一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法、柞蚕蛹蛋白肽及其应用与流程

1.本发明涉及食品加工技术领域，特别是涉及一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法、柞蚕蛹蛋白肽及其应用。


背景技术：

2.抗氧化肽具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基产物的作用，作为一种来源方便、无毒副作用的新型抗氧化剂深受国内外学者的青睐。有研究表明，柞蚕蛹蛋白肽具有抗疲劳、抗氧化、抗衰老及降血压的功能，可用于治疗白血球减少症，急慢性、中毒性肝炎和生理衰退等病症。关于柞蚕蛹蛋白肽的研究，如闵建华等
[i]
初步研究了柞蚕蛹蛋白抗氧化活性肽的分离技术，赵鹏
[ii]
等以柞蚕蛹蛋白为原料，采用酶水解方法获得了柞蚕蛹活性肽。但现有技术制备的柞蚕蛹多肽存在气味较差或水解度较低等问题。因此，急需一种在保证水解度的同时改善柞蚕蛹多肽气味的方法。


技术实现要素：

[0003]
为了解决上述问题，本发明提供了一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法、柞蚕蛹蛋白肽及其应用。本发明提供的制备方法不仅对柞蚕蛹蛋白的水解度高，且能改善柞蚕蛹多肽的气味。
[0004]
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0005]
本发明提供了一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
[0006]
利用碱性蛋白酶将柞蚕蛹蛋白粉进行第一酶解，得到第一酶解物；所述碱性蛋白酶的酶活为200u/mg；
[0007]
利用风味蛋白酶将第一酶解物进行第二酶解，得到所述柞蚕蛹蛋白肽；所述风味蛋白酶的酶活为20u/mg。
[0008]
优选的，所述第一酶解的条件包括：温度为45～55℃，ph值为9.3～9.8，碱性蛋白酶的添加量为2wt.％～3wt.％，柞蚕蛹蛋白粉在第一酶解体系中的浓度为5wt.％～6wt.％，酶解时间为4～6h。
[0009]
优选的，所述柞蚕蛹蛋白粉在第一酶解体系中的浓度为5wt.％。
[0010]
优选的，所述第一酶解的ph值为9。
[0011]
优选的，所述碱性蛋白酶的添加量为2wt.％。
[0012]
优选的，所述第二酶解的条件包括：温度为48～52℃，ph值为6.8～7.2，风味蛋白酶的添加量为2wt.％～3wt.％，第一酶解物在第二酶解体系中的浓度为5wt.％～6wt.％，酶解时间为1h。
[0013]
优选的，所述第二酶解的ph值为7。
[0014]
优选的，得到所述第一酶解物后还包括冻干处理。
[0015]
本发明还提供了一种柞蚕蛹蛋白肽，包括利用上述制备方法制备得到的柞蚕蛹蛋白肽。
[0016]
本发明还提供了上述柞蚕蛹蛋白肽在制备抗氧化和/或降血压的试剂或药物中的应用。
[0017]
有益效果：
[0018]
本发明提供了一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：利用碱性蛋白酶将柞蚕蛹蛋白粉进行第一酶解，得到第一酶解物；所述碱性蛋白酶的酶活为200u/mg；利用风味蛋白酶将第一酶解物进行第二酶解，得到所述柞蚕蛹蛋白肽；所述风味蛋白酶的酶活为20u/mg。本发明先利用碱性蛋白酶对柞蚕蛹蛋白粉进行第一酶解，可以最大程度对柞蚕蛹蛋白进行水解；再利用风味蛋白酶对酶解物进行第二酶解，可以有效改善柞蚕蛹多肽的气味，并进一步提高柞蚕蛹蛋白的水解度，增加柞蚕蛹蛋白多肽的生物活性。
附图说明
[0019]
图1为不同蛋白酶在不同酶解时间下的柞蚕蛹蛋白的水解度；
[0020]
图2为不同底物浓度下的水解度；
[0021]
图3为不同大小柞蚕蛹肽段对dpph的清除率；
[0022]
图4为frap标准曲线；
[0023]
图5为frap法测定的不同柞蚕蛹肽段的抗氧化能力；
[0024]
图6为不同浓度柞蚕蛹蛋白肽总还原力的测定结果；
[0025]
图7为不同浓度柞蚕蛹蛋白肽fe
2+
的螯合能力测定结果。
具体实施方式
[0026]
本发明提供了一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
[0027]
利用碱性蛋白酶将柞蚕蛹蛋白粉进行第一酶解，得到第一酶解物；所述碱性蛋白酶的酶活为200u/mg；
[0028]
利用风味蛋白酶将第一酶解物进行第二酶解，得到所述柞蚕蛹蛋白肽；所述风味蛋白酶的酶活为20u/mg。
[0029]
如无特殊说明，本发明对制备所述柞蚕蛹蛋白肽时所使用的原料、酶和其他试剂的来源均没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
[0030]
本发明利用碱性蛋白酶将柞蚕蛹蛋白粉进行第一酶解，得到第一酶解物；所述碱性蛋白酶的酶活为200u/mg。在本发明中，所述第一酶解的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述第一酶解的ph值优选为为9.3～9.8，更优选为9.5；所述第一酶解的碱性蛋白酶的添加量(即在第一酶解体系中的浓度)优选为2wt.％～3wt.％，更优选为2wt.％；所述第一酶解的柞蚕蛹蛋白粉在第一酶解体系中的浓度优选为5wt.％～6wt.％，更优选为5wt.％；所述第一酶解的酶解时间优选为4～6h，更优选为4h。本发明利用碱性蛋白酶对柞蚕蛹蛋白粉进行第一酶解，可以最大程度地对柞蚕蛹蛋白进行水解；另外通过适宜的酶解条件可以进一步提高柞蚕蛹蛋白的水解度。
[0031]
得到第一酶解物后，本发明利用风味蛋白酶将第一酶解物进行第二酶解，得到所述柞蚕蛹蛋白肽；所述风味蛋白酶的酶活为20u/mg。在本发明中，得到所述第一酶解物后还优选包括冻干处理，即第二酶解的底物优选为冻干处理后的第一酶解物。本发明对所述冻干处理的操作方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的操作方式即可。
[0032]
在本发明中，所述第二酶解的温度优选为48～52℃，更优选为50℃；所述第二酶解的ph值优选为6.8～7.2，更优选为7；所述第二酶解的风味蛋白酶的添加量(即在第二酶解体系中的浓度)优选为2wt.％～3wt.％，更优选为2wt.％；所述第二酶解的第一酶解物在第二酶解体系中的浓度优选为5wt.％～6wt.％，更优选为5wt.％；所述第二酶解的酶解时间优选为1h。
[0033]
本发明利用风味蛋白酶对酶解物进行第二酶解，可以将呈苦味的多肽降解为氨基酸，使pro(脯氨酸)在n端裸露，lys(赖氨酸)在n端和c端裸露，gly(甘氨酸)在c端裸露，疏水氨基酸裸露减少，苦味降低，从而有效改善柞蚕蛹多肽的气味，并进一步提高柞蚕蛹蛋白的水解度，增加柞蚕蛹蛋白多肽的生物活性。
[0034]
本发明还提供了一种柞蚕蛹蛋白肽，包括利用上述制备方法制备得到的柞蚕蛹蛋白肽。本发明提供的柞蚕蛹蛋白肽抗氧化作用强，其中小于100kd的多肽对dpph自由基的清除率能达到94％以上，所述柞蚕蛹蛋白肽溶液浓度为0.1mg/ml时，其铁螯合能力可达96.4％，具有较强的抗氧化能力和总还原力，并呈现剂量依赖；另外，本发明提供柞蚕蛹蛋白肽还有较强的降血压活性。
[0035]
本发明还提供了上述柞蚕蛹蛋白肽在制备抗氧化和/或降血压的试剂或药物中的应用。本发明提供柞蚕蛹蛋白肽具有较强抗氧化能力和降血压活性，具体机理同上，在此不再赘述。
[0036]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法、柞蚕蛹蛋白肽及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0037]
实施例1
[0038]
一种柞蚕蛹蛋白肽的制备方法，由以下步骤组成：
[0039]
1)将0.5g柞蚕蛹蛋白粉(购自吉林省蚕业科学研究院，货号001)溶解于10ml ph值为9.5的缓冲液中，加入0.2g碱性蛋白酶(购自诺维信，货号9014-01-1，酶活为200u/mg)，使柞蚕蛹蛋白粉在酶解液中的浓度为5wt.％，碱性蛋白酶在酶解液中的浓度为2wt.％，于50℃中水浴4h，得到初级酶解物；
[0040]
2)将步骤1)得到的初级酶解物冻干，得到初级多肽冻干粉；
[0041]
3)将0.5g初级多肽冻干粉溶解于10mlph值为7的缓冲液中，加入0.2g风味蛋白酶(购自上海源叶生物科技有限公司，货号yy-021，酶活为20u/mg)，使初级多肽冻干粉在酶解液中的浓度为5wt.％，风味蛋白酶在酶解液中的浓度为2wt.％，于50℃中水浴1h，得到柞蚕蛹多肽。
[0042]
对比例1
[0043]
一种与实施例1相似的柞蚕蛹多肽的制备方法，唯一区别在于，未进行步骤2)和步骤3)的操作。
[0044]
对比例2
[0045]
一种与对比例1相似的柞蚕蛹多肽的制备方法，区别在于，缓冲液的ph值为9.0，柞蚕蛹蛋白粉在酶解液中的浓度为3wt.％，碱性蛋白酶在酶解液中的浓度为3wt.％。
[0046]
对比例3
[0047]
一种与对比例2相似的柞蚕蛹多肽的制备方法，区别在于，缓冲液的ph值为7.0，将
碱性蛋白酶替换为中性蛋白酶。
[0048]
对比例4
[0049]
一种与对比例2相似的柞蚕蛹多肽的制备方法，区别在于，将碱性蛋白酶替换为风味蛋白酶。
[0050]
对比例5
[0051]
一种与对比例2相似的柞蚕蛹多肽的制备方法，区别在于，缓冲液的ph值为6.0，将碱性蛋白酶替换为酸性蛋白酶。
[0052]
对比例6
[0053]
一种与对比例2相似的柞蚕蛹多肽的制备方法，区别在于，缓冲液的ph值为5.0，将碱性蛋白酶替换为胰蛋白酶。
[0054]
根据文献【mahta mirzaei,saeed mirdamadi,mohamad rezaehsani,et al.purification and identification of antioxidant and ace-inhibitory peptide from saccharomyces cerevisiae protein hydrolysate[j].journal of functional foods,2015,19:259-268.】记载的方法，测定对比例2～6不同制备方法分别在酶解1h、3h和5h时柞蚕蛹蛋白粉的水解度，测定结果见图1和表1。
[0055]
表1不同制备方法柞蚕蛹蛋白粉的水解度(od
340
)
[0056][0057]
由图1和表1可以看出，在相同酶解时间内(1h，3h，5h)，碱性蛋白酶的酶解效果均优于其他蛋白酶。中性蛋白酶水解度与碱性蛋白酶接近，但其制备的柞蚕蛹蛋白肽气味较差。
[0058]
对比例7
[0059]
根据文献【mahta mirzaei,saeed mirdamadi,mohamad rezaehsani,et al.purification and identification of antioxidant and ace-inhibitory peptide from saccharomyces cerevisiae protein hydrolysate[j].journal of functional foods,2015,19:259-268.】记载的方法，测定对比例1在底物浓度(柞蚕蛹蛋白粉在酶解液中的质量浓度)为1％、2％、3％、4％、5％和6％时柞蚕蛹蛋白的水解度，测定结果见图2和表2。
[0060]
表2不同底物浓度柞蚕蛹蛋白粉的水解度(％)
[0061]
底物浓度1％2％3％4％5％6％水解度5.57.410.1202927.8
[0062]
由图2和表2可知，酶解液中不同底物浓度的水解度呈现先升高后降低的趋势，在底物浓度为5％时达到最大水解度。
[0063]
对比例8
[0064]
采用文献【黄静雅,张禹,朴美兰,魏福安,李晓艳,李喜升.酶解制备柞蚕蛹多肽及柠檬酸改善风味研究[j].北方蚕业,2020,41(02):6-13.】记载的方法，对实施例1和对比例1～6制备的柞蚕蛹多肽进行感官评价，评分指标见表3，评分结果见表4。
[0065]
表3柞蚕蛹多肽感官评分指标
[0066]
评分色泽气味口感7～10分浅黄色、均一、明亮香气舒适舒适5～7分黄色、较明亮可以接受一般0～5分暗沉刺鼻较差
[0067]
表4柞蚕蛹多肽感官评分结果
[0068]
处理分数/分实施例1(碱性蛋白酶+风味蛋白酶)9对比例1(碱性蛋白酶)6对比例2(碱性蛋白酶)5对比例3(中性蛋白酶)4对比例4(风味蛋白酶)7对比例5(酸性蛋白酶)4对比例6(胰蛋白酶)4
[0069]
由表4可知，本发明提供的制备方法可以有效改善柞蚕蛹多肽的气味。
[0070]
应用例1
[0071]
1.dpph自由基清除能力的测定
[0072]
将实施例1制备的柞蚕蛹蛋白肽经截留量不同的超滤膜包分离得到不同分子量(《1kd、《3kd、《10kd、《30kd和《100kd)多肽冻干处理，得到冻干粉；将所述不同分子量的冻干粉分别溶于去离子水中配制成柞蚕蛹肽液(浓度均为20mg/ml)，分别记为处理组1～5；
[0073]
将实施例1制备的柞蚕蛹蛋白肽冻干处理，得到总多肽冻干粉；将所述总多肽冻干粉溶于去离子水中配制成不同浓度的柞蚕蛹肽液(浓度分别为：0、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml，0.25mg/ml和1mg/ml)，记为处理组6～11，以相同浓度的还原性谷胱甘肽做为对照，比较对dpph自由基的清除能力。不同处理组实验方案见表5。
[0074]
表5dpph自由基清除能力的测定方案
[0075]
试剂aa(r)a(s)a1a2dpph/ml0.60.60.6
‑‑
蒸馏水/ml0.2
‑‑‑‑
无水乙醇/ml
‑‑‑
0.60.6谷胱甘肽/ml-0.2-0.2-柞蚕蛹肽/ml
‑‑
0.2-0.2
[0076]
将每个处理组按表5的配比配制并充分混匀，在20℃避光反应30min，以蒸馏水为空白，在od
517
处测定溶液吸光值并根据公式ⅰ和ⅱ计算谷胱甘肽和柞蚕蛹肽对dpph自由基的清除率。结果见表6和图3。
[0077][0078][0079]
表6不同处理组对dpph自由基的清除率
[0080]
柞蚕蛹蛋白多肽分子量《1kd《3kd《10kd《30kd《100kd》100kd清除率98.86％96.57％94.19％98％97.58％82.35％柞蚕蛹蛋白肽液浓度(mg/ml)00.0050.010.050.251清除率18.52％19％33％49％51.00％79.06％谷胱甘肽浓度(mg/ml)00.0050.010.050.251清除率18.52％28.43％32.60％69.63％77.03％91.67％
[0081]
由表6和图3可以看出，大于100kd的组分，dpph清除率降至82％，远低于其他分子量的肽段。小于100kd的肽段，抗氧化活性较强，均能＞94％。随着分子量的增加，抗氧化性能逐渐降低，分子量30kd～100kd及＜1k的肽段，抗氧化活性最强；另外不同浓度的柞蚕蛹蛋白肽的dpph自由基的清除率和阳性对照组谷胱甘肽的清除率接近；说明本发明制备的柞蚕蛹蛋白肽具有良好的dpph自由基清楚效果。
[0082]
应用例2
[0083]
frap法测定总抗氧化能力
[0084]
采用应用例1相同的处理方式进行分组(去除分子量大于100kd的分组)，测定不同分子量柞蚕蛹蛋白肽、不同浓度柞蚕蛹蛋白肽和不同浓度谷胱甘肽对abts自由基的清除能力，实验方案见表7和表8。
[0085]
表7frap标准曲线绘制方案
[0086]
溶液1234567硫酸亚铁/ml00.010.020.040.060.080.10蒸馏水/ml0.10.090.080.060.040.020frap工作液/ml2.42.42.42.42.42.42.4
[0087]
将表7中的1～7组溶液充分混合后，在37℃的恒温室中进行10分钟的避光反应，并在od
593
下测量溶液的吸收值。用横坐标代表feso4标准液体浓度，纵坐标代表吸光值，绘制标准曲线，见图4。
[0088]
表8样品与frap工作液反应方案
[0089]
溶液aa(r)a(s)谷胱甘肽/ml-0.1-柞蚕蛹肽/ml
‑‑
0.1蒸馏水/ml0.1
‑‑
工作液/ml2.42.42.4
[0090]
将每个处理组按表8的配比配制并充分混匀，置于37℃的恒温箱中并反应10分钟，并用od
593
测量溶液的吸光度。
[0091]
结果计算：以1mm feso4为标准，样品的抗氧化活性以达到相同的吸光值为一个frap值。frap值越高，抗氧化活性越高。结果见图5和表9。
[0092]
表9不同处理组od
593
吸光度结果
[0093]
蚕蛹蛋白多肽分子量《1kd《3kd《10kd《30kd《100kd od
593
1.7911.6252.1381.3311.841 蚕蛹蛋白肽液浓度(mg/ml)00.0050.010.050.251od
593
0.4230.4880.4740.4830.480.52谷胱甘肽浓度(mg/ml)00.0050.010.050.251od
593
0.4230.4160.4410.4450.4550.4881mmolfeso4添加量(ml)0.10.20.40.60.81od
593
0.4430.5460.60.720.7980.804
[0094]
从图5和表9可以看出，3～10kd的柞蚕蛹蛋白肽总抗氧化能力最高，10～30kd的柞蚕蛹蛋白肽抗氧化能力最低。
[0095]
应用例3
[0096]
以gsh为阳性对照，采用铁氰化钾法测定柞蚕蛹肽总还原力，以表征其抗氧化性。
[0097]
采用应用例1相同的处理方式进行分组，测定不同浓度(0、0.25、0.5、1、3、5和10mg/ml)柞蚕蛹蛋白肽和不同浓度(0、0.25、0.5、1、3、5和10mg/ml)谷胱甘肽的总还原力，实验方案见表10和图6。
[0098]
表10总还原力的测定方案
[0099]
溶液aa(r)a(s)a1a2磷酸盐缓冲液/ml0.250.250.250.250.25蒸馏水/ml0.25
‑‑
0.250.25谷胱甘肽/ml-0.25-0.25-柞蚕蛹肽/ml
‑‑
0.25-0.25铁氰化钾/ml0.250.250.25
‑‑
[0100]
参考文献【kimatu benard muinde,liyan zhao,yuan biao,et al.antioxidant potential of edible mushroom(agaricus bisporus)protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions[j].food chemistry,2017,230:58-67.】记载的方法，根据公式ⅲ和ⅳ计算柞蚕蛹蛋白肽总还原力。
[0101][0102][0103]
表11不同处理组总还原力测定结果(％)
[0104]
蚕蛹蛋白肽液浓度(mg/ml)00.0050.010.050.251总还原力03949819393谷胱甘肽浓度(mg/ml)00.0050.010.050.251总还原力01132738082
[0105]
如表11和图6可知，当浓度小于2.5mg/ml时，柞蚕蛹肽和gsh的总还原力均随浓度增大而明显上升，分别为86.8％和96.3％，此时，柞蚕蛹肽总还原力为gsh的90.1％。柞蚕蛹肽和gsh总还原力最强的浓度均为10mg/ml，总还原力分别为87.5％和97.0％，此时，柞蚕蛹
肽总还原力为gsh的90.2％。上述结果表明：与gsh相比，柞蚕蛹肽具有较高的总还原力，并呈现剂量依赖，说明其通过较好的还原力而表现出较强的抗氧化性。
[0106]
应用例4
[0107]
金属fe
2+
螯合力的活性测定
[0108]
采用应用例1相同的处理方式进行分组，测定不同浓度(0、0.25、0.5、1、3、5和10mg/ml)柞蚕蛹蛋白肽和不同浓度(0、0.25、0.5、1、3、5和10mg/ml)edta对金属fe
2+
螯合力的活性，测定实验方案见表12。
[0109]
表12金属fe
2+
螯合力的测定方案
[0110]
溶液aa(e)a(s)a1a2柠檬酸/ml-0.2-0.1-柞蚕蛹肽/ml
‑‑
0.2-0.2氯化亚铁/ml0.010.010.01
‑‑
蒸馏水/ml0.60.60.60.60.6菲洛嗪/ml0.020.020.020.020.02
[0111]
按柠檬酸、柞蚕蛹肽、氯化亚铁、蒸馏水的顺序加入溶液，最后加入菲洛嗪后剧烈振荡2min，25℃恒温培养箱反应10min后马上测定。以蒸馏水做空白，在od
562
处测定溶液吸光值并根据公式
ⅴ
和ⅵ计算谷胱甘肽和柞蚕蛹肽的fe
2+
螯合力。结果见表13和图7。
[0112][0113][0114]
表13不同处理组对fe
2+
螯合能力测定结果(％)
[0115][0116]
由图7和表13可知，柞蚕蛹肽铁螯合能力很强，当浓度为0.1mg/ml时，铁螯合能力可达96.4％。当浓度为10mg/ml时，铁螯合能力最大，为99.8％。上述结果表明：柞蚕蛹肽具有很好的铁螯合能力，说明其通过此途径表现较强的抗氧化能力。
[0117]
综上所述，本发明提供的柞蚕蛹蛋白肽抗氧化作用强，其中小于100kd的多肽对dpph自由基的清除率能达到94％以上，所述柞蚕蛹蛋白肽溶液浓度为0.1mg/ml时，其铁螯合能力可达96.4％，具有较强的抗氧化能力和总还原力，并呈现剂量依赖；另外，本发明提供柞蚕蛹蛋白肽还有较强的降血压活性。
[0118]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。