一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的制作方法

1.本发明涉及生物医药检测技术领域，具体涉及一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒eva71的检测系统。


背景技术：

2.目前对于肠道病毒eva71的检测的金标准主要依赖于传统的病毒培养和中和试验。该方法耗时大约5到7天，包括细胞培养，接种及后续的中和试验，其劣势是耗时耗力。随着核酸诊断技术的快速发展，以pcr为基础的诊断技术(如普通pcr技术，荧光pcr技术)被用于eva71的检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备以及探针合成，需要后续的电泳操作，且对操作人员的熟练程度有较高的要求。以pcr为基础的诊断技术对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。并且目前运用这些检测技术诊断肠道病毒eva71的pcr方法和real-time pcr方法，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。
3.为了克服pcr扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较pcr技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(rca)、连置换扩增(sda)、解旋酶依赖的恒温扩增(hda)、环介导恒温扩增(lamp)、交叉扩增(cpa)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂和复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性，便捷性，可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区，上述恒温扩增技术难以实施。亟需研发一种适合于人类肠道病毒eva71检测的基于恒温扩增系统的、可有效降低成本和提升检测便捷程度的快速检测技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒eva71的检测系统，用以解决现有的检测方法成本高、耗时长、操作复杂和检测灵敏度低等技术问题。
5.为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
6.一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒eva71的检测系统，包括用于扩增eva71的pv1基因的多交叉恒温扩增单元；所述多交叉恒温扩增单元包括引物组合；所述引物组合包括置换引物、交叉内引物和扩增引物；所述置换引物包括序列如seq id no:1所示的f1和序列如seq id no:2所示的f2；所述交叉内引物包括序列如seq id no:3所示的cp1和序列如seq id no:4所示的cp2；所述扩增引物包括序列如seq id no:5所示的c1和序列如seq id no:6所示的c2、序列如seq id no:7所示的d1和序列如seq id no:8所示的d2以及序列如seq id no:9所示的r1和序列如seq id no:10所示的r2。
7.采用上述技术方案，技术原理为：
8.本技术方案使用多交叉恒温扩增单元对待测样本中的eva71的pv1基因进行扩增，
扩大目的片段的拷贝数，便于进行后续的pv1基因的检测，进而诊断是否存在eva71感染。本方案使用到了多交叉置换扩增(multiple cross displacement amplification，mcda)技术，能够在恒温条件下实现靶序列扩增。采用本方法对eva71病毒的目的基因进行扩增，对设备的要求低且扩增效率高，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高等优点。这也是首次将该项技术应用在eva71病毒的检测的实践操作中。
9.虽然多交叉置换扩增技术具有上述优点，但是其引物设计以及扩增位点的选择的难度较大。如果设计的引物组合不适合，则检测效果不佳，不能实现对pv1基因的准确检测。本技术的引物组合包括了5对共10条引物，发明人通过大量的筛选实验，选取了本方案的引物组合，可实现高效且准确的目的基因的扩增，进而获得理想的检测灵敏度，可达4copies/ul。
10.进一步，还包括检测单元；所述检测单元为金纳米生物传感器或者可视化检测单元；所述可视化检测单元包括核酸扩增指示剂。
11.经过多交叉恒温扩增单元的扩增之后，在使用检测单元对扩增产物进行检测。可根据实际情况采用金纳米生物传感器或者可视化检测单元。其中，可视化检测单元主要是向扩增产物中加入核酸扩增指示剂(例如：malachite green)，通过显色反应的颜色深度来对样品中的目的基因进行定性或者定量判断。也可以使用金纳米生物传感器(例如免疫层析试纸条)的手段来检测扩增产物，即采用多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感的核酸诊断技术(multiple cross displacement amplification label-based polymer nanoparticles lateral flow biosensor,mcda-lfb)。使用该手段，操作更加简便，更加适合于在床旁检测(poct)中的应用。
12.进一步，所述扩增引物中的至少两条标记有标记分子。在使用金纳米生物传感器对扩增产物进行检测的时候，需要将部分扩增引物标记，以便扩增产物与金纳米生物传感器上的捕获分子结合。
13.进一步，c1的5’端标记有第一标记分子，形成c1*；d1的5’端标记有第二标记分子，形成d1*。在c1和d1上使用第一标记分子和第二标记分子进行修饰，使得扩增产物可以与试纸条上的质控线和/或检测线结合。
14.进一步，所述第一标记分子为生物素；第二标记分子为荧光素。生物素(biotin)和荧光素(fam)是现有技术中常用的标记分子，购置方便且性质稳定，可以和相应的配体或者抗体结合。
15.进一步，所述多交叉恒温扩增单元还包括链置换dna聚合酶、n,n,n-三甲基甘氨酸、dntp、bst dna聚合酶缓冲液和mgso4。引物组合在含有上述成分的反应体系中，可以对模板进行高效恒温扩增。
16.进一步，cp1、cp2、f1、f2、r1、r2、d1*、d2、c1*和c2的工作浓度分别为：60pmol、60pmol、10pmol、10pmol、30pmol、30pmol、30pmol、30pmol、20pmol和20pmol。
17.进一步，所述多交叉恒温扩增单元的工作温度为61-68℃，反应时间为40min。在工作温度为61-68℃的条件下，可实现目的基因的恒温扩增。40min的反应时间可以保证反应的充分进行。
18.进一步，所述多交叉恒温扩增单元的工作温度为62-65℃。多交叉恒温扩增反应在63-66℃的扩增条件下，最先观察到阳性结果，因此被推进作为引物组合的最佳反应温度。
其中，64℃的扩增温度的效果最为理想。
19.进一步，所述金纳米生物传感器依次设置的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；金标垫上包被有高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素；硝酸纤维素膜上设置有检测线及控制线；检测线上固定有荧光素抗体，质控线上固定有生物素偶联的牛血清蛋白。
20.采用上述技术方案，高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素可与扩增产物上的生物素结合，实现对目的物质的可视化标记；检测线可捕获含有荧光素的扩增产物；质控线上捕获了没有和目的物质结合的纳米粒子偶联的链霉素亲和素。采用多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感器，可实现检测结果的可视化，可以很直观的观察实验结果，且无需昂贵的pcr产物检测仪器。
21.进一步，所述检测系统的检测下限为4copies/ul。
22.本方案不但有费用低廉和操作时间短的特点，而且它的检测下限值非常低、灵敏度更高。经过测试，本方案的检测系统的检测下限为4copies/ul，且通过临床检测，本系统的特异性高，可代替传统pcr，实现人类肠道病毒eva71的准确检测。
附图说明
23.图1为本发明实施例1中的vp1基因引物位点示意图。
24.图2为本发明实验例2中的多交叉恒温扩增产物的纳米生物传感器检测结果。
25.图3为本发明实验例3中的不同反应温度下多交叉恒温扩增的浊度动态曲线图。
26.图4为本发明实验例4中的不同模板浓度下本方案检测系统的检测结果。
27.图5为本发明实验例5中的检测体系的特异性测试结果。
具体实施方式
28.本发明各实施例所涉及的试剂来源如下：
29.抗荧光素抗体(anti-fitc)、高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素(sa-np)及生物素偶联的牛血清蛋白(b-bsa)购于北京海泰正元生物科技有限公司。背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫购于jie-yi公司。恒温扩增试剂盒(isothermal amplification kit)及可视染料(vdr)购于北京海泰正元生物科技有限公司(beijing haitai-zhenyuan co.ltd.,beijing,china)。dna提取试剂盒(qiaamp dna minikits；qiagen,hilden,germany)购于德国qiagen公司。dl100 dna marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
30.实施例1：
31.1.多交叉恒温扩增引物设计
32.本发明提供了一套检测eva71的引物，具体针对eva71的特异性基因vp1。vp1是eva71的特异性基因，能检测eva71的不同基因亚型。利用引物设计软件primerexplorer v4(eiken chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物软件primer premier5.0设计mcda引物，并将获得的特异性引物在ncbi数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的mcda扩增引物。引物设计的位置和方向见图1。
33.检测引物包括10条引物(如表1所示)，分别识别靶序列的10个区域，具体包括两条
置换引物f1和f2，两条交叉内引物cp1和cp2，6条扩增目的基因的引物c1和c2、d1和d2、r1和r2。以上引物在mcda反应后用等温扩增仪可以监测浊度。为了构建可检测产物，通过增加在扩增引物c1的5’端标记生物素(biotin)并命名为c1*，在扩增引物d1的5’端标记半抗原(fam)并命名为d1*。两条交叉引物cp1和cp2是介导mcda扩增的主要引物，置换引物f1和f2在mcda反应中发挥置换作用，置换交叉引物cp1和cp2。六条扩增引物c1*和c2、d1*和d2、r1和r2能够加速mcda反应及增加mcda产物量，经过标记后的扩增产物可以实现生物传检测器(lfb)检测扩增结果，减少特殊设备的使用。
34.表1：引物列表
[0035][0036]ac1*,该引物用于mcda-lfb检测体系，5
’‑
端标记生物素biotin；bd1*,该引物用于mcda-lfb检测体系，5
’‑
端标记荧光素fam。
[0037]
2.多交叉恒温扩增反应
[0038]
反应体系包括：交叉引物cp1(60pmol)和cp2(60pmol)、置换引物f1(10pmol)和f2(10pmol)、扩增引物r1(30pmol)和r2(30pmol)、扩增引物d1*(30pmol)和d2(30pmol)、扩增引物c1*(20pmol)和c2(20pmol)、10mm的betaine(n,n,n-三甲基甘氨酸)、6mm的mgso4、1mm的dntp、12.5μl的10
×
bst dna聚合酶缓冲液、10u的链置换dna聚合酶、1μl的模板，补加去离子水至25μl。将体系在61-68℃下恒温反应40分钟，优选反应温度为62-65℃，更优选为64℃。反应结束，获得eva71-mcda产物。
[0039]
3.结果检测
[0040]
mcda扩增后，可通过可视颜色法或生物传检测器(lfb)检测扩增结果。
[0041]
(1)可视颜色法：在eva71-mcda产物中加入可视染料(特异性核酸扩增指示剂，visual detection reagent,vdr)。mcda在合成dna的同时会产生大量的阳离子，阳离子能够改变反应管中的ph,从而使vdr颜色发生改变。因此，可以通过反应管颜色变化判读结果。扩增结束后，阳性从无色变为亮绿色(表示检测模板为eva71)，保持无色不变为阴性(表示检测模板不是eva71)。
[0042]
(2)lfb法：将eva71-mcda产物直接滴加到lfb的样品垫区域，然后将120ul的检测缓冲液(组成：ph＝8.8的tris-hci 40mm，kcl 20mm，mgso
4 16mm，(nh4)2so
4 20mm，tween-20 0.2％，betaine 1.6m，dntps 2.8mm；来自天津汇德鑫科技发展公司的脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒)加到样品垫区域，eva71-mcda产物在虹吸作用下，从样品垫向吸水垫方向运动。
当eva71-mcda产物达到金标垫后，所述产物的一端(即生物素标记端)与金标垫中的高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而实现对eva71-mcda产物的可视化检测。此外，过剩的高分子金纳米粒子偶联的链霉素亲和素可与cl(质控线)区域的b-bsa(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)结合，进行直接显色反应，判断lfb的功能是否正常。由于针对eva71检测的mcda引物标记的半抗原为fam(荧光素)，因此，当出现两条红色条带时为阳性(表示检测模板为eva71)，出现一条红色条带(cl)时为阴性(表示检测模板不是eva71)。两条条带指tl(test line，tl，检测线)和cl(质控线)。
[0043]
本方案的经纳米传感器(lateral flow biosensor，lfb)的制备采用现有技术中的方法。lfb包括在背板上依次设置的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(nc膜)及吸水垫。在金标垫上包被有高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素。在硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线。检测线(tl)上固定有羧基荧光素抗体anti-fam，质控线(cl)上固定有生物素偶联的牛血清蛋白(biotin-bsa)。
[0044]
在实际使用时，本领域技术人员可以根据需要采取常规技术手段，将引物进一步制备为试剂盒、检测试纸、检测条、检测剂及其他检测用产品或检测用产品的组成部分。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
[0045]
实验例1：提取并制备病毒模板
[0046]
1、基因组提取：eva71及其他病毒的基因组rna的提取使用qiagen公司的rna提取试剂盒，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组rna的浓度和纯度，其他病原也用相应方法提取并于-20℃保存备用。
[0047]
建立vp1克隆质粒，将eva71的vp1亚克隆入puc57载体，提取质粒并对其起始浓度定量，并将puc57-eva71-vp1稀释到所需浓度。以常见的肠道病毒其他型的rna及条件致病菌dna为模板评价eva71-mcda技术的特异性。本发明所用各菌毒株信息如表2所示。需要说明的是，在研发过程中实际验证了数十株不同来源的eva71，本技术方案的方法均可对其进行有效验证；只是出于篇幅考虑，实施例中只体现了其中10株的验证结果(与实验例5对应)。
[0048]
表2：各病毒株信息
[0049][0050][0051]
实验例2：引物检测的可行性验证
[0052]
建立mcda反应体系：反应体系包括：所述交叉引物cp1(60pmol)和cp2(60pmol)、置换引物f1(10pmol)和f2(10pmol)、扩增引物r1(30pmol)和r2(30pmol)、扩增引物d1*(30pmol)和d2(30pmol)、扩增引物c1*(20pmol)和c2(20pmol)、10mm的betaine、6mm的mgso4、1mm的dntp、12.5μl的10
×
bst dna聚合酶缓冲液、10u的链置换dna聚合酶、1μl的模板，补加去离子水至25μl。恒温64℃反应40分钟，获得eva71-mcda产物。
[0053]
根据加入模板的不同，设置不同组别，每个组别重复3次。加入4
×
104copies/ul的1μl eva71-vp1质粒模板，作为处理组，加入10pg的cva16 cdna模板，作为阴性对照组1，加入10pg的cva6 cdna模板，作为阴性对照组2，以1μl的双蒸水代替模板，作为空白对照组。
[0054]
可视颜色法验证：在eva71-mcda产物中加入vdr。因专利无法提供彩色图片，故未提供本组实验对应图片，对实验结果的描述如下：结果显示，处理组从无色变为亮绿色，阴性对照组1、2及空白对照组均保持无色。即只有处理组出现了阳性扩增，说明针对vp1设计的检测eva71的mcda引物具有可行性，特异性强。
[0055]
lfb检测：将各组eva71-mcda产物分别、直接滴加到lfb的样品垫区域，然后加入120ul的检测缓冲液，观察出现的条带情况，结果如图2所示。图2从左到右分别为：处理组(图2中的1)、阴性对照组1(图2中的2)、阴性对照组2(图2中的3)、空白对照组(图2中的4)。仅处理组出现2条条带，其余组别均只有1条条带，与可视颜色法验证结果相同。
[0056]
实验例3：扩增反应的温度选择
[0057]
在实施例2的反应体系条件下，模板选择1ul 4
×
104copies/ul eva71-vp1。其他条件完全相同，反应温度分别设置为61-68℃，各处理间温度差为1℃。使用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同浊度的动态曲线图，结果如图3所示。mcda反应在63-66℃的扩增条件下，最先观察到阳性结果，因此被推进作为mcda引物的最佳反应温度(图3c-3f),本发明的后续验证选择64℃作为恒温条件进行mcda扩增。图3表示针对vp1基因设计的检测eva71的mcda引物温度动态曲线图。
[0058]
实验例4：引物检测的敏感性测试
[0059]
使用实施例一连续稀释好的puc57-eva71-vp1质粒，按实施例二的处理组进行标准的mcda扩增反应后，用lfb检测，结果如图4所示。图4从左到右对应的模板浓度依次为：4
×
106copies/ul(图4中的1)、4
×
105copies/ul(图4中的2)、4
×
104copies/ul(图4中的3)、4
×
103copies/ul(图4中的4)、4
×
102copies/ul(图4中的5)、4
×
10copies/ul(图4中的6)、4
×
100copies/ul(图4中的7)、4
×
10-1
copies/ul(图4中的8)，最右侧为空白对照(图4中的9)：使用1ul双蒸水代替模板。
[0060]
结果显示：mcda-lfb的检测范围为4
×
10
6-4
×
100copies/ul，lfb检测呈阳性(图4的1-7泳道)；当模板降低至4
×
10-1
copies/ul(图4的第8泳道)时，lfb结果为阴性。
[0061]
实验例5：引物检测的特异性测试
[0062]
以表2提供的各微生物为模板评价本发明提供引物的特异性。按实验例2的反应体系和方法进行，模板分别使用表1中的各微生物，用量均为1ul 4
×
104copies/ul。结果如图5所示。图5中1～16为10株不同来源的eva71模板，其余为其他菌毒株，48为空白对照。结果表明，mcda-lfb能够正确的检测靶序列。
[0063]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]