一株葡萄座腔菌MB1及其用途

一株葡萄座腔菌mb1及其用途
技术领域
1.本发明涉及应用微生物学技术领域，具体涉及一株葡萄座腔菌mb1及其用途。


背景技术：

2.水产养殖业在生产和加工过程使用抗生素，主要是预防(预防剂)和治疗(治疗药)细菌病。饲料中添加抗生素可以防治水产疾病、促进水产产量增加和节约饲料。但是，经常使用抗生素会在养殖环境中的菌群中形成耐药性，一旦致病力强的细菌对人畜共用的抗生素获得了耐药性，人类感染后，有可能本来有效的抗生素疗效会减小甚至无效。另外，残留在水产品中的抗生素进入人体，直接影响人类的健康。因此，寻找新型的抗菌药物是世界上新药开发的重点领域。微生物资源丰富，种类繁多，各种微生物发酵产物一直是医药上的重要资源。
3.水产养殖动物终身生活在养殖水环境中，养殖水体、水产动物体表和肠道内均有大量微生物，这种体内外的微生态环境对水产养殖动物健康均有直接或间接的影响。通过筛选出有抑菌效果的药物，可为今后水产临床药物申报提供参考依据。


技术实现要素：

4.为解决上述的技术问题，本发明人从污染的对虾饲养中分离出一株优势菌(mb1)，对其进行了分子鉴定和抗菌研究，旨在为对象细菌病害的防控提供参考。运用微生物技术，挖掘更多具有抑菌活性的微生物提取物，对于防治水产养殖动物的细菌病害具有重要的意义。
5.本发明的第一个目的是提供一株葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)mb1。
6.本发明的第二个目的是提供一种葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)的提取物，所述的提取物为乙酸乙酯提取物。
7.优选地，所述的葡萄座腔菌为葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)mb1。
8.优选地，是以葡萄座腔菌作为发酵菌株，经液体发酵获得发酵培养物，然后分离菌丝体和发酵液，取发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩后得到的葡萄座腔菌发酵提取物。
9.更优选地，所述的液体发酵是将葡萄座腔菌接种到发酵培养基中，于28℃、120r/min液体发酵培养，得到发酵培养物。
10.最优选地，所述的发酵培养基每升是通过以下方法制备：用500ml蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso40.75g、维生素b110mg，用水补足至1l，ph自然，得到发酵培养基。
11.本发明的第三个目的是提供上述葡萄座腔菌的提取物在抗细菌或制备抗细菌药物中的应用。
12.优选地，所述的抗细菌为抗金黄色葡萄球菌(s.aureus)或枯草芽孢杆菌(b.subtilis)。
13.利用本发明的葡萄座腔菌提取物进行抗菌实验，通过实验发现，该提取物在500μ
g/ml含量下对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径平均值分别为17.2mm和14.6mm。
14.本发明的第四个目的是提供一种抗细菌药物，其含有上述葡萄座腔菌的提取物。
15.本发明的第五个目的是提供葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)在抗金黄色葡萄球菌 (s.aureus)或枯草芽孢杆菌(b.subtilis)中的应用。
16.与现有技术相比，本发明的优势在于：
17.本发明的葡萄座腔菌提取物具有明显的抗细菌活性，表明该提取物具有很好的应用开发前景，因此本发明为研究与开发新的抗菌药物提供了基础，对于防治水产养殖动物的细菌病害具有重要的意义。
附图说明
18.图1为葡萄座腔菌mb1的菌落培养特征和显微镜形态，其中a为mb1在pda平板培养7天后的正反面菌落培养特征；b分别为mb1在leica dm6显微镜下观察的菌丝形态。
19.图2为基于its序列构建的葡萄座腔菌mb1与各种衍生模式(ex-type)菌株的最大似然法(ml)系统发育树，标尺为0.005；实心圆形标记的序列即为葡萄座腔菌mb1菌株。
20.图3为葡萄座腔菌mb1发酵提取物抗细菌效果图，其中a为氨苄青霉素(左)和dmso(右) 对金色葡萄球菌的抑制效果图；b为氨苄青霉素(左)和dmso(右)对枯草芽孢杆菌的抑制效果图；c为mb1发酵提取物(圆圈标记的编号5)对金色葡萄球菌的抑制效果图；d为mb1 发酵提取物(圆圈标记的编号5)对枯草芽孢杆菌的抑制效果图。
具体实施方式
21.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
22.本发明具体实施方式中所使用的pda培养基是通过以下方法获得：用500ml蒸馏水煮 200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso40.75g、维生素b110mg，琼脂20g，用水补足至1l，ph自然，灭菌备用。
23.本发明具体实施方式中所使用的lb培养基配方为蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl 5g、水 1l，lb培养基ph值控制在7.2-7.4。
24.实施例1菌株的分离纯化、菌落培养特征、显微镜形态观察及分子鉴定
25.1.1菌株的分离、纯化：
26.称取污染的对虾饲料3g于灭菌锥形瓶中，用生理盐水分别稀释至浓度为106cfu/ml，吸取浓度为106cfu/ml的菌液200μl置于已冷却至合适温度的pda培养基(含20μg/ml硫酸卡那霉素和20μg/ml氨苄青霉素)中，28℃恒温箱培养3～7d后挑取单菌落到新pda培养基上继续纯化直至获得纯菌株。
27.1.2菌株的菌落培养特征和显微镜形态观察
28.从上述培养基中切取小块培养物，接种于pda平板上，观察pda培养基菌落培养特征 (图1a)。取适量菌丝，镜检，观察菌丝、孢子等形态学特征(图1b)。mb1菌株经过平皿培养特性观察，该菌株在pda培养基上生长5d后，菌丝布满整个培养皿，；菌丝初期为白色至灰白色，逐渐转为深灰至黑色，气生菌丝发达，有疏松到致密，呈绒毛状。形态学特征：从光学显微镜下可以看到，菌丝有明显的隔膜，部分菌丝呈葡萄串状；但是在显微镜下未见有分生孢
子产生。根据以上培养性状和形态特征，初步判定为葡萄座腔菌，记为mb1。
29.1.3菌株的分子鉴定：
30.将所述的菌株mb1采用真菌基因组dna提取试剂盒提取菌株的基因组dna，作为pcr 扩增的模板。pcr扩增采用真菌rdna内转录间隔区(rdna its)通用引物its1 (5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，正向)和its4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，反向) 通过pfu酶(诺唯赞)进行pcr扩增分离菌株的rdnaits区，采用20μl反应体系。pcr程序:预变性94℃3min；变性94℃30s，退火56℃15s，延伸72℃1min，35个循环；延伸72℃5min。pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，交由深圳华大基因科技服务有限公司测序。测序所得的碱基序列如seq id no.1所示。
31.下载hattoriy et al.(2021)关于座腔属分类系统的各种衍生模式(ex-type)菌株及外类群cophinforma atrovirens cbs 124934基因序列和测序所得的its序列运用mega 5.0软件通过最大似然法(maximumlikelihood，ml)构建系统发育树(图2)，采用tamura-nei+g模型，使用所有位点，自展(bootstrap)1000次检验。菌株mb1和botryosphaeria sinensis maff410827聚在一起，具有高度自展支持率。结合1.2的菌落培养特征、显微镜形态特征和分子系统学分析确定该菌为葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)，命名为葡萄座腔菌 (botryosphaeria dothidea)mb1。
32.实施例2葡萄座腔菌mb1的活化、发酵培养及提取物制备
33.2.1菌株活化
34.将实施例1得到的纯菌株葡萄座腔菌mb1接种于pda平板中，于28℃培养5d，得到活化后的菌种。所述斜面培养基通过以下方法获得：用500ml蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso40.75g、维生素b110mg，琼脂20g，用水补足至1l，ph自然，分装至18cm
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18cm试管中，灭菌备用。
35.2.2mb1菌株液体发酵培养物的获得
36.将步骤2.1活化培养后的菌株接种至pda液体培养基中，于28℃、120r/min振荡条件下培养7d，得到种子液。所得种子液以10％的体积比的接种量接种到pda液体发酵培养基中，于28℃、120r/min培养7d，得到发酵培养物。
37.2.3mb1菌株发酵提取物制备
38.将步骤2.2所得的发酵培养物除菌丝体后得到的滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液经减压浓缩至恒重后即为本发明的葡萄座腔菌mb1提取物。
39.实施例3葡萄座腔菌mb1提取物的抗菌活性测定
40.3.1供试细菌的培养
41.将枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌接种到lb培养基平板上30℃培养3天，待菌体生长好备用。挑取斜面细菌至5ml lb液体培养基中，30℃，180r/min振荡条件下培养24h,备用。
42.3.2平板抑菌试验
43.采用滤纸片法测定葡萄座腔菌mb1提取物对金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌的抗菌活性。将实施例2获得的葡萄座腔菌mb1提取物用dmso溶解，并稀释至浓度为500μg/ml。
44.将液体发酵获得的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的菌液分别用生理盐水分别稀释至浓度为106cfu/ml，吸取浓度为106cfu/ml的菌液200μl置于平板中，倒入已冷却至合
适温度的lb培养基，混合均匀。用无菌镊子夹取厚度为1.5mm、直径为6mm的滤纸片置于含菌平板上，同时在滤纸片上分别滴加mb1提取物稀释液5μl为样品组，以dmso代替mb1 提取物稀释液作为空白对照组(ck)，以浓度为200μg/ml的氨苄青霉素(ddh2o配制)作阳性对照组，将平板置于37℃恒温箱培养24h，结果如图3所示。用十字测量法测量抑菌圈直径的大小，重复三次，用十字交叉法测量抑菌圈直径的平均值，结果如表1所示。
45.表1葡萄座腔菌mb1提取物对细菌的抑制作用
[0046][0047]
注：阳性对照氨苄青霉素浓度为200μg/ml，葡萄座腔菌mb1提取物浓度为500μg/ml。
[0048]
从表1实验结果可以看出，葡萄座腔菌mb1提取物对金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌具有明显的抗细菌作用，表明该提取物具有很好的应用开发前景，可应用于制备抗细菌药物。因此，本发明为研究与开发新的抗菌药物提供了物质基础，对于防治水产养殖动物的细菌病害具有重要的意义。
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以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。