HFM1基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用的制作方法

hfm1基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明属于医学基因诊断领域，涉及遗传病非梗阻性无精子症的致病基因hfm1突变位点及其在基因诊断中的应用。


背景技术：

2.非梗阻性无精子症(noa)通常被认为是男性不育的一个非医学可控制的原因。这些患者占所有不育男性的10％，他们的无精子症的原因是精子发生异常。以卵胞浆内单精子注射(icsi)为标准治疗方式的体外受精技术的建立，使这些男性中的许多人通过手术从睾丸中取出精子成功地养育了一个孩子。
3.双脱氧链终止法即sanger测序：反应体系中包括目标dna片段、脱氧三磷酸核苷酸(dntp)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddntp)、测序引物及dna聚合酶等。测序反应的核心就是其使用的ddntp：由于缺少3'-oh基团，不具有与另一个dntp连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddntp可用来中止dna链的延伸。此外，这些ddntp上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
4.早期基于sanger法的测序设置了四个平行的测序反应，每一个反应中分别包括目标片段、dna聚合酶、测序引物、四种dntp和一种特定类型荧光(或放射性同位素)标记的ddntp(即不同的反应中分别为ddatp、ddgtp、ddctp及ddttp)。通过这样的配置，在不同的反应中dna链将会分别在a、g、c及t位中止，并形成不同长度的dna片断。这些片断随后可被凝胶电泳分开并显示出来。变性丙烯酰胺电泳有四个泳道，每个泳道对应一种碱基。电泳结束后通过放射自显影或紫外显影可读出x光片或凝胶影像。图像中的每一个暗带表示一个双脱氧核苷酸(ddatp，ddgtp，ddctp，ddttp)掺入后链终止的dna片段的结果。四个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取(从底部到顶部)dna序列，从而得到该目标片断的碱基排列顺序。随着sanger测序技术的发展，ddntp的标记技术有了很大的提高。不同种类的ddntp可以被不同荧光基团所标记，而这些荧光基团具有相同的激发波长和不同的发射波长，因而在光学上表现为不同的颜色。因此，测序反应可以在一个体系中进行，满足了业界对测序速度、自动化及通量不断提高的要求。
5.sanger操作简便，因此被广泛使用，在其基础上衍生出荧光自动测序技术等。基于荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用，用于人类基因组计划等项目。基于毛细管电泳技术，sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行，商用的产品包括life technologies的3130xl、3730xl、3500dx与3500dx xl测序仪及beckman的gexp遗传分析系统等。这类系统最长可测定600-1000bp的dna片段，且对重复序列和多聚序列的处理较好，序列准确性高。
6.中国专利文献cn 105112501 a,公开了一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒，包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对，遗传标记的核苷酸序列是dax-1基因的序列，所述序列的突变位点选自c.152g》a、c.312c》g、c.725c》t、c.766g》c、c.1153g》t、c.1279a》g和c.162g》a中的一个或多个；所述引物对选自primer 1、primer 2、primer 3或
primer 4引物对。通过大规模测序在非梗阻性无精子症病人中筛选出了dax-1基因7个新的突变位点，研究表明dax-1的上述突变可能导致非梗阻性无精子症的发生，从而能够通过使用本发明的试剂盒检测该突变来实现对男性不育症(尤其是非梗阻性无精子症)的诊断检测。
7.而目前关于hfm1突变位点及其在非梗阻性无精子症基因诊断中还未见报道。


技术实现要素：

8.本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒。
9.本发明的第二个目的是，检测试剂盒的用途。
10.本发明的第三个目的是，hfm1基因的用途。
11.为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对，所述遗传标记的核苷酸序列是hfm1基因的序列，所述序列的突变位点是c.1006+1g》t。
12.作为一个优选例，所述引物对，选自primer 1引物对，其中，所述primer1引物对的上游引物的序列如seq id no:1所示，其下游引物的序列如seq id no:2所示。
13.为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：检测试剂盒在诊断非梗阻性无精子症的应用。
14.为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：hfm1基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用。
15.本发明优点在于：本发明提供了hfm1基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行非梗阻性无精子症基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的snp位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行hfm1基因突变位点的快速检测。优生优育，早期诊断疾病，辅助临床治疗决策，实现个体化精准治疗，减轻患者经济负担，对实现健康中国的发展方针有促进作用。
附图说明
16.图1是hfm1基因突变患者家系图。
17.图2是hfm1基因突变患者及其父母sanger测序峰图。
18.图3是hfm1基因突变患者睾丸组织pas染色。
具体实施方式
19.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
20.实施例1
21.实验方法
22.1.外周血dna提取(tianamp genomic dna kit,dp:304)
23.1)在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取第一个家系成员外周静脉血2-5ml，放入edta抗凝管内，-80℃冻存备用；
24.2)取200ul冻存血液，加入20ul proteinase k溶液，混匀
25.3)加入200ul缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
26.4)4.加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
27.5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400
×
g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
28.6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400
×
g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
29.7)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(13,400
×
g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
30.8)重复加入600ul漂洗液pw操作一次。
31.9)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(13,400
×
g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
32.10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40ul去离子水，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400
×
g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
33.2.pcr扩增目的基因(2
×
hieffpcr master mix(with dye))
34.pcr扩增目的片段：反应条件与反应体系：
35.反应体系(50ul)
[0036][0037]
扩增程序：pcr反应条件：94℃5min；94℃30sec，55℃30se,72℃30sec，30-35cycles；72℃10min。
[0038]
3.sanger测序检测基因突变位点
[0039]
pcr产物测序：应用常规sanger测序法对上述pcr产物进行测序，在该家系中验证了hfm1基因：nm_001017975:exon8:c.1006+1g》t。在gnomad中未发现人群相同位点突变频率；应用spidex预测发现，该突变为damaging。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组dna样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
[0040]
引物列表：
[0041][0042]
hfm1基因突变患者家系图见图1，
ⅱ‑
1为先证者，携带hfm1纯合点突变(c.1006+1g》t)，父母为近亲结婚，均为杂合携带者，遗传方式为常染色体隐性遗传。
[0043]
取hfm1基因突变患者及其父母外周血，进行sanger测序验证，结果显示父母均为hfm1基因突变(c.1006+1g》t)杂合携带者，符合家系遗传共分离。见图2，hfm1基因突变患者及其父母sanger测序峰图。
[0044]
取该hfm1基因突变患者睾丸组织，4％pfa固定，石蜡包埋，切片后pas染色，结果显示生精阻滞病理表型。见图3，hfm1基因突变患者睾丸组织pas染色。
[0045]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。