一种Ⅱ型胶原蛋白肽多糖去除的方法

一种ⅱ型胶原蛋白肽多糖去除的方法
技术领域
1.本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种ⅱ型胶原蛋白肽多糖去除的方法。


背景技术：

2.中国拥有世界上最多的家畜，如猪、牛、羊、鸡和鸭。随着肉类总产量的增加，牲畜屠宰废弃物也会增加。我国每年生产各类家畜骨近1000万吨，这无疑是一个巨大的资源。但是，在目前的消费市场上，除了排骨和体腔骨可以直接用于饮食，需求量大，其他绝大多数骨骼没有得到充分利用。而动物骨头中富含蛋白质、氨基酸、软骨素、维生素等多种矿物质，钙、磷、铁等含量较高。动物骨头，尤其是动物软骨中富含营养物质，因此，近年来从动物软骨中提取ii型胶原蛋白肽成为研究热点。
3.但是，在处理软骨的工艺中，经过初次酶解后的酶解液含有大量的硫酸软骨素等多糖，目前常见的分离多糖的方式主要有分级沉淀法、色谱分离法。分级沉淀法主要是利用多糖在乙醇中溶解度小，随着乙醇的体积分数逐渐增大，不同聚合度的多糖分子分别沉淀析出。但是，分级沉淀法中，会有部分的多肽分子随着醇的体积分数增加析出。色谱分离法主要有凝胶柱色谱法和离子交换色谱法。凝胶柱色谱法主要是利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离；离子交换色谱法根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。这些传统方法操作较为繁琐，且操作成本高。
4.相较于分级沉淀、色谱分离两种方法而言，膜分离法处理条件更为温和、安全，无其他试剂混入更加干净无污染，而且利用超滤膜不会破坏营养成分，不用进行额外处理将酶解液中的多糖分离出来。申请公布号为cn111808185a的文件公开了一种从牛软骨中提取弹性蛋白肽的方法，采用先高温提取，后分别采用渗透膜、纳滤膜分离的工艺得到蛋白肽。该方法采用两种膜分离技术，不仅成本偏高，而且分离效率也较慢。


技术实现要素：

5.针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种ⅱ型胶原蛋白肽多糖去除的方法，通过结合超声降解技术与超滤膜分离技术的方式制备多糖含量低的ⅱ型胶原蛋白肽，具有脱糖效果好、脱糖效率高、蛋白肽损失率低、无有机溶剂残留、绿色环保的优点。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种ⅱ型胶原蛋白肽多糖去除的方法，包括步骤：（1）原料预处理：选取提取完硫酸软骨素的动物软骨，粉碎，然后进行脱脂、脱杂蛋白、脱钙处理；（2）制备酶解液：将步骤（1）向预处理得到的动物软骨中加入蛋白酶酶解2-6h后经灭酶、离心，得到酶解液；（3）多糖降解：向步骤（2）得到的酶解液中加入辅助降解剂并进行超声波处理，得到降解液；（4）超滤脱糖：选取5-10kda分子量的超滤膜对步骤（3）得到的降解液进行过滤，收
集滤出液，得到ⅱ型胶原蛋白肽溶液。
7.作为本发明的进一步优选，步骤（3）中所述辅助降解剂与所述酶解液的体积比为1-2.5:25；所述辅助降解剂为过氧化氢、乙醇中的一种或两者的复配物。
8.作为本发明的进一步优选，步骤（3）中超声波处理条件为：超声波频率20-80khz、温度30-60℃、时间0.5-3h。
9.作为本发明的进一步优选，步骤（4）中所述滤出液的流速为2-4ml/min。
10.作为本发明的进一步优选，步骤（2）中所述蛋白酶与动物软骨的质量比为0.01-0.1：1。
11.作为本发明的进一步优选，步骤（2）中所述蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶。
12.作为本发明的进一步优选，步骤（1）中脱脂处理包括：采用乙醚溶液浸泡12-24h，然后加热直至乙醚完全挥发。
13.作为本发明的进一步优选，步骤（1）中脱杂蛋白处理包括：在0-10℃下加入naoh溶液浸泡并磁力搅拌3-12h，并且每2-3h更换一次naoh溶液。
14.作为本发明的进一步优选，步骤（1）中脱钙处理采用edta脱钙溶液，所述edta脱钙溶液与动物软骨的体积比为4-10:1。
15.综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明采用过氧化氢超声降解与超滤膜技术结合的工艺制备ⅱ型胶原蛋白肽，具有脱糖效率高、无有机溶剂残留、蛋白肽损失率低的优点，提高了动物软骨的加工利用率，并且整个加工过程绿色无污染，具有经济效益好、环境友好的特点，应用发展前景好。
具体实施方式
16.一种ⅱ型胶原蛋白肽多糖去除的方法，包括步骤：（1）原料预处理：选取提取完硫酸软骨素的动物软骨，粉碎，然后进行脱脂、脱杂蛋白、脱钙处理。
17.上述提取完硫酸软骨素的动物软骨是本方法的原料，动物软骨提取硫酸软骨素的工艺为本领域现有技术，具体步骤不做限制（可参考文件申请号：201911423904.4公开的提取硫酸软骨素工艺流程）。
18.上述脱脂处理采用乙醚溶液，因为乙醚具有溶解脂肪，并可在40℃左右的温度快速挥发的特点，既能达到脱脂的目的，又不会造成试剂残留，而且低温挥发的条件不会影响热敏性较高的蛋白肽的活性，因此作为优选。
19.上述脱杂蛋白处理包括：在0-10℃下加入naoh溶液浸泡并磁力搅拌3-12h，并且每2-3h更换一次naoh溶液。该方法既能有效脱除杂蛋白的原理在于，通过naoh溶液控制溶液的ph值，使位于软骨表面的杂蛋白溶解于naoh溶液内并且随着naoh溶液的更换，软骨表面的杂蛋白被全部去除。磁力搅拌的目的是加速杂蛋白的溶解，控制转速在100-500r/min范围内，避免高速旋转产生杂蛋白沉淀难以去除。
20.上述脱钙处理采用edta脱钙溶液，所述edta脱钙溶液与动物软骨的体积比为4-10:1；edta脱钙溶液的配制属于现有技术，故不再赘述。
21.（2）制备酶解液：向预处理得到的动物软骨中加入蛋白酶酶解2-6h后经灭酶、离
心，得到酶解液；其中，蛋白酶可选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种，也可选择其他常用的蛋白酶如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等。
22.（3）多糖降解：向酶解液中加入辅助降解剂并进行超声波处理，得到降解液；辅助降解剂可选择过氧化氢、乙醇的一种或复配使用，优选为过氧化氢。本发明采用过氧化氢超声降解多糖的技术可有效降低多糖的分子量，从而可以使用孔径更小的超滤膜进行一步脱除，不会发生超滤膜堵塞的问题，有助于提高脱除效率，降低蛋白肽损失率。
23.（4）超滤脱糖：选取3-10kda分子量的超滤膜对降解液进行过滤，收集滤出液，得到ⅱ型胶原蛋白肽溶液。本工艺中超滤膜需要经过处理，包括：将超滤膜用纯水浸泡4-6h，中途换三次水，用纯水将超滤膜洗至中性备用。检查设备所用管路阀门，保证管路运行通畅。
24.实施例1（1）软骨的预处理：将提取完硫酸软骨素的动物软骨进行解冻，然后经过粉碎机粉碎，用自来水进行清洗后按以下步骤进行脱脂、脱杂蛋白及脱钙处理。a.加入10倍软骨体积的乙醚溶液，浸泡24h脱脂，于40℃至软骨表面乙醚完全挥发；b.在4℃下加入20倍的浓度为0.25mol/l的naoh溶液在磁力搅拌器上搅拌12h，约每3h换一次溶液；c.加入10倍软骨体积的0.5mol/l 的edta溶液对软骨进行脱钙处理。
25.（2）酶解液的获得：在预处理好的软骨中，加入4%添加量的胃蛋白酶，以1:8的料液比溶解，调至最适ph，40℃恒温酶解3.5 h，酶解结束后，沸水浴灭酶10 min；待酶解液冷却，将酶解液ph调至中性，离心分离，得到动物软骨酶解液。
26.（3）多糖降解：在酶解液中加入超声辅助降解剂使体积分数达到4%，将酶解液放入超声器中，调整超声条件为：功率30khz、反应温度40℃、反应时间1h。
27.（4）脱糖：选取5kda分子量的超滤膜，将超滤膜用纯水浸泡4-6h，中途换三次水，用纯水将超滤膜洗至中性备用。检查设备所用管路阀门，保证管路运行通畅。将超滤杯顶端进气口处的软管与通风橱内氮气管路直接相连，将超滤杯置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器使搅拌子以合适的转速转动，从超滤杯顶端进液口加入酶解液，旋紧螺帽保持超滤杯的密闭性。打开氮气瓶顶部活塞，并打开氮气管路的截止阀至最大，再调整通往通风橱的开关使氮气压力为 0.35-0.5mpa，顺时针旋转慢调氮气压力使滤出液流速为3-4ml/min，收集滤出液。使用完毕，将超滤膜在0.5mol/l的naoh中浸泡10-15min，取出用纯水洗至中性。
28.实施例2（1）软骨的预处理：将提取完硫酸软骨素的动物软骨进行解冻，然后经过粉碎机粉碎，用自来水进行清洗后按以下步骤进行脱脂、脱杂蛋白及脱钙处理。a.加入8倍软骨体积的乙醚溶液，浸泡18h脱脂，于40℃至软骨表面乙醚完全挥发；b.在4℃下加入16倍的浓度为0.25mol/l的naoh溶液在磁力搅拌器上搅拌9h，约每3h换一次溶液；c.加入4倍软骨体积的0.5mol/l 的edta溶液对软骨进行脱钙处理。
29.（2）酶解液的获得：在预处理好的软骨中，加入6%添加量的中性蛋白酶，以1:10的料液比溶解，调至最适ph,45℃恒温酶解3h，酶解结束后沸水浴灭酶10 min；待酶解液冷却，将酶解液ph调至中性，离心分离，得到动物软骨酶解液。
30.（3）多糖降解：在酶解液中加入超声辅助降解剂使体积分数达到10%，将酶解液放入超声器中，调整超声条件为：功率40khz、反应温度55℃、反应时间2h。
31.（4）脱糖：选取10kda分子量的超滤膜，将超滤膜用纯水浸泡4-6h，中途换三次水，
用纯水将超滤膜洗至中性备用。检查设备所用管路阀门，保证管路运行通畅。将超滤杯顶端进气口处的软管与通风橱内氮气管路直接相连，将超滤杯置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器使搅拌子以合适的转速转动，从超滤杯顶端进液口加入酶解液，旋紧螺帽保持超滤杯的密闭性。打开氮气瓶顶部活塞，并打开氮气管路的截止阀至最大，再调整通往通风橱的开关使氮气压力为 0.2-0.3mpa，顺时针旋转慢调氮气压力使滤出液流速为2-3ml/min，收集滤出液。使用完毕，将超滤膜在0.5mol/l的naoh中浸泡10-15min，取出用纯水洗至中性。
32.对比例1（1）软骨的预处理：将提取完硫酸软骨素的动物软骨进行解冻，然后经过粉碎机粉碎，用自来水进行清洗后按以下步骤进行脱脂、脱杂蛋白及脱钙处理。a.加入10倍软骨体积的乙醚溶液，浸泡12h脱脂，于40℃至软骨表面乙醚完全挥发；b.在4℃下加入12倍的浓度为0.25mol/l的naoh溶液在磁力搅拌器上搅拌12h，约每3h换一次溶液；c.加入6倍软骨体积的0.5mol/l的edta溶液对软骨进行脱钙处理。
33.（2）酶解液的获得：在预处理好的软骨中，加入2%添加量的碱性蛋白酶，以1:4的料液比溶解，调至最适ph,35℃恒温酶解5h，酶解结束后沸水浴灭酶10 min；待酶解液冷却，将酶解液ph调至中性，离心分离，得到动物软骨酶解液。
34.（3）脱糖：取分别吸取5ml酶解液与30ml50%醇溶液混合，混合均匀后贴上封口膜于4℃冰箱静置24h。
35.对比例2（1）软骨的预处理：将提取完硫酸软骨素的动物软骨进行解冻，然后经过粉碎机粉碎，用自来水进行清洗后按以下步骤进行脱脂、脱杂蛋白及脱钙处理。a.加入6倍软骨体积的乙醚溶液，浸泡20h脱脂，于40℃至软骨表面乙醚完全挥发；b.在4℃下加入10倍的浓度为0.25mol/l的naoh溶液在磁力搅拌器上搅拌12h，约每3h换一次溶液；c.加入10倍软骨体积的0.5mol/l 的edta溶液对软骨进行脱钙处理。
36.（2）酶解液的获得：在预处理好的软骨中，加入4%添加量的碱性蛋白酶，以1:6的料液比溶解，调至最适ph，40℃恒温酶解4h，酶解结束后加热至90℃，水浴灭酶15 min；待酶解液冷却，将酶解液ph调至中性，离心分离，得到动物软骨酶解液。
37.（3）脱糖：取分别吸取10ml酶解液与60ml70%醇溶液混合，混合均匀后贴上封口膜于4℃冰箱静置24h。
38.对比例3：（1）软骨的预处理：将提取完硫酸软骨素的动物软骨进行解冻，然后经过粉碎机粉碎，用自来水进行清洗后按以下步骤进行脱脂、脱杂蛋白及脱钙处理。a.加入10倍软骨体积的乙醚溶液，浸泡24h脱脂，于40℃至软骨表面乙醚完全挥发；b.在4℃下加入12倍的浓度为0.25mol/l的naoh溶液在磁力搅拌器上搅拌6h，约每3h换一次溶液；c.加入8倍软骨体积的0.5mol/l 的edta溶液对软骨进行脱钙处理。
39.（2）酶解液的获得：在预处理好的软骨中，加入6%添加量的碱性蛋白酶，以1:8的料液比溶解，调至最适ph，45℃恒温酶解3h，酶解结束后加热至90℃，水浴灭酶20 min；待酶解液冷却，将酶解液ph调至中性，离心分离，得到动物软骨酶解液。
40.（3）脱糖：取分别吸取15 ml酶解液与90ml80%醇溶液混合，混合均匀后贴上封口膜于4℃冰箱静置24h。
41.对比例4本对比例与实施例1的不同之处在于，选取3kda分子量的超滤膜。
42.检测实施例1-2以及对比例1-4得到的酶解液的脱糖率（%）和多肽损失率（%），结果如下：如上所示，对比例1-3显示随着脱糖率的提高，多肽的损失率也大幅提升，无法达到多糖脱除率高的同时多肽损失率低的效果。而采用本发明工艺的实施例1-2可以同时达到多糖脱除率高、多肽损失率低的效果。对比例4选取3kda分子量的超滤膜没有达到预期效果，其原因可能在于超滤膜的孔径选择对多肽损失率的影响较大。
43.本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。