一种利用荧光定量PCR检测多基因位点突变的方法与流程

一种利用荧光定量pcr检测多基因位点突变的方法
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种利用荧光定量pcr检测多基因位点突变的方法。


背景技术：

2.随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，鉴定并描述的人类致病基因和药物相关基因越来越多，基因突变作为基因发生的可遗传或体细胞变异，往往可以导致基因的功能发生改变，因此通过对有显著功能意义的基因突变进行检测，可以推动临床疾病的预防、诊断和治疗，这已成为当今生命科学研究的热点之一。
3.目前使用较多的检测方法是采用等位基因特异性引物pcr对基因突变位点进行检测，该方法是利用与等位基因序列互补的引物，对待测样本dna进行特异性pcr扩增，等位基因特异性引物仅与其匹配的特异突变序列结合并特异性地扩增出等位基因特异性片段，用琼脂糖凝胶电泳对特异性pcr扩增产物进行检测，根据特异性pcr扩增产物的出现与否，对待测样本的基因型进行判断。这种方法操作简单、耗时短、对设备要求不高，但缺点是反应条件不易控制、检测灵敏度低、通量不足、无法检测未知突变。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种利用荧光定量pcr检测多基因位点突变的方法，克服了现有技术的不足，采用本发明的特殊引物、探针结构，能够显著减少非特异性扩增，提高了区别野生型和突变型序列的能力，能够检测未知突变，其检测灵敏度可低至0.01％。
5.为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
6.一种利用荧光定量pcr检测多基因位点突变的方法，所述方法包括正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针，对每个目标位点的全面检测，通过对pcr产物的熔解曲线tm值差异进行判读，来确定每个位点的阴阳性情况；
7.其中，所述正向特异引物的长度为15-25个碱基，其序列和待测序列一条链互补；
8.所述反向特异引物的长度为15-25个碱基，其序列和待测序列的另一条链互补，所述的正向特异引物和反向特异引物的tm值均为50-65℃，且二者的tm值的差≤5℃；
9.所述特异性荧光探针的长度为35-50个碱基，其序列和野生型待测序列互补，包括blocker部分和reporter部分，所述特异性荧光探针的tm值比正向特异性引物的tm值高15-25℃。
10.本发明设计提供了引物结构，本发明设计的引物结构可以用于实时定量pcr中多基因位点突变的扩增检测。目前适用的实时定量pcr仪器包括：applied biosystems(abi)公司的7300、7500、7700、7900，bio-rad公司的cfx96、iq cycler,roche公司的lightcycler2.0、lightcycler480，上海宏石医疗科技有限公司的slan-96s等。
11.进一步，所述正向特异性引物和反向特异性引物可以被脱氧次黄嘌呤修饰、脱氧尿嘧啶修饰、硫代修饰、磷酸化修饰、氨基修饰、巯基修饰、间臂修饰中的任意一种方式修
饰，也可以是多种方式同时修饰。
12.进一步，所述特异性荧光探针可以被硫代修饰、脱氧脲嘧啶修饰、脱氧次黄嘌呤修饰、2-甲氧基修饰、磷酸化修饰中的任意一种方式修饰，也可以是多种方式同时修饰。
13.进一步，优化后的特异性荧光探针结构，还可以实现对于未知突变类型的检测。所述blocker部分的长度为15-20个碱基，包括人工引入的2-6个任意碱基序列，其它位点和野生型待测序列互补。若在应与野生型待测序列互补的范围内，还同时存在其他的indel/snp突变类型，则本检测方法可以同时一并检出所有探针覆盖范围内的变异类型。
14.进一步，所述blocker部分的5’端引入茎环结构，且茎环结构的长度为3-10个碱基，其序列和blocker其中一部分序列互补。
15.进一步，所述blocker部分的5’端引入淬灭基团，淬灭基团的标记为tamra、bhq1、bhq2、mgb、dabcyl、bhq3中的一种。
16.进一步，所述reporter部分的5’端带有荧光报告基团，其长度20-30个碱基，其序列和野生型待测序列互补。
17.进一步，所述荧光报告基团的标记为fam、hex、vic、rox、tamra、cy5中的一种。
18.本发明设计了特殊的引物和探针结构，在合适的退火温度条件下，探针先于引物与dna模版结合，正向特异引物可与待测序列一条链进行结合，反向特异引物可与待测序列的另一条链结合。对于突变型dna模版序列，在合适的延伸温度条件下，与靶序列结合的正向特异引物不受探针影响，具有延伸能力；对于野生型序列，在设定的延伸温度条件下，与dna模版靶序列结合的正向特异引物，其延伸能力被抑制。上述反应过程将突变模版dna进行富集和放大，从而提高了检测的灵敏度。
19.本发明与现有技术相比较，具有以下有益效果：
20.本发明采用本发明的特殊引物、探针结构，能够显著减少非特异性扩增，提高了区别野生型和突变型序列的能力，其检测灵敏度可低至0.01％。同时在多重pcr反应体系下，仍能保持各位点的检测特异性和灵敏度水平。对于未知突变的检测潜力，则更加延伸了本发明的应用范围。
21.本发明可以在一管反应中同时对多个基因的多个位点进行检测。针对每个待测位点设计一组正、反向特异引物和荧光探针，实现对每个目标位点的全面检测，最终通过对pcr产物熔解曲线tm值差异的判读，确定每个位点的阴阳性情况；而对于tm值相同的目标位点，则通过改变探针的荧光报告基团类型，在不同的荧光标记通道中，实现一管反应中同时检测多个基因位点的突变情况。
22.本发明具有检测方法新颖、检测灵敏度高、通量大、成本低、速度快等特点，可以应用于检测肿瘤患者外周血样本中的循环肿瘤dna(ctdna)的突变情况，具有良好的市场前景和应用价值。
附图说明
23.图1为本发明的引物、探针结构示意图；
24.图2为实施例1egfr c797s的熔解曲线；
25.图3为实施例2egfr t790m和egfr l858r多重pcr的熔解曲线；
26.图4为实施例3kras g12的熔解曲线。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.如图1所示，本发明公开了一种利用荧光定量pcr检测多基因位点突变的方法，方法包括正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针，对每个目标位点的全面检测，通过对pcr产物的熔解曲线tm值差异进行判读，来确定每个位点的阴阳性情况；
29.其中，正向特异引物的长度为15-25个碱基，其序列和待测序列一条链互补；
30.反向特异引物的长度为15-25个碱基，其序列和待测序列的另一条链互补，正向特异引物和反向特异引物的tm值均为50-65℃，且二者的tm值的差≤5℃；
31.特异性荧光探针的长度为35-50个碱基，其序列和野生型待测序列互补，包括blocker部分和reporter部分，特异性荧光探针的tm值比正向特异性引物的tm值高15-25℃。
32.本发明设计提供了引物结构，本发明设计的引物结构可以用于实时定量pcr中多基因位点突变的扩增检测。目前适用的实时定量pcr仪器包括：applied biosystems(abi)公司的7300、7500、7700、7900，bio-rad公司的cfx96、iq cycler,roche公司的lightcycler2.0、lightcycler480，上海宏石医疗科技有限公司的slan-96s等。
33.正向特异性引物和反向特异性引物可以被脱氧次黄嘌呤修饰、脱氧尿嘧啶修饰、硫代修饰、磷酸化修饰、氨基修饰、巯基修饰、间臂修饰中的任意一种方式修饰，也可以是多种方式同时修饰。
34.特异性荧光探针可以被硫代修饰、脱氧脲嘧啶修饰、脱氧次黄嘌呤修饰、2-甲氧基修饰、磷酸化修饰中的任意一种方式修饰，也可以是多种方式同时修饰。
35.优化后的特异性荧光探针结构，还可以实现对于未知突变类型的检测。blocker部分的长度为15-20个碱基，包括人工引入的2-6个任意碱基序列，其它位点和野生型待测序列互补。若在应与野生型待测序列互补的范围内，还同时存在其他的indel/snp突变类型，则本检测方法可以同时一并检出所有探针覆盖范围内的变异类型。
36.blocker部分的5’端引入茎环结构，且茎环结构的长度3-10个碱基，其序列和blocker其中一部分序列互补。
37.blocker部分的5’端引入淬灭基团，淬灭基团的标记为tamra、bhq1、bhq2、mgb、dabcyl、bhq3中的一种。
38.reporter部分的5’端带有荧光报告基团，其长度20-30个碱基，其序列和野生型待测序列互补。
39.荧光报告基团的标记为fam、hex、vic、rox、tamra、cy5中的一种。
40.本发明设计了特殊的引物和探针结构，在合适的退火温度条件下，探针先于引物与dna模版结合，正向特异引物可与待测序列一条链进行结合，反向特异引物可与待测序列的另一条链结合。对于突变型dna模版序列，在合适的延伸温度条件下，与靶序列结合的正向特异引物不受探针影响，具有延伸能力；对于野生型序列，在设定的延伸温度条件下，与dna模版靶序列结合的正向特异引物，其延伸能力被抑制。上述反应过程将突变模版dna进
行富集和放大，从而提高了检测的灵敏度。
41.本发明依据的基本原理是：在不对称扩增的pcr反应体系下，正向特异引物和反向特异引物用量不同，增加了野生型扩增的难度，加之荧光探针特殊的结构，又可以进一步抑制野生型dna序列的扩增。对于野生型dna序列，探针与其结合形成牢固的双链结构，由于匹配的探针对dna模版亲和力更高，因此无法实现正向特异引物的延伸，使扩增反应受到损害，抑制了pcr反应。对于探针和突变型dna序列结合形成的双链结构，正向引物延伸作用超过探针与dna模版的结合能力，从而产生扩增子。其中，探针位于正、反向引物之间且具有一定距离，或与正、反向引物之一相邻。
42.由于不同核酸分子的片段长度、gc含量以及碱基互补配对情况存在差异性，使不同pcr产物在加热变性时，其解链温度(tm值)不同。根据pcr产物形成的独特熔解曲线的形状与位置，进行tm值的判读，确定dna模版的具体突变类型。
43.此外，本技术还可以应用于多重pcr，实现多个位点突变情况的同时检测。由于不同产物tm值不同，因此可对检测范围内的位点阴阳性情况进行判读。对于tm值相同的pcr产物，可通过改变探针的荧光报告基团类型的方式加以区分，仍然可以准确判读每个设计位点的阴阳性情况。
44.实施例1
45.采用本发明的正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针用于egfr基因c797s突变的检测。
46.为考察本发明的正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针对实时定量pcr体系特异性和灵敏度的影响，故设计1对针对egfr基因c797s突变的特异引物，扩增片段长度为130bp，同时根据egfr基因野生型序列设计荧光探针，pcr模版为血浆游离dna。
47.反应液配方：
48.物料浓度用量体积(μl)pcr缓冲液10
×
2.5dntp25mm2.0taq酶1.0u1.0正向特异引物f2μm0.6反向特异引物r10μm0.8特异性荧光探针10μm0.5ddh2o纯化水7.6总体积/15.0
49.操作步骤：反应液按照上述配方进行制备，以每管15μl的量分装到pcr反应管中，分别加入需要检测的样品45μl，然后小心盖上pcr管盖，振荡数秒后，快速离心。将pcr反应管放置于实时定量pcr仪器中。
50.实时pcr反应在上海宏石医疗科技有限公司的slan-96s全自动医用pcr分析系统上进行(国械注准20183401659)。
51.第一阶段：95℃,3min。
52.第二阶段：50cycles：95℃,30s；78℃,20s；65℃,30s；68℃,45s。
53.第三阶段：95℃,1min；40℃,30s；1％速率升温至95℃。
54.其中，
55.正向特异引物为：
[0056]5’‑
ccgtgcagctcatcacgcag-3’,
[0057]
反向特异引物为：
[0058]5’‑
ccttccctgattacctttgcga-3’,
[0059]
特异性荧光探针为：
[0060]5’‑
ggccccttcggctnnngcctcctggactatgtccgggaac-3’[0061]
结果的判定方法为：
[0062]
扩增曲线：突变型游离dna的ct值越小，表明其扩增效率越高；野生型游离dna的扩增曲线未过基线(no ct)，表明其扩增被抑制。
[0063]
熔解曲线(见图2)：egfr基因c797s突变型游离dna的熔解曲线在58℃出现峰值；野生型游离dna的熔解曲线无峰值。
[0064]
实施例2
[0065]
采用本发明的正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针用于egfr基因t790m和l858r突变的检测。
[0066]
为考察本发明的正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针对实时定量pcr体系特异性和灵敏度的影响，故分别设计1对针对egfr基因t790m和l858r突变的特异引物，扩增片段长度分别为126bp和129bp，同时根据egfr基因野生型序列分别设计覆盖此两个位点的荧光探针，pcr模版为血浆游离dna。
[0067]
反应液配方：
[0068]
[0069][0070]
操作步骤：反应液按照上述配方进行制备，以每管15μl的量分装到pcr反应管中，分别加入需要检测的样品45μl，然后小心盖上pcr管盖，振荡数秒后，快速离心。将pcr反应管放置于实时定量pcr仪器中。
[0071]
实时pcr反应在上海宏石医疗科技有限公司的slan-96s全自动医用pcr分析系统上进行(国械注准20183401659)。
[0072]
第一阶段：95℃,3min。
[0073]
第二阶段：50cycles：95℃,30s；76℃,20s；65℃,30s；62℃,45s。
[0074]
第三阶段：95℃,1min；40℃,30s；1％速率升温至95℃。
[0075]
其中t790m位点，
[0076]
正向特异引物为：
[0077]5’‑
cgcctgctgggcatctg-3’,
[0078]
反向特异引物为：
[0079]5’‑
ccagttgagcaggtactggg-3’,
[0080]
特异性荧光探针为：
[0081]5’‑
tgcctcatcacnnnngcagctcatgcccttcggctgcctcctg-3’[0082]
其中l858r位点，
[0083]
正向特异引物为：
[0084]5’‑
acaccgcagcatgtcaagat-3’,
[0085]
反向特异引物为：
[0086]5’‑
ggtgtcaggaaaatgctggc-3’,
[0087]
特异性荧光探针为：
[0088]5’‑
gccttttgggctnnnnnggccaaactgctgggtgcggaagagaaaga-3’[0089]
结果的判定方法为：
[0090]
扩增曲线：突变型游离dna的ct值越小，表明其扩增效率越高；野生型游离dna的扩
增曲线未过基线(no ct)，表明其扩增被抑制。
[0091]
熔解曲线(见图3)：t790m阳性样本的熔解曲线在58℃附近出现峰值；l858r阳性样本的熔解曲线在69℃附近出现峰值；t790m和l858r均为阳性的样本，其熔解曲线在58℃和69℃附近均出现峰值；野生型游离dna的熔解曲线无峰值。
[0092]
实施例3
[0093]
采用本发明的正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针用于kras基因g12突变的检测。
[0094]
为考察本发明的正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针对实时定量pcr体系特异性和灵敏度的影响，故设计1对针对kras基因g12突变的特异引物，扩增片段长度为124bp。同时根据kras基因野生型序列设计荧光探针。pcr模版为血浆游离dna。
[0095]
反应液配方：
[0096][0097][0098]
操作步骤：反应液按照上述配方进行制备，以每管15μl的量分装到pcr反应管中，分别加入需要检测的样品45μl，然后小心盖上pcr管盖，振荡数秒后，快速离心。将pcr反应管放置于实时定量pcr仪器中。
[0099]
实时pcr反应在上海宏石医疗科技有限公司的slan-96s全自动医用pcr分析系统上进行(国械注准20183401659)。
[0100]
第一阶段：95℃,3min。
[0101]
第二阶段：50cycles：95℃,30s；72℃,20s；60℃,30s；56℃,45s。
[0102]
第三阶段：95℃,1min；40℃,30s；1％速率升温至95℃。
[0103]
其中，
[0104]
正向特异引物为：
[0105]5’‑
ggcctgctgaaaatgact-3’,
[0106]
反向特异引物为：
[0107]5’‑
cctctattgttggatcatattcg-3’,
[0108]
特异性荧光探针为：
[0109]5’‑
gccaggagctggnnntggcgtaggcaagagtgccttgacg-3’[0110]
结果的判定方法为：
[0111]
扩增曲线：突变型游离dna的ct值越小，表明其扩增效率越高；野生型游离dna的扩增曲线未过基线(no ct)，表明其扩增被抑制。
[0112]
熔解曲线(见图4)：kras基因g12突变型(包括g12c和g12d等突变类型)游离dna的熔解曲线在72℃出现峰值；野生型游离dna的熔解曲线无峰值。
[0113]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。