调控HMGN5的活性分子在恶性肿瘤增殖和转移中的应用

本发明属于生物医药领域，具体地涉及调控hmgn5的活性分子在恶性肿瘤增殖和转移中的应用。

背景技术：

1、rna干扰(rnai)在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链rna(dsrna)诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。sirna在rna沉默通路中起中心作用，是对特定信使rna(mrna)进行降解的指导要素。

2、sirna是rnai途径中的中间产物，是rnai发挥效应所必需的因子。sirna的形成主要由dicer和rde-1调控完成。由于rna病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsrna，rde-1(rnai缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsrna，当dsrna达到一定量的时候，rde-1引导dsrna与rde-1编码的dicer(dicer是一种rnaseiii活性核酸内切酶，具有四个结构域：argonaute家族的paz结构域，iii型rna酶活性区域，dsrna结合区域以及deah/dexhrna解旋酶活性区)结合，形成酶-dsrna复合体。dicer切割后形成sirna，然后，在atp的参与下，细胞中存在的一种rna诱导的沉默复合体rna-inducedsilencing complex rnai干涉的关键步骤是组装risc和合成介导特异性反应的sirna蛋白。sirna并入risc中，然后与靶标基因编码区或utr区完全配对，降解靶标基因，因此说sirna只降解与其序列互补配对的mrna。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。

3、sirna识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于sirna来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制rnai的效应。sirna作为一种新兴的治疗技术，也已经以一种前所未有的速度迈进了临床试验阶段。

4、高迁移率族核小体结合蛋白5(hmgn5)是高迁移率核小体结合蛋白(highmobility group nucleosome binding protein，hmgn)家族成员之一，通过高度保守的核小体结合结构域(nbd)与核小体结合，从而调节染色质结构，进而影响下游基因的转录，研究表明hmgn5参与包括细胞增殖、凋亡、自噬、迁移、侵袭和耐药等多种与肿瘤发生发展相关的生物学过程，在肿瘤发生发展中发挥重要的作用。hmgn5在多种人类肿瘤组织中呈现高表达，并被发现与乳腺癌，脑癌，前列腺癌，膀胱癌等肿瘤的病理分级，临床分期和预后等相关联，因此，hmgn5是一个具有开发潜力的癌症治疗的新靶点。

5、然而，目前虽然已经开发了一些针对hmgn5的抑制剂，然而其抑制效果尚难以令人满意，因此本领域迫切需要开发新的高效抑制hmgn5的抑制剂。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种高效抑制hmgn5的抑制剂及其在抑制恶性肿瘤增殖和转移的药物中的用途。

2、在本发明的第一方面，提供了一种人工sirna或其前体序列，所述的sirna靶向高迁移率族核小体结合蛋白5(hmgn5)并抑制hmgn5表达,

3、其中，所述sirna对hmgn5表达的抑制率≥85％。

4、在另一优选例中，所述sirna为选自表1中靶向hmgn5的sirna(sihmgn5)或其经修饰的衍生物：

5、

6、

7、在另一优选例中，所述的sirna的序列选自seq id no:1～18中任一序列。

8、在另一优选例中，所述的sirna的序列选自seq id no:1～10中任一序列。

9、在另一优选例中，所述的sirna的序列选自seq id no:1～5中任一序列。

10、在另一优选例中，所述的sirna为双链sirna。

11、在另一优选例中，所述的sirna在正义链和/或反义链在其3'端具有额外的0、1或2个核苷酸z，所述的核苷酸z选自胞嘧啶c、鸟嘌呤g、腺嘌呤a、胸腺嘧啶t、脱氧胞嘧啶dc、脱氧鸟嘌呤dg、脱氧腺嘌呤da或脱氧胸腺嘧啶dt。

12、在另一优选例中，sirna在正义链和/或反义链在其3'端具有额外的2个核苷酸z，所述的核苷酸z为脱氧胸腺嘧啶dt。

13、在另一优选例中，所述的sirna的结构如式a所示：

14、x-z   (a)

15、式中，

16、x为选自seq id no:1～18中任一序列；

17、z为0、1或2个核苷酸z，所述的核苷酸z选自胞嘧啶c、鸟嘌呤g、腺嘌呤a、胸腺嘧啶t、脱氧胞嘧啶dc、脱氧鸟嘌呤dg、脱氧腺嘌呤da或脱氧胸腺嘧啶dt。

18、在另一优选例中，所述的sirna为双链sirna。

19、在另一优选例中，所述双链sirna在正义链和反义链在其3'端均具有所述额外的1或2个核苷酸z。

20、在另一优选例中，所述sirna对hmgn5表达的抑制率≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％(如85％-99.9％，或85.7％-99.81％)。

21、在另一优选例中，所述的抑制率为对hmgn5的mrna表达量的抑制率。

22、在另一优选例中，所述的前体序列为shrna序列。

23、在另一优选例中，所述前体序列具有式i所示的结构：

24、

25、    

26、b1为第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列为hmgn5sirna正义链序列；

27、b2为与b1基本互补或完全互补的序列，且b2与c不互补；

28、c为茎环结构序列；

29、a1和a2分别为无，或任选的由4-5个碱基组成的rna序列，

30、其中，所示的前体序列能在宿主中加工形成靶向hmgn5并抑制hmgn5的sirna。

31、在另一优选例中，所述的hmgn5sirna正义链序列为所述的sirna核心序列。

32、在另一优选例中，所述的基本互补指所述b2与b1有2-8个碱基不互补，较佳地，所述b2与b1有3-5个碱基不互补；更佳地，所述的b2较b1缺失1-2个碱基。

33、在另一优选例中，所述b2与b1有2-8个碱基不互补，较佳地，所述b2与b1有3-5个碱基不互补。

34、在另一优选例中，所述的b2较b1添加或缺失1-2个碱基。

35、在另一优选例中，所述的b2较b1缺失1-2个碱基，更佳地，缺失2个碱基。

36、在另一优选例中，所述的被缺失的1-2个碱基位于b1的中部，即9-14位中的1-2个碱基，如第9-10位，第10-11位，第11-12位，第12-13位或第13-14位。

37、本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主细胞转录形成本发明的第一方面中所述的人工sirna或其前体序列。

38、本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

39、在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体、非病毒载体。

40、在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。

41、本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：

42、(a)第一活性成分，所述第一活性成分靶向高迁移率族核小体结合蛋白5(hmgn5)并抑制hmgn5表达,其中，所述的第一活性成分选自下组：本发明的第一方面所述的人工sirna或其前体序列、本发明的第二方面所述的多核苷酸、或本发明的第三方面所述的表达载体或其组合；和

43、(b)药学上可接受的载体。

44、在另一优选例中，所述的药物组合物还含有：(c)第二活性成分，所述的第二活性成分选自下组的额外的肿瘤治疗药物：化疗药物、化疗药物、抗体药物、或其组合。

45、在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液体剂型。

46、在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

47、在另一优选例中，药物组合物的剂型为脂质体制剂。

48、在另一优选例中，所述的第一活性成分为具有所述核心序列的sirna。

49、在另一优选例中，所述的第一活性成分为人工sirna或其前体序列；较佳地为所述sirna的序列选自seq id no:1～18。

50、在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒。

51、在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。

52、在另一优选例中，所述的表达载体中含有表达hmgn5sirna的表达盒。

53、在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方法包括：口服、呼吸道给药、注射给药、透皮给药、粘膜给药。

54、在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式进行施用：口服、皮下注射、肌内注射、静脉注射。

55、在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、巴布膏剂、膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。

56、本发明的第五方面，提供了一种活性成分的用途，用于制备抗肿瘤的药物或制剂，其中，所述活性成分选自下组：本发明的第一方面所述的人工sirna或其前体序列、本发明的第二方面所述的多核苷酸、或本发明的第三方面所述的表达载体或其组合。

57、在另一优选例中，所述的肿瘤为hmgn5高表达的肿瘤。

58、在另一优选例中，所述的制剂用于抑制hmgn5的表达。

59、在另一优选例中，所述的肿瘤包括肾癌、口腔上皮癌、头颈癌、膀胱癌、脑瘤、胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、或乳腺癌。

60、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、脑癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、结直肠癌、骨肉瘤、肺癌、胰腺癌。

61、在另一优选例中，所述的药物用于抑制hmgn5高表达的肿瘤的转移。

62、在另一优选例中，所述的转移包括肺转移、骨转移、脑转移、或其组合。

63、在另一优选例中，所述的转移包括乳腺癌的肺转移、乳腺癌的骨转移、乳腺癌的脑转移、或其组合。

64、本发明的第六方面，提供了一种体外非治疗性抑制hmgn5高表达的肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：

65、在第一活性成分存在下，培养hmgn5高表达的肿瘤细胞，从而抑制所述hmgn5高表达肿瘤细胞的生长，其中，活性成分选自下组：本发明的第一方面所述的人工sirna或其前体序列、本发明的第二方面所述的多核苷酸、或本发明的第三方面所述的表达载体或其组合。

66、在另一优选例中，所述的hmgn5高表达的肿瘤细胞包括乳腺癌细胞。

67、在另一优选例中，所述的hmgn5高表达的肿瘤细胞选自下组：乳腺癌细胞mda-mb-231或t47d细胞。

68、本发明的第七方面，提供了一种治疗hmgn5高表达相关疾病的方法，包括步骤：将安全有效量的第一活性成分或含所述第一活性成分的药物组合物施用于所需对象，从而治疗hmgn5高表达相关疾病，其中，所述的第一活性成分选自下组：本发明的第一方面所述的人工sirna或其前体序列、本发明的第二方面所述的多核苷酸、或本发明的第三方面所述的表达载体或其组合。

69、在另一优选例中，所述施用的剂量为0.05-10mg/kg，较佳地，为0.1-5mg/kg。

70、在另一优选例中，所述的hmgn5高表达相关疾病包括肿瘤。

71、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。