1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于肺泡灌洗液样本病原微生物宏基因组的检测流程，具体包括dna的提取及文库构建方法。
背景技术：
2.众多研究表明感染性疾病是不明发热的重要病因，而患者肺部感染居多。在病原诊断的取样过程中，与咽拭子、痰液等样本相比，肺泡灌洗液直接取材于病变部位，可避免口腔微生物的干扰，提高致病性病原体的检出率，对临床诊断具有更高的特异性。感染性疾病诊断可采用传统形态学检测方法，但对于一些厌氧菌或病毒等存在培养困难问题，而免疫学及分子生物学检测无法对未知感染源做出判定。高通量测序的宏基因组技术可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，通过数据库序列比对判断所有微生物信息，在临床检测中发挥着重要的作用。
3.因此获取高纯度、高质量的宏基因组dna是宏基因组学技术顺利开展的有力保证，测序文库质量高低是能否获得有效数据的关键影响因素之一。而现有的核酸提取方法普遍存在操作时间长，核酸降解严重，最后获得的核酸纯度不高等问题。氧化锆珠由微米级及亚纳米级氧化锆与氧化钇为原料制成，具有稳定性好，高强度，高密度、耐高温、耐腐蚀且成本低等优点，在核酸提取过程中使用氧化锆珠可在短时间内破碎裂解样本，研磨过程中产生热量少，且研磨强度大，可有效避免蛋白质的变性和核酸的降解。dna片段化是准备ngs测序文库的第一个主要步骤。高水平的ngs分辨率是通过对每个dna区域的不同reads进行多次表示来实现的，而不管它们的序列和上下文。换句话说，片段的序列必须重叠。因此，ngs的质量在很大程度上取决于dna片段化的随机性和生成的文库片段的重叠。这使得碎片化步骤在文库构建过程中至关重要。
技术实现要素：
4.为解决现有技术问题，本发明的目的是提供一种基于肺泡灌洗液样本病原微生物宏基因组的提取方法和文库构建的方法。针对肺泡灌洗液样本进行去宿主提取病原微生物核酸，通过dna片段化、末端修复及a尾添加一体缩短文库构建时间，以期克服了现有技术操作时间长，文库构建质量不高等问题。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种基于肺泡灌洗液样本病原微生物宏基因组的检测流程，其中肺泡灌洗液样本核酸提取方法包括如下步骤：
7.sa1:样本前处理：拿到新鲜的灌洗液样本后，离心收集沉淀，当收集沉淀后样本粘稠时，加入液化试剂液化样本，液化后清洗掉液化试剂，pbs缓冲液重悬样本定容至1ml；当收集沉淀后样本不粘稠时，直接pbs缓冲液重悬样本定容至1ml；
8.sa2:去宿主过程：在重悬的样本管内直接加入细胞裂解液200-500ul，漩涡震荡5-15min，离心弃净上清，核酸酶1-10ul，37℃孵育5-15min，再加入10-25ulproteinase k孵育
57℃5-15min。
9.sa3:目的dna的提取：将上述产物全部转移到含有氧化锆珠的研磨管，加入100-250ul裂解液，20-50ulproteinase k和100-250ul结合缓冲液，恒温震荡70℃孵育5-15min。取产物加无水乙醇(产物的2-3倍)漩涡震荡后转移至dna吸附柱，离心后并添加500μl漂洗液i，10,000g离心1min后添加500μl漂洗液ii17,000g离心3min，再全速空离1min，此步骤有助于消除缓冲区漂洗液ii；将吸附柱放在干净的1.5ml微量离心管，添加50ul洗脱液。在室温(15-25℃)下孵育5min，然后以10000g离心1min，收集管内样本dna。
10.所述步骤sa1中的液化试剂配方为：二硫苏糖醇2.5g溶于31ml30％的ch3oh；
11.所述步骤sa2中的细胞裂解液配方为：硫脲1-10mol/l、脲1-10mol/l、dtt0.1-1mol/l、chaps1％-10％、tris0.01-0.08mol/l。
12.所述步骤s2中的核酸酶为supernuclease，酶活标准为250-300u/ul。
13.所述步骤s2中的蛋白酶k，浓度为10-40mg/ml。
14.s3中的研磨管，内有3颗大珠；5颗小珠，研磨仪机器设置频率为60hz，时间设置为60s。
15.所述步骤s3中的蛋白酶k，浓度为10-40mg/ml。
16.所述步骤s3中的细胞裂解液配方为：硫脲1-10mol/l、脲1-10mol/l、dtt0.1-1mol/l、chaps1％-10％、tris0.01-0.08mol/l。
17.所述步骤s3中蛋白酶k提前加到新管中提前56℃预热3min。
18.所述步骤s5中洗涤液i用于去除蛋白质等杂质成分，洗涤液ii用于去除盐类等杂质成分。
19.一种基于肺泡灌洗液样本病原微生物宏基因组的检测流程，其中肺泡灌洗液样本基因组的文库构建包括如下步骤：
20.sb1：抽提产物的dna片段化、末端修复及a尾添加：dktp enzyme mix5-15ul及dktp buffer5-15ul，pcr仪37℃10-30min，65℃30min。
21.sb2:接头连接：ligase mix5-15ul，rapid ligase buffer10-30ul，pcr仪37℃15min。
22.sb3:产物纯化：磁珠与灭菌超净水提前室温放置30min震荡混匀磁珠后吸取30-70ul磁珠到反应物中，移液枪混匀后室温放置5min，放置到磁力架，待溶液澄清后小心弃去上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入22ul灭菌超纯水洗脱。
23.sb4:pcr富集：加入primer mix5-10ul，pcr amplification mix10-30ul，93℃预变性2min，96℃变性20s，退火60℃15-30s，延伸72℃30s，后延伸72℃7min，根据dna投入量决定pcr循环数。
24.sb5:磁珠分选：向pcr下机产物中直接加入30-40ul磁珠，混匀后孵育5min，磁力架静置，转移上清至新管，加入10-30ul磁珠，混匀后孵育5min，转移至磁力架静置，弃上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入22ul灭菌超纯水洗脱，得到二代测序文库。
25.所述步骤sb1中的dktp enzyme mix为酶组合物，dnasei 1-10u/ul、klwnow 1-10u/ul、taq dna聚合酶0.1-0.5u/ul、t4多聚核苷酸激酶0.15-0.5u/ul。
26.所述步骤sb2中的dna clean beads可使用不同厂家dna clean beads均可对反应物进行纯化。
27.本发明的有益效果为在样本病原微生物提取核酸前进行了去宿主过程，采用了双重裂解促进病原微生物的提取，在去宿主过程加入裂解液去人源细胞，在目的dna提取过程中加入裂解液促进病原dna的提取。在病原微生物核酸提取时使用了氧化锆珠，通过物理机械研磨促进微生物细胞破碎，促进微生物核酸提取，克服了现有技术人源占比高，微生物提取不充分的问题，提高了核酸提取效率且核酸样本得率高、纯度好。
28.文库构建时使用了dna片段化、末端修复及a尾添加一体的酶组合物，该自配酶组合物dktp enzyme mix，使抽提产物的dna片段化、末端修复及a尾添加一体完成，缩短了传统建库所需时间，能够满足基因文库构建，qpcr以及高通量测序的要求。
具体实施方式
29.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。说明书中除特殊说明，所用酶均购买自赛默飞。
30.实施例1
31.(1)拿到新鲜的灌洗液样本后，离心收集沉淀，当收集沉淀后样本粘稠时，加入液化试剂液化样本，液化后清洗掉液化试剂，pbs缓冲液重悬样本定容至1ml；当收集沉淀后样本不粘稠时，直接pbs缓冲液重悬样本定容至1ml；
32.(2)在重悬的样本管内直接加入细胞裂解液500ul，漩涡震荡10min，离心弃净上清，加入super nuclease10ul，37℃孵育15min，再加入25ulproteinase k，57℃孵育15min。
33.(3)将上述产物全部转移到含有氧化锆珠的研磨管，加入250ul裂解液，50ulproteinase k和250ul结合缓冲液，恒温震荡70℃10min。取产物加无水乙醇(产物的2-3倍)漩涡震荡后转移至dna吸附柱，离心后并添加500μl漂洗液i，10,000g离心1min后添加500μl漂洗液ii17,000g离心3min，再全速空离1min，此步骤有助于消除缓冲区漂洗液ii；将吸附柱放在干净的1.5ml微量离心管，添加50ul洗脱液。在室温(15-25℃)下孵育5min，然后以10000g离心1min，收集管内样本dna。
34.(4)qubit检测dna浓度，qseq检测dna片段和质量，根据上机要求计算dna上机取样量，加入dktp enzyme mix15ul及dktp buffer15ul，pcr仪37℃30min，65℃30min。
35.(5)ligase mix15ul，rapid ligase buffer10ul，pcr仪20℃15min。
36.(6)产物纯化：磁珠与灭菌超净水提前室温放置30min，震荡混匀磁珠后吸取70ul磁珠到反应物中，移液枪混匀后室温放置5min，放置到磁力架，待溶液澄清后小心弃去上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入22ul灭菌超纯水洗脱。
37.(7)pcr富集：加入primer mix5-10ul，pcr amplification mix10-30ul，93℃预变性2min，96℃变性20s，退火60℃15-30s，延伸72℃30s，后延伸72℃7min，根据dna投入量决定pcr循环数
38.(8)磁珠分选：向pcr下机产物中直接加入30-40ul磁珠，混匀后孵育5min，磁力架静置，转移上清至新管，加入10-30ul磁珠，混匀后孵育5min，转移至磁力架静置，弃上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入22ul灭菌超纯水洗脱，得到二代测序文库。
39.根据mgis eq2000测序仪上机要求进行环化和滚环扩增后进行宏基因组测序。本流程通过双重裂解，氧化锆珠研磨，和建库使用的自配的dna片段化、末端修复及a尾添加一
体的酶组合物，缩短了整个宏基因组测序的时间约3h。
40.实施例2
41.(1)拿到新鲜的灌洗液样本后，离心机10,000g离心10min，收集沉淀，当收集沉淀后样本粘稠时，加入液化试剂液化样本，液化后清洗掉液化试剂，pbs缓冲液重悬样本定容至1ml；当收集沉淀后样本不粘稠时，直接pbs缓冲液重悬样本定容至1ml；
42.(2)在重悬的样本管内直接加入细胞裂解液500ul，漩涡震荡15min，离心弃净上清，加入supernuclease10ul，37℃孵育15min，再加入25ulproteinase k孵育57℃10min。
43.(3)将上述产物全部转移到含有氧化锆珠的研磨管，加入250ul裂解液，35ulproteinasek和250ul结合缓冲液，恒温震荡70℃5min。取产物加无水乙醇(产物的3倍)漩涡震荡后转移至dna吸附柱，离心后并添加500μl漂洗液i，10,000g离心1min后添加500μl漂洗液ii17,000g离心3min，再全速空离1min，此步骤有助于消除缓冲区漂洗液ii；将吸附柱放在干净的1.5ml微量离心管，添加50ul洗脱液。在室温(15-25℃)下孵育5min，然后以10000g离心1min，收集管内样本dna。
44.(4)qubit检测dna浓度，qseq检测dna片段和质量，根据上机要求计算dna上机取样量，加入dktpenzymemix5ul及dktpbuffer5ul，pcr仪37℃10min，65℃30min。
45.(5)ligasemix5ul，rapidligasebuffer30ul，pcr仪20℃15min。
46.(6)产物纯化：磁珠与灭菌超净水提前室温放置30min，震荡混匀磁珠后吸取65ul磁珠到反应物中，移液枪混匀后室温放置5min，放置到磁力架，待溶液澄清后小心弃去上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入22ul灭菌超纯水洗脱。
47.(7)pcr富集：加入primermix5-10ul，pcramplificationmix10-30ul，93℃预变性2min，96℃变性20s，退火60℃15-30s，延伸72℃30s，后延伸72℃7min，根据dna投入量决定pcr循环数。
48.(8)磁珠分选：向pcr下机产物中直接加入30-40ul磁珠，混匀后孵育5min，磁力架静置，转移上清至新管，加入10-30ul磁珠，混匀后孵育5min，转移至磁力架静置，弃上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入22ul灭菌超纯水洗脱，得到二代测序文库。
49.根据next seq cn500测序仪上机要求进行混库，荧光定量，变性后进行宏基因组测序。本流程通过双重裂解，氧化锆珠研磨，和建库使用的自配的dna片段化、末端修复及a尾添加一体的酶组合物，缩短了整个宏基因组测序的时间约3h。
50.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。