幽门螺杆菌固体培养基及其制备方法和应用与流程

本发明涉及微生物培养，尤其是涉及一种幽门螺杆菌固体培养基及其制备方法和应用。

背景技术：

1、幽门螺杆菌或幽门螺旋菌，英文名helicobacter pylori，简称hp。是革兰氏阴性、微需氧的细菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内，形态是一种单极多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2.5～4.0μm，宽0.5～ 1.0μm。它会引起胃黏膜轻微的慢性感染，进一步导致胃及十二指肠溃疡与胃癌，1982由澳大利亚科学家巴里·马歇尔(barryj.marshall)和罗宾·沃伦(j.robinwarren)二人从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中首次分离成功该菌，是目前所知能够在胃酸中繁殖的惟一微生物种类。幽门螺杆菌会产生空泡毒素，导致胃粘膜的坏死和溃疡，甚至诱发癌变。幽门螺杆菌感染了全中国50％以上的人群，感染者中很大部分会发生慢性活动性胃炎，在此基础上部分患者可发生消化不良、消化性溃疡，极少部分患者可发生胃恶性肿瘤(胃癌、胃mall淋巴瘤)。幽门螺杆菌胃炎已被定义为临床最常见的感染性疾病之一。根据临床数据，我国人群中感染胃幽门螺杆菌，使用三联疗法敏感菌株和耐药菌株在疗程为14天的根除率分别为 95％和＜50％。三联疗法中常用的抗生素——克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星三种抗生素在国外的监测数据中单药耐药率居高不下，其中：克拉霉素耐药率约为20-45％、甲硝唑耐药率约为40-70％、左氧氟沙星耐药率约为20-45％，目前依然缺乏权威机构系统的体外诊断监测数据，只能从治疗失败的案例统计中得出胃幽门螺杆菌的临床耐药率，该数字很高且各地区存在差异。

2、造成上述现状的主要原因是幽门螺杆菌需要的样本胃粘膜组织采集需要特殊侵入性技术以及包含弯曲菌在内的微需氧菌的特殊培养技术导致的。首先幽门螺杆菌存在部位特殊导致采样困难，其次由于胃幽门螺杆菌与弯曲菌一样需要特殊营养结构和特殊气体构成，需求比较苛刻，传统培养方法很难让幽门螺杆菌在离开人体之后还能生长出来，如果培养不到幽门螺杆菌，药敏试验就无从谈起。没有药敏实验也就无法预测抗生素的临床有效性。也就无法指导临床的合理用药，经验用药由于全球耐药泛滥的现状，尤其是耐药背景的地区差异已经造成了很大的治疗失败和资源浪费，因此幽门螺杆菌药敏试验就显得非常迫切了！

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种幽门螺杆菌固体培养基，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

2、本发明的目的之二在于提供上述幽门螺杆菌固体培养基的制备方法。

3、本发明的目的之三在于提供一种幽门螺杆菌的培养方法。

4、本发明的目的之四在于提供上述幽门螺杆菌固体培养基及培养方法的应用。

5、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

6、本发明提供了一种幽门螺杆菌固体培养基，包括：哥伦比亚琼脂培养基35～45g/l、基础营养物质3～30g/l、加强营养物质0.5％～5％v/v、还原剂0.002％～0.2％w/v、无机盐0.5％～3.5％w/v、氧自由基淬灭剂0.01％～7％w/v、维生素1％～5％v/v、吸附剂0.1％～0.5％w/v、缓冲物质0.5～2g/l和抗生素15～70mg/l，溶剂包括水。

7、进一步的，所述基础营养物质包括酵母粉、蛋白胨、脑心浸液粉和葡萄糖中的一种或多种；

8、优选地，所述酵母粉的用量为0～5g/l；

9、优选地，所述蛋白胨的用量为3～10g/l；

10、优选地，所述脑心浸液的用量为0～5g/l；

11、优选地，所述葡萄糖的用量为0～2.5g/l；

12、优选地，所述蛋白胨包括蛋白胨或蛋白胨p；

13、优选地，所述加强营养物质包括马血或马血清。

14、进一步的，所述还原剂包括硫乙醇酸钠和/或l-半胱氨酸单盐酸盐；

15、优选地，所述硫乙醇酸钠的用量为0.01％～0.05％w/v；

16、优选地，所述l-半胱氨酸单盐酸盐的用量为0.002％～0.1％w/v。

17、进一步的，所述无机盐包括硫酸镁、硫酸亚铁和碳酸钠中的一种或多种；

18、优选地，所述硫酸镁的用量为0～2.5％w/v；

19、优选地，所述硫酸亚铁的用量为0～0.02％w/v；

20、优选地，所述碳酸钠的用量为0～0.6％w/v。

21、进一步的，所述维生素包括淋病奈瑟菌生长促进剂或者iso-vitalex；

22、优选地，所述吸附剂包括活性炭；

23、优选地，所述缓冲物质包括kh2po4；

24、优选地，所述氧自由基淬灭剂包括氯化血红素、丙酮酸钠和α环糊精中的一种或多种；

25、优选地，所述氯化血红素的用量为5～20mg/l；

26、优选地，所述丙酮酸钠的用量为0.01％～0.5％w/v；

27、优选地，所述α环糊精的用量为0.1％～1％w/v。

28、进一步的，所述抗生素包括两性霉素、万古霉素、甲氧苄啶和头孢磺啶中的一种或多种；

29、优选地，所述两性霉素的用量为0.1～4mg/l；

30、优选地，所述万古霉素的用量为5～15mg/l；

31、优选地，所述甲氧苄啶的用量为5～20mg/l；

32、优选地，所述头孢磺啶的用量为5～30mg/l。

33、本发明还提供了上述的幽门螺杆菌固体培养基的制备方法，包括将配方量的哥伦比亚琼脂培养基、基础营养物质、还原剂、无机盐、氧自由基淬灭剂和缓冲物质溶解并混合，调节ph 6.8～7.2后加入吸附剂并灭菌， 45～55℃条件下加入余下组分，然后冷却凝固，得到所述幽门螺杆菌固体培养基；

34、优选地，将所述幽门螺杆菌固体培养基制备为3～4mm厚，7～9cm直径的平皿。

35、本发明还提供了一种幽门螺杆菌的培养方法，将菌种悬液接种上述的幽门螺杆菌固体培养基上，然后在微需氧环境中进行培养；

36、所述微需氧环境包括3％-5％o2、10％co2、2％h2和83％-85％n2的气体环境。

37、进一步的，所述微需氧环境的制备方法包括：在5l体积的容器内放入 2包2.5l的微需氧产气包或2包2.5l的厌氧产气包，同时点燃容器内的蜡烛至自然熄灭，得到所述微需氧环境。

38、此外，本发明还提供了上述的幽门螺杆菌固体培养基或培养方法在培养幽门螺杆菌中的应用。

39、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

40、本发明提供的幽门螺杆菌固体培养基，配方设计科学合理，以哥伦比亚琼脂培养基为基础，通过添加基础营养物质和加强营养物质，为幽门螺杆菌的生长提供全面营养；同时通过还原剂和氧自由基淬灭剂的加入可以降低培养基氧化还原电位；复合抗生素则能防止杂菌的过度繁殖带来对幽门螺杆菌的抑制；吸附剂能够去除反应体系中产生的不必要的h2o2以及 o2-，从而使培养环境更有利于幽门螺杆菌的生长。同时，固体培养基也更便于得到幽门螺杆菌纯菌菌落，为药敏试验做好准备。

41、本发明提供的幽门螺杆菌的培养方法，应用本发明提供的幽门螺杆菌固体培养基，通过严格控制气体组成构建微需氧环境，更有利于幽门螺杆菌的生长。