一种查尔酮衍生物及其制备方法与用途

1.本发明属于药物技术领域，尤其涉及一种查尔酮衍生物及其制备方法与用途。


背景技术：

2.查尔酮是一种重要的异黄酮基团，具有两个通过三碳α，β-不饱和羰基桥连接的苯环(a环和b环)，是合成黄酮类化合物的重要中间体。查尔酮类化合物由于其特殊结构，可能与不同的受体结合，因此往往具有较广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗过敏和抗炎等。
3.白血病是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病，是我国十大高发恶性肿瘤之一，近几年的白血病发病率和死亡率呈波动上升趋势。friend病毒插入位点1(fli-1)基因是近年来发现的e26家族转化特异性转录因子，可调控包括细胞增殖、分化与凋亡在内的多种生理过程。在friend小鼠白血病逆转录病毒(f-mulv)诱导的红白血病中，fli-1的激活是主要的遗传改变，fli-1的过表达通过激活ras通路导致促红细胞生成素依赖的有核红细胞不断增殖，分化受阻，从而导致红白血病的发生。虽然已有针对fli-1表达调控的查尔酮衍生物被设计出来，但存在靶向性或药效不够理想的问题。


技术实现要素：

4.为解决现有技术存在的问题，本发明设计合成了新型结构的二烯丙基化查尔酮，溶解性能佳，通过体内外实验鉴定了新型二烯丙基化查尔酮可靶向抑制红白血病特异性基因fli-1的表达，进而诱导细胞凋亡和调控细胞周期来抑制红白血病细胞的增殖，有望在制备抗白血病药物中发挥重要作用。
5.本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
6.本发明提供一种查尔酮衍生物，该衍生物的化学名称为：3,2
′‑
甲氧基-4-异丙氧基-4
′
,6
′‑
二(甲氧基甲氧基)查尔酮，其结构式如式ⅰ所示：
[0007][0008]
本发明提供的查尔酮衍生物通过引入甲氧基甲基取代，显著改善了查尔酮衍生物的溶解性能，拓宽了应用范围。
[0009]
相应地，本发明还提供查尔酮衍生物的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
1)中间体m1的制备：于反应器中，加入原料2,4,6-三羟基苯乙酮(s1)和无水二氯甲烷(dcm)，在氩气保护条件下，-5～5℃下依次加入n,n-二异丙基乙胺(dipea)、氯甲基甲醚(momcl)，搅拌反应10～30h；反应完全后，反应液加水淬灭后，以乙酸乙酯和水分散、萃取，所得有机层经饱和nacl洗涤、无水mgso4干燥后，减压回收溶剂至干，所得残留物经硅胶柱层析纯化，得中间体m1；
[0011][0012]
2)中间体m2的制备：于反应器中，加入所述步骤1)制得的m1、无水碳酸钾、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，在氩气保护条件下，缓慢滴加碘甲烷，室温搅拌反应15～30h；反应完全后，反应液以乙酸乙酯和水分散，萃取，所得有机层经饱和nacl洗涤、无水mgso4干燥后，减压回收溶剂至干，所得残留物经硅胶柱层析纯化，得中间体m2；
[0013][0014]
3)目标化合物的制备：于反应器中，加入所述步骤2)制得的中间体m2、原料3-甲氧基-4-异丙氧基-苯甲醛(s2)，在氩气保护条件下，依次加入乙醇、1,4-二氧六环，完全溶解后，缓慢滴加naoh水溶液，室温搅拌反应15～30h；反应完全后，反应液以乙酸乙酯和盐酸溶液分散，萃取，所得有机层依次用水、饱和nacl洗涤后，经无水mgso4干燥，减压回收溶剂至干，所得残留物经硅胶柱层析纯化，得目标化合物。
[0015][0016]
优选地，所述步骤1)的反应温度为0℃，反应时间为17h；所述步骤2)的反应时间为24h；所述步骤3)的反应时间为24h。
[0017]
优选地，所述步骤1)的硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，从体积比10:1至1:1进行梯度洗脱；所述步骤2)的硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，从体积比10:1至1:1进行梯度洗脱；所述步骤3)的硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，从体积比10:1至1:1进行梯度洗脱。
[0018]
更优选地，所述硅胶柱的填料平均粒径为200～300目。
[0019]
此外，本发明还提供查尔酮衍生物在制备抗白血病药物中的用途。
[0020]
优选地，本发明还提供查尔酮衍生物在制备抗红白血病药物中的用途。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供一种新型结构的查尔酮衍生物，溶解性能佳，通过体内外实验鉴定了该查尔酮衍生物可靶向抑制红白血病特异性基因fli-1的表达，进而诱导细胞凋亡和调控细胞周期来抑制红白血病细胞的增殖，有望在制备抗白血病药物中发挥重要作用。此外，本发明提供了查尔酮衍生物的制备方法，该制备方法较简单，原料易得，工艺稳定，产物收率和质量较高，适于大规模的制备。
附图说明
[0022]
图1为mtt法测定wzh-254对两种细胞生长的细胞存活率曲线结果图；其中，1-a为
wzh-254对hel细胞生长的细胞存活率曲线结果图；1-b为wzh-254对k562细胞生长的细胞存活率曲线结果图。
[0023]
图2本发明提供的二烯丙基化查尔酮衍生物的体外抗白血病活性结果图；其中，2-a为wzh-254诱导细胞凋亡的染色观察结果图；2-b为流式细胞术检测wzh-254对hel细胞凋亡影响的结果图；2-c为流式细胞术检测wzh-254对hel细胞周期的影响结果图；与对照组相比，*p《0.05，**p《0.01(n＝3)。
[0024]
图3本发明提供的二烯丙基化查尔酮衍生物对红白血病小鼠脾组织特异性基因fli-1表达的影响结果图；其中，3-a为本发明查尔酮衍生物治疗红白血病小鼠流程图；3-b为脾脏肿大结果图；3-c为小鼠的器官系数(n＝7)；3-d为死亡潜伏期用于绘制kaplan-meier生存曲线结果图；3-e为红白血病小鼠红血细胞比容结果图；3-f为f-mulv病毒对红白血病小鼠脾脏病毒载量的影响结果图；3-g为western blot检测红白血病小鼠的脾细胞中fli-1蛋白的表达情况结果图；与dmso组相比，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001(n＝7)；与wzh-254组相比，#p《0.05,##p《0.01,###p《0.001(n＝7)；dmso组与wzh-254(3mg/kg)比较，
△
p《0.05，
△△
p《0.01，
△△△
p《0.001(n＝7)。
[0025]
图4本发明提供的二烯丙基化查尔酮衍生物对红白血病特异性基因fli-1表达的调控结果图；其中，4-a为rt-pcr检测wzh-254对hel细胞中fli-1mrna的影响结果图；4-b为western blot技术检测wzh-254对hel细胞中fli-1蛋白的影响结果图。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0027]
本发明中，所涉及的实验材料为常规市售产品或可通过本领域的常规技术手段获得，所使用的检测方法按本领域的通用方法或试剂盒说明书进行。
[0028]
本实验中，所用的两株人白血病细胞系(hel和k562)，以及含有f-mulv克隆57的nih-3t3细胞来自贵州省中国科学院天然产物重点实验室。四甲基偶氮唑蓝(mtt)粉末、二甲基亚砜(dmso)、焦碳酸二乙脂(depc)和dnaladder，购自北京索莱宝公司；rpmi-1640培养液、dmem培养液及pbs，购自美国hyclone公司；胎牛血清(fbs)，购自四季青公司；96孔板，购自美国nest公司，trypsin-edta购自美国hyclone公司，trizol购自美国invitrogen公司，逆转录试剂盒(hifiscript cdna synthesis kit)，购自康为世纪公司；引物和蛋白上样缓冲液(5x)，购自昆明贝尔吉科技有限公司；bsa、fli-1(ab153909，1:1000)和gapdh(#2118s,1:1000)购自上海安妍公司。
[0029]
实验动物为balb/c小鼠，spf级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号scxk(京)2019-0008。主要仪器包括：odyssey r clx双色红外激光成像系统、u：genius3一体机凝胶成像系统，购自中国香港gene公司；nanodrop 2000微量核酸定量仪购自thermo scientific公司。
[0030]
实施例1关键中间体的制备
[0031]
1.中间体m1的合成制备
[0032][0033]
于50ml反应瓶中，加入原料2,4,6-三羟基苯乙酮(s1，3.97g,23.60mmol)和无水二氯甲烷(20ml)，氩气保护，0℃下依次加入dipea(7.80ml,47.20mmol)，momcl(3.58ml,47.20mmol)，0℃搅拌反应17h。反应完全后，反应液加水淬灭后，以乙酸乙酯和水各100ml分散、萃取，所得有机层用饱和nacl洗涤，无水mgso4干燥，减压回收溶剂至干，所得残留物经200～300目硅胶柱层析纯化，采用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，从体积比10:1至1:1进行梯度洗脱，得2.21g白色固体m1，质量收率36.5％。esi-ms m/z:279.2[m+na]
+
；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ13.70(s,1h),6.25(d,j＝2.4hz,1h),6.23(d,j＝2.4hz,1h),5.24(s,2h),5.15(s,2h),3.50(s,3h),3.45(s,3h),2.64(s,3h).
[0034]
2.中间体m2的合成制备
[0035][0036]
于10ml反应瓶中，加入m1(2.05g,8.00mmol)、无水碳酸钾(1.22g,8.80mmol)、dmf(5ml)，氩气保护，缓慢滴加碘甲烷(0.55ml，8.80mmol)，室温搅拌反应24h。反应完全后，反应液以乙酸乙酯和水各100ml分散，萃取，所得有机层用饱和nacl洗涤，无水mgso4干燥，减压回收溶剂至干，所得残留物经硅胶柱层析纯化，采用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，从体积比10:1至1:1进行梯度洗脱，得1.88g乳白色油状物m2，质量收率87.0％。
[0037]
实施例2目标化合物的制备
[0038][0039]
于25ml反应瓶中，加入中间体m2(313.80mg,1.16mmol)、原料s2(230.01mg,1.18mmol)，氩气保护，依次加入etoh(8ml)、1,4-二氧六环(6ml)完全溶解后，缓慢滴加0.7ml含6.97mmol naoh的水溶液，室温搅拌反应24h。反应完全后，反应液以100ml乙酸乙酯和50ml 1mol
·
l-1
盐酸分散，萃取，所得有机层依次用水、饱和nacl洗涤，无水mgso4干燥，减压回收溶剂至干，所得残留物经硅胶柱层析纯化，采用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，从体积比10:1至1:1进行梯度洗脱，得482.82mg淡黄色固体，质量收率86.9％。esi-ms m/z:469.2[m+na]
+
；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.28(d,j＝16.4hz,1h),7.08
–
7.04(m,2h),6.86(d,j＝8.9hz,1h),6.84(d,j＝16.0hz,1h),6.51(d,j＝1.9hz,1h),6.37(d,j＝1.9hz,1h),5.20(s,2h),5.11(s,2h),4.59(hept,j＝6.1hz,1h),3.87(s,3h),3.76(s,3h),3.52(s,3h),3.39(s,3h),1.39(s,3h),1.38(s,3h).
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ194.64,159.86,158.58,155.93,150.37,149.87,145.42,127.84,127.17,122.94,114.55,114.07,110.87,96.05,94.73,94.71,94.13,71.39,56.43,56.39,56.10,56.06,22.10.
[0040]
实施例3：二烯丙基化查尔酮衍生物的体外抗白血病活性
[0041]
1.实验方法
[0042]
(1)mtt法检测细胞的增殖抑制实验
[0043]
分别取传三代状态良好的hel和k562细胞，将细胞浓度调整到6
×
105/ml并接种于96孔板中，每个孔中加入100μl细胞原液，放置于37℃培养箱里孵育24h后，加入不同浓度的本发明查尔酮衍生物，每个浓度5个复孔。在37℃培养箱里分别持续处理24h、48h和72h后，在倒置荧光显微镜拍照。然后，每个孔分别加入20μl mtt，37℃孵育4h，常温3000rpm/min离心30min。再用吸水纸吸出96孔板中的液体，加入150μl dmso，室温震荡15min，在490nm激发光下用酶标仪检测吸光度(od)，结果如图1所示。
[0044]
(2)hoechst 33258染色检测化合物对细胞凋亡的影响
[0045]
将hel细胞以每孔1
×
106个细胞的初始密度播种在6孔板中，用不同浓度的本发明查尔酮衍生物(0、1、2和4μmol/l)处理48h，随后将处理过的细胞收集在ep管中，用pbs洗涤两次。使用hoechst 33258染色试剂盒检测染色质凝结情况。染色后的浓缩细胞核及时在带摄像头的荧光显微镜下进行拍照。染色质凝结和破碎是凋亡细胞的标志。
[0046]
(3)tunel染色检测化合物对细胞凋亡的影响
[0047]
将hel细胞以每孔1
×
106个细胞的初始密度播种在6孔板中，用不同浓度的本发明查尔酮衍生物(0、1、2和4μmol/l)处理48h。使用一步法tunel染色试剂盒，通过tdt酶介导的dutp缺口末端标记(tunel)检测评估细胞中的dna片段化。将细胞悬浮液收集在ep管中，经过消毒、透化后与tunel反应混合物在室温下暗中孵化。然后在荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况。
[0048]
(4)jc-1染色法检测本发明化合物对细胞线粒体膜电位的影响
[0049]
将hel细胞以每孔1
×
106个细胞的初始密度播种在6孔板中，用不同浓度的本发明查尔酮衍生物(0、1、2和4μmol/l)处理48h。使用jc-1线粒体膜电位染色试剂盒，测定查尔酮衍生物在诱导细胞凋亡的过程中是否涉及细胞膜电位的改变，荧光倒置显微镜下观察细胞颜色的变化并拍照记录。
[0050]
(5)流式细胞术检测化合物对细胞凋亡的影响
[0051]
将传三代的hel细胞以3
×
105/ml的浓度接种于6孔板中，培养24h后，dmso作对照组，加入不同浓度的本发明查尔酮衍生物，分别设三个平行实验。48h后收集细胞，用pbs洗涤两次，用1
×
binding buffer缓冲液调细胞浓度至1
×
106/ml，5μl fitc和5μl pi加入到细胞中。轻轻混合，室温下避光孵育15min。立即用流式细胞仪检测凋亡。
[0052]
(6)流式细胞术检测化合物对细胞周期的影响
[0053]
取传三代以上的hel细胞以3
×
105/ml的浓度接种至6孔板中，培养24h后，加入不同浓度的本发明查尔酮衍生物，对照组加入对应体积的dmso,分别设三个平行实验。48h后收集细胞，用预冷的pbs清洗细胞两次，400μl pbs重悬细胞，在细胞中加入25μl pi和5μl rnasea，在常温避光孵育10min。立即用流式细胞仪检测细胞周期。
[0054]
2.研究结果
[0055]
本发明提供的新型二烯丙基化查尔酮衍生物wzh-254以剂量和时间依赖性的方式抑制红白血病细胞hel的增殖，但对慢性髓系白血病细胞k562无显著的抑制作用(分别如图1-a和1-b所示)，这说明wzh-254的抗白血病活性具有显著的选择性。通过显微镜观察发现该处理后的hel细胞随着化合物浓度的增加，细胞数量显著减少，且出现了明显的凋亡小
体；tunel染色结果发现，与对照组相比1μmol/l时绿色细胞的数量没有增加，即dna没有断裂；但从2μmol/l开始，绿色细胞的数量逐渐增加，dna出现了明显的断裂；jc-1染色在荧光倒置显微镜下观察发现随着wzh-254浓度的增加，被染成红色的细胞逐渐减少，而绿色细胞量逐渐增加，这说明wzh-254在诱导hel凋亡时，伴随着细胞膜电位的下降(如图2-a所示)。进一步运用流式细胞术研究表明hel细胞经过化合物处理24h后，hel细胞出现了明显的凋亡，且集中于凋亡晚期(如图2-b所示)；2μmol/l和4μmol/l的化合物处理hel细胞的凋亡率接近50％，与对照组相比，差异具有统计学意义(p《0.01)。通过流式细胞术研究了本发明化合物wzh-254对hel细胞周期的影响如图2-c所示，结果表明，与对照组(dmso)相比，该化合物可将hel细胞的周期阻止在g1期，g1期的比例呈剂量依赖性增加，s期的比例逐渐减少，说明wzh-254可显著调控hel细胞的细胞周期。综上所述，wzh-254可通过诱导细胞凋亡和调控细胞周期进而抑制hel细胞的增殖。
[0056]
实施例4:二烯丙基化查尔酮衍生物的体内抗红白血病活性
[0057]
1.实验方法
[0058]
(1)红白血病小鼠的造模和二烯丙基化查尔酮衍生物的处理实验
[0059]
培养含有f-mulv克隆57的nih-3t3细胞，培养48h后收集f-mulv病毒液并分装至1.5ml ep管中，放至-80℃冰箱保存备用。腹腔注射新生48h内的balb/c小鼠(n＝7)f-mulv病毒液100μl/只。感染五周后每隔一天注射本发明查尔酮衍生物wzh-254或dmso，3mg/kg，共注射七次。
[0060]
(2)红白血病小鼠的存活率、红血细胞比容测定
[0061]
①
日常观察小鼠状态，记录死亡时间。解剖小鼠后取心、肝、脾、肺、肾及胸腺组织并称重后计算脏器系数；
[0062]
②
摘眼球抗凝取血，以全自动血球计数仪进行白细胞(wbc)计数、红细胞(rbc)计数。
[0063]
(3)红白血病小鼠病毒载量测定
[0064]
trizol试剂提取脾细胞中病毒rna，参照试剂盒说明进行逆转录反应，制备cdna，反应总体积为20μl，反应在42℃孵育60min，95℃5min终止反应。参照试剂盒说明进行pcr反应，反应体系总体积为50μl，pcr反应循环参数设置为：预变性温度94℃，2min；变性温度94℃，30s；退火温度55℃，30s；延伸温度72℃，1min。共35个循环，72℃保温2min。pcr产物的定量采用琼脂糖凝胶电泳，genius 3一体机凝胶成像系统记录图像并分析。
[0065]
(4)二烯丙基化查尔酮衍生物对红白血病小鼠脾组织特异性基因fli-1表达的影响
[0066]
红白血病小鼠脾脏组织提取总蛋白，通过western blot检测wzh-254对红白血病小鼠中fli-1蛋白表达的影响。
[0067]
2.研究结果
[0068]
解剖小鼠后发现，与dmso组相比，wzh-254组的脾脏肿大得到了一定程度的缓解(如图3-a和3-b所示)；短期治疗结果表明，wzh-254对红细胞白血病有明显的抑制作用，明显延长了红细胞白血病小鼠的生存期(如图3-c所示)。本发明观察到用二烯丙基化查尔酮衍生物wzh-254治疗的红白血病小鼠的血细胞读数明显高于dmso(如图3-d所示)。如图3-e所示，dmso组脾脏病毒载量较高，条带较亮；wzh-254组病毒载量明显减弱；而正常对照组未
检出病毒rna。如图3-f所示，用western blot检测3只经wzh-254或dmso组(1-3组)处理的白血病小鼠的脾细胞，以确定所指示蛋白的表达，可见经wzh-254治疗组小鼠脾脏fli-1表达降低。如图3-g所示，wzh-254可抑制红白血病小鼠的脾细胞中fli-1蛋白的表达。
[0069]
实施例5：二烯丙基化查尔酮衍生物对红白血病特异性基因fli-1表达的调控
[0070]
1.实验方法
[0071]
用不同浓度的wzh-254(0、1、2和4μmol/l)处理48h后，提取总rna和蛋白，分别用rt-pcr和westernblot检测wzh-254对hel细胞中fli-1基因在转录和翻译水平表达的影响，gapdh作为内参。
[0072]
2.研究结果
[0073]
fli-1作为影响细胞增殖和凋亡的重要基因之一，在细胞中异常表达也是癌变的信号，所以控制fli-1的异常表达也是治疗癌症的方法之一。为了检测wzh-254对hel细胞中fli-1的影响，采用不同浓度的wzh-254持续处理hel细胞48h后，使用rt-pcr和western blot测定了fli-1在mrna和蛋白水平的表达。结果显示，fli-1在mrna和蛋白水平被wzh-254不同程度地抑制(如图4-a和4-b所示),在2和4μmol/l时，具有显著性差异(**p《0.01)。
[0074]
综上所述，本发明提供的二烯丙基化查尔酮衍生物具有良好的抗红白血病活性。
[0075]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。