，给药后能全身分布，迅速到达感染部位发挥作用。
8.目前公共数据库中已有6000余种噬菌体被详细研究，但这仅仅是自然界庞大病毒库中的“冰山一角”，噬菌体的多样性使其成为迄今为止最有希望的治疗策略之一。
9.中国专利cn 111053790 a中公开了一株致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂及其制备方法，该大肠杆菌噬菌体口服制剂所述噬菌体菌株对于产肠毒素型大肠杆菌etec-k88ac具有较强的裂解作用。
10.中国专利cn 106591241 a中公开了一种新型肠出血性大肠杆菌o157噬菌体，用于防治污水排放中0157的污染或因o157引起的感染。
11.中国专利cn 112029732 a公开了一种耐高温宽裂解普的沙门氏菌噬菌体及其组合物，所述沙门氏菌噬菌体具有良好的耐高温特性，其组合物对沙门氏菌的裂解率达98％以上，可治疗鸡白痢沙门氏菌引起的感染。
12.中国专利cn 108359644 b公开了一种宽谱沙门氏菌噬菌体及其应用，该噬菌体对沙门氏菌具有较强的裂解作用，还可以降低感染鸡白痢的雏鸡的死亡率。
13.中国专利cn 200910111568.x公开了一种鸭疫里氏杆菌敏感的烈性噬菌体及应
用，该噬菌体能对鸭疫里氏杆菌发挥裂解作用，可为防治由鸭疫里氏杆菌所致的传染性浆膜炎提供一种生物疗法。
14.现有防治鸭传染性浆膜炎的手段有疫苗免疫和抗生素药物防控，但因免疫效果不理想以及抗生素耐药性等的问题，使得现有方法不足以有效地防控鸭传染性浆膜炎的发生，故而提出一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体以解决上述问题。


技术实现要素：

15.(一)解决的技术问题
16.针对现有技术的不足，本发明提供了一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体，该鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体可预防雏鸭鸭疫里氏杆菌感染，有效减少浆膜炎的发生，降低雏鸭死亡率。
17.(二)技术方案
18.在本发明的一个方面，提供一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体，其能对鸭疫里氏杆菌发生裂解作用，所述噬菌体命名为riemerella anatipestiferphage grap2，噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2于2021年11 月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20211478。
19.所述噬菌体以鸭疫里氏杆菌菌株gra116为宿主分离得到，其属于长尾噬菌体，噬菌斑大小为1mm。
20.噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2具有较好的裂解效果，对雏鸭鸭疫里氏杆菌具有防治作用，能应用在鸭疫里氏杆菌所导致的鸭疫里氏杆菌病的预防和治疗中，可以开发出具有应用价值的防治鸭传染性浆膜炎的生物制剂。
21.在本发明的另一个方面，还提供了一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体的分离和纯化方法，包括以下步骤：
22.(1)采集自山东某肉鸭养殖场附近水样30份，每份20ml，5000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液1与同体积的2
×
tsb液体培养基(含10％新生牛血清)及1ml处于对数期的鸭疫里氏杆菌菌液(107cfu/ml)均匀混合，于5％co2培养箱中37℃过夜培养，富集噬菌体；
23.(2)将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液；
24.(3)取滤液100ul与其宿主鸭疫里氏杆菌菌液500ul均匀混合，静置 15min使其与细菌表面的受体充分结合；
25.(4)将上述混合液加入7ml冷却至50℃的tsb半固体琼脂培养基(含 5％新生牛血清)，混匀后立即铺于已凝固的tsa平板上，待琼脂凝固后于5％co2培养箱中37℃倒置培养12-16h，观察噬菌斑生长情况；
26.(5)在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1ml sm液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5ml tsb液体培养基(含5％新生牛血清)中，加入100ul相应的宿主鸭疫里氏杆菌菌液并混匀，5％co2培养箱37℃条件下过夜培养，5000rpm离心 10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态，重复操作 3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
27.(三)有益效果
28.与现有技术相比，本发明提供了一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体，具备以下有益效果：
29.通过噬菌体富集、培养和纯化等方法从山东某大型肉鸭养殖基地附近的 30余份污水样中分离得到1株裂解效果好、对雏鸭鸭疫里氏杆菌具有防治作用的噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2，经过发酵效率测定、温度敏感性测定、ph敏感性测定、裂解谱测定以及其对雏鸭浆膜炎的防治效果研究，确定噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2为一株性能优良、具有应用潜质的噬菌体毒株，噬菌体riemerella anatipestifer phagegrap2对环境适应性及抗逆性强，对鸭疫里氏杆菌的裂解率高达53.8％，对雏鸭传染性浆膜炎具有良好的防治作用，可有效降低鸭疫里氏杆菌感染引起的死亡率，可以开发出具有应用价值的防治鸭传染性浆膜炎的生物制剂。
附图说明
30.图1为本发明中噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2的噬菌斑示意图；
31.图2为本发明中噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2对雏鸭存活率的影响示意图。
具体实施方式
32.下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(riemerella anatipestifer)引起的水禽及火鸡等家禽的细菌性疾病，在自然条件下，该病主要通过污染的饲料、飞沫和尘土等，经呼吸道和消化道或皮肤伤口感染，也能通过种蛋进行垂直传播，目前鸭疫里默氏杆菌在全国均有流行，血清型也不尽相同，所以利用抗生素进行预防和治疗成为控制鸭疫里默氏杆菌感染和流行的重要手段，但近年来抗生素不合理的使用很大程度上增加了多重耐药菌株的出现和传播，再加上国家减抗限抗令的颁布与实施，因此临床上亟需寻找出一种新的防治鸭传染性浆膜炎的制剂，噬菌体作为一种感染细菌、真菌、放线菌、藻类等微生物的病毒，在发现之初就被用来治疗细菌性感染，并且取得了良好效果。
34.基于此，在本发明的一个方面，提供一种鸭传染性浆膜炎防治用噬菌体，该噬菌体以鸭疫里氏杆菌菌株gra116为宿主分离得到，其属于长尾噬菌体，噬菌斑大小为1mm，如图1所示，将该噬菌体命名为riemerella anatipestiferphage grap2，噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072，保藏日期为2021年11月23日，保藏编号为cctcc m 20211478。
35.在本发明的另一方面，还提供了上述噬菌体的分离纯化方法，其包括以下步骤：
36.(1)采集自山东某肉鸭养殖场附近水样30份，每份20ml，5000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液与同体积的2
×
tsb液体培养基(含10％新生牛血清)及1ml处于对数期
的鸭疫里氏杆菌菌液(107cfu/ml)均匀混合，于5％co2培养箱中37℃过夜培养，富集噬菌体；
37.(2)将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液；
38.(3)取滤液100ul与其宿主鸭疫里氏杆菌菌液500ul均匀混合，静置 15min使其与细菌表面的受体充分结合；
39.(4)将上述混合液加入7ml冷却至50℃的tsb半固体琼脂培养基(含 5％新生牛血清)，混匀后立即铺于已凝固的tsa平板上，待琼脂凝固后于5％co2培养箱中37℃倒置培养12-16h，观察噬菌斑生长情况；
40.(5)在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1ml sm液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5ml tsb液体培养基(含5％新生牛血清)中，加入100ul相应的宿主鸭疫里氏杆菌菌液并混匀，5％co2培养箱37℃条件下过夜培养，5000rpm离心 10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态，重复操作 3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
41.对鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2的最佳发酵条件进行测定，步骤如下：
42.(1)挑取宿主鸭疫里氏杆菌单个菌落，接种到盛有3ml tsb培养液(含 5％新生牛血清)的试管中，于5％co2培养箱37℃培养过夜，得到宿主菌悬液；
43.(2)将菌悬液以1:100比例转接到l0ml tsb培养液(含5％新生牛血清)，于5％co2培养箱37℃培养；
44.(3)将噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2稀释至一定的浓度并计数，与宿主菌按照不同比例混合培养，在5％co2培养箱37℃培养过夜，培养结束后5000rpm离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，实验重复3 次。
45.结果如表1所示，噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2浓度为105pfu/ml，宿主菌od600为0.08-0.1之间发酵效价较好，达108pfu/ml 以上。
46.表1不同感染复数下鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2的效价
[0047][0048]
对鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2的ph 稳定性进行试验，步骤如下：
[0049]
(1)取无菌细菌瓶分别加入不同ph(3、4、5、6、7、8、9、10、11) 的tsb培养基9ml后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lml噬菌体纯培养液，于25℃环境中静置4h；
[0050]
(2)分别于第1h、2h和4h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
[0051]
结果如表2所示，鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phagegrap2在ph为5-10范围内处理1h其效价无明显变化，4h后仍具有较高效价。
[0052]
表2反应不同时间噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2的 ph值稳定性(3.8
×
108pfu/ml)
[0053][0054]
对鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2的温度稳定性进行试验，步骤如下：
[0055]
(1)取若干支无菌50ml离心管，各加入45ml tsb后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入5ml噬菌体纯培养液，于5℃、25℃、35℃、 45℃、55℃、65℃、75℃的温度中作用1h、24h、48h、72h和1w；
[0056]
(2)作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
[0057]
结果如表3所示，鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phagegrap2在温度为55℃以下较易存活，在55℃水浴1h后仍有较高的效价，在 5-35℃具有良好的稳定性，可长期保存。
[0058]
表3噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2不同温度下存放后的效价(起始效价：5.1x108pfu/ml)
[0059][0060]
经上述测定，噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2具有较高的发酵效率，实验室小量发酵效价可达5.6x108pfu/ml，并且对ph适应性较强，在ph为5-10时处理1h，效价无影响，处理4h后仍具有较高效价，温度敏感性测定中发现该噬菌体在55℃以下温度中较易存活，35℃温度下可长期保存。
[0061]
此外，还对鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerellaanatipestifer phage grap2 对鸭疫里氏杆菌的裂解范围进行了试验，取效价为1.0x108pfu/ml鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2，采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：
[0062]
(1)挑取华中农业大学微生物与免疫实验室赠予的52株鸭疫里氏杆菌的单克隆，分别接种于盛有3ml tsb(含5％新生牛血清)的离心管中，于5％co2培养箱37℃培养过夜，制得各株细菌菌悬液；
[0063]
(2)取300ul菌悬液分别与tsb半固体(含5％新生牛血清)培养基混合铺于已制备好的tsa平板上，取5ul噬菌体riemerella anatipestifer phagegrap2滴于平板上，待自然风干后于5％co2培养箱37℃培养过夜，观察结果。
[0064]
结果如表4所示，鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phagegrap2可裂解52株鸭疫里氏杆菌中的28株，裂解率为53.8％，说明噬菌体 riemerella anatipestifer phage grap2具有较宽的宿主谱，能为开发出防治由鸭疫里氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎提供优良的生物制剂。
[0065]
表4鸭疫里氏杆菌噬菌体riemerella anatipestifer phage grap2裂解谱测定结果
[0066]
[0067]
[0068]
[0069][0070]
其中，
“‑”
表示不裂解；“+”表示有轻微裂解，裂解斑模糊；“++”表示裂解，裂解斑较为清晰；“+++”表示裂解，裂解斑非常清晰。
[0071]
为检测噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2的临床使用效果，进行临床实验，实验步骤如下：
[0072]
(1)取120只1周龄的雏鸭，随机分为4组，每组30只，分别是治疗组、预防组、攻毒组及空白组；
[0073]
(2)预饲3天后，预防组每天给予108pfu/ml噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2饮水，连续饮用3天；
[0074]
(3)预饲3天后，预防组每天给予108pfu/ml噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2饮水，连续饮用3天；
[0075]
(4)攻毒2h后治疗组给予噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2集中饮水治疗，噬菌体浓度为108pfu/ml，连饮4天，攻毒组及空白组正常饲喂；
[0076]
(5)治疗结束观察5天后统计各组雏鸭存活率，结果见图2，同时解剖存活雏鸭统计肝脏载菌率，结果见表5。
[0077]
表5噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2对雏鸭肝脏载菌率影响
[0078]
组别预防组治疗组攻毒组空白组载菌率07.7％75％0
[0079]
图2结果显示，噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2在预防及治疗由鸭疫里氏杆菌引起的感染中具有良好的效果，无论是预防还是治疗对雏鸭的治愈率达均90％以上，说明噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2可显著提高感染雏鸭的存活率，表5结果显示，噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2可有效清除感染鸭疫里氏杆菌后存活雏鸭肝脏中的细菌，且愈后良好，可开发成防治鸭传染性浆膜炎的生物药物。
[0080]
通过动物攻毒感染模型，验证发现该噬菌体对雏鸭传染性浆膜炎的防治具有良好的作用，可有效降低该病引起的死亡率，减少经济损失，同时，通过裂解谱测定和动物攻毒实验分别验证了噬菌体riemerellaanatipestiferphagegrap2的裂解效果和对动物的保护作用，且噬菌体具有良好的环境适应性及抗逆性，可以开发出具有应用价值的防治鸭传染性浆膜炎的生物制剂。
[0081]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。