鉴定丝瓜种皮颜色的SNP分子标记、KASP引物及其应用

鉴定丝瓜种皮颜色的snp分子标记、kasp引物及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及作物育种技术领域，更具体地说，本发明涉及一种鉴定丝瓜种皮颜色的snp分子标记、kasp引物、以及snp分子标记和kasp引物在丝瓜分子育种中的应用。


背景技术：

2.丝瓜是一种重要的药食兼用的多功能蔬菜。丝瓜种皮富含维生素、氨基酸、微量元素和抗氧化物质，具有清热消暑、止血消炎的功效。近年来，随着人们对营养健康的重视，丝瓜的播种面积逐年增大，特别对于华南地区而言，丝瓜已成为广东、广西、海南、及港澳地区重要的日常消费蔬菜。
3.由于丝瓜杂交种子生产多采用人工授粉的方式进行，导致种子收获及加工过程存在生物学混杂和机械混杂等问题，而对于杂交种的纯度鉴定，不论是田间鉴定还是室内分子标记检测，都是工作量大、成本较高，如果利用白色种皮等作为杂种纯度鉴定的目测标记性状，则可节约纯度鉴定的部分成本。
4.竞争性等位基因特异pcr(kasp)技术是针对等位基因snp位点设计的两端引物，利用实时荧光pcr技术，对底物进行扩增，相应的荧光探针可以与对应引物结合位点相结合，根据检测出的荧光颜色确定扩增产物的基因型，是一种无需电泳新型快速简便方法。
5.因此，开发与丝瓜种皮颜色紧密连锁的snp分子标记，对丝瓜分子育种具有重要的意义。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的目的之一是提供一种鉴定丝瓜种皮颜色的snp分子标记，所述snp分子标记能够用来预测、鉴定和筛选丝瓜种皮颜色性状。
7.实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
8.一种鉴定丝瓜种皮颜色的snp分子标记，所述snp分子标记位于丝瓜第13号染色体第37371324bp碱基，该处碱基为t或g。
9.在其中一些实施例中，所述snp分子标记的tt基因型对应的丝瓜种皮为白色，所述snp分子标记的tg或gg基因型对应的丝瓜种皮为黑色。
10.本发明的另一目的是提供一种鉴定丝瓜种皮颜色的kasp引物，所述kasp引物可以扩增所述snp分子标记。
11.实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
12.一种鉴定丝瓜种皮颜色的kasp引物，所述kasp引物包括：序列如seq id no:1和seq id no:2所示的正向引物、以及序列如seq id no:3所示的反向引物。
13.在其中一些实施例中，所述正向引物5'端连接有荧光分子fam或hex。
14.在其中一些实施例中，所述序列如seq id no:1所示的正向引物的5'端连接有荧光分子fam，所述序列如seq id no:2所示的正向引物的5'端连接有荧光分子hex。
15.本发明还提供了一种鉴定丝瓜种皮颜色的试剂盒，所述试剂盒包括上述鉴定丝瓜种皮颜色的kasp引物。
16.本发明还提供了上述snp分子标记、引物和试剂盒在丝瓜种皮颜色鉴定中的应用。
17.本发明还提供了上述snp分子标记、引物和试剂盒在丝瓜分子标记辅助育种中的应用。
18.本发明还提供了一种鉴定丝瓜种皮颜色的方法，所述方法包括以下步骤：
19.(1)、以待测丝瓜样品的dna为模板，以鉴定丝瓜种皮颜色的kasp引物为引物，进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
20.(2)、分析pcr扩增产物，第13号染色体第37371324bp碱基为t或g。
21.在其中一些实施例中，所述pcr扩增为touchdown pcr，所述touchdown pcr扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65℃-57℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.88℃；94℃20s，57℃60s，30个循环。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明利用结合分子标记bsa-seq的方法，定位到一个控制丝瓜种皮颜色的snp分子标记，并继而开发了扩增该snp分子标记的kasp引物。本发明的snp分子标记具有通用性和准确性，根据snp分子标记和kasp引物，可以直接用于丝瓜种皮颜色和相对应的基因型的鉴定，因此，可以将丝瓜种皮作为杂交种纯度鉴定的标记性状，节约丝瓜纯度鉴定的成本，为丝瓜分子育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
附图说明
24.图1为本发明实施例1中亲本材料的种皮图。
25.图2为本发明实施例1中丝瓜种皮颜色基因定位图。
26.图3为本发明实施例2中利用snp分子标记对f2群体270株单株检测的基因分型图。绿色为白色种皮样本，蓝色为黑色种皮样本，红色为黑色种皮样本，灰色为空白对照，黑色为不能确定。
具体实施方式
27.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
28.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
29.在本发明中的其中一个方面，采用bsa-seq结合分子标记方法，发现与丝瓜种皮颜色相关的snp位点位于13号染色体上，37371324bp位置，该处的碱基为t或g，可作为控制丝瓜种皮颜色的snp分子标记。
30.在本发明的另一方面，根据查找到的与丝瓜种皮颜色相关的snp分子标记，进一步设计了检测snp变异位点的kasp引物。
31.若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明所用原料及试剂均有市售，且任何生物种质材料均可对外作为科研研究加以提供。
32.以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
33.实施例1丝瓜种皮基因snp分子标记定位及kasp引物开发
34.本实施例查找到与丝瓜种皮相关基因的snp位点，并设计针对该snp位点的kasp引物。具体包括以下步骤：
35.1、试验材料
36.以广东省农业科学院蔬菜研究所选育保存的黑色种皮丝瓜资源wk53和白色种皮丝瓜资源wk55(如图1所示)，杂交获得f1，f1自交获得270株f2分离群体。
37.2、丝瓜种皮基因初步定位
38.调查f2群体的果皮颜色。在270株的f2群体中，丝瓜种皮白色的有60株，黑色的有210株，卡方检验(χ2＝0.43，p＝0.51)，符合3:1孟德尔遗传定律，说明丝瓜种皮颜色由一个基因控制。
39.利用f2群体中黑色种皮和白色种皮各30株，提取dna，构建两个dna池并进行混池测序(bsa-seq)。筛选出子代与双亲纯合且差异的snp位点，并计算出显性池与隐性池的snp-index值。将隐性池与显性池的snp-index值相减，得到
△
snp-index值，计算2个子代池snp-index的差值δsnp-index。选择1mb为窗口，1kb为步长，进行滑窗分析，计算每个窗口中δsnp-index的平均值来反应δsnp-index分布，将丝瓜种皮基因定位于13号染色体上23.5mb-36.4mb(99％置信水平)区间内(如图2)。
40.根据两个亲本的全基因组重测序数据，查找该定位区间内的snp变异位点。在37371324bp位置查找到一个snp位点变异t/g。
41.3、设计kasp引物
42.根据37371324bp位置snp位点上下游300bp的序列，利用primerpremier5.0软件设计kasp引物。
43.引物序列如下，其中ft的5'端连接有荧光分子fam，fg的5'端连接有荧光分子hex：
44.m3737ft(seq id no:1)：
45.gaaggtgaccaagttcatgctgggacgctactcttggagct
46.m3737fg(seq id no:2)：
47.gaaggtcggagtcaacggattggacgctactcttggagcg
48.m3737r(seq id no:3)：cgctgtgactgctgccaa
49.实施例2实施例1的丝瓜种皮基因snp分子标记及kasp引物的验证
50.通过f2群体(270个单株)及18份丝瓜材料，对实施例1查找到的snp分子标记及kasp引物进行验证。
51.具体包括如下步骤：
52.1、分别以f2群体(270个单株)和18份丝瓜材料基因组dna为模板，利用分子标记的扩增引物kasp引物，进行touchdown pcr扩增，获得扩增产物；
53.pcr扩增的反应体系如表1所示。
54.表1 pcr扩增反应体系
[0055][0056]
pcr扩增的反应程序如表2所示。
[0057]
表2扩增反应条件
[0058][0059]
2、对扩增产物进行检测与分析
[0060]
使用tecan infinite m1000酶标仪读取荧光信号，出现了3种荧光信号。在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果检测。
[0061]
利用实施例1的snp分子标记及kasp引物，对f2分离群体(270个单株)进行检测，对f2分离群体(270个单株)进行检测，其中t:t的荧光信号有61个单株，t:g的荧光信号有146个单株，g:g的荧光信号有63个单株。结合270个单株表型分析发现，有5株基因型与表型不符，其他单株与wk55基因型相同的表现为白色种皮，与wk53基因型相同或是杂合表现为黑色种皮，检测结果与表型一致的准确率为98.15％(265/270)。
[0062]
利用实施例1的snp分子标记及kasp引物，对18份种质资源进行检测，其中t:t的荧光信号有4个单株，t:g的荧光信号有2个单株，g:g的荧光信号有12个单株。其中17株表型与基因型相符合，只有1株表型与基因型不符合，检测结果与表型一致的准确率为94.44％(17/18)。
[0063]
丝瓜种皮颜色基因分型结果如图3所示，图中左上角的分型结果为t:t，对应的材料丝瓜种皮颜色为白色，图中中间部分型结果为t:g，对应的丝瓜种皮颜色为黑色，图中右下角的分型结果为g:g，对应的丝瓜种皮颜色为黑色，可见，利用该snp分子标记可用于区分丝瓜种皮颜色。
[0064]
以上结果充分说明，实施例1的snp分子标记，t与白色种皮性状紧密连锁，变异位
点g或者杂合与黑色种皮性状紧密连锁，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到的t:t荧光信号的材料，就能够选育出白色种皮的丝瓜材料。保留检测到g:g荧光信号的材料，就能够选育出黑色种皮的纯合丝瓜材料。保留检测到t:g荧光信号的材料，就能够选育出黑色种皮的杂合丝瓜材料，通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
[0065]
本发明的snp分子标记具有通用性和准确性，能够用来预测、鉴定和筛选丝瓜种皮颜色性状，在苗期可以有效地进行筛选，提高了工作效率，减少后期种植的人力物力财力。
[0066]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0067]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。