基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法及试剂盒。


背景技术：

2.结核病是由结核分支杆菌感染引起的慢性传染病。结核病已成为全球严重的公共卫生问题，耐多药结核病和广泛耐药结核病是目前临床亟待解决的难题之一。因此，快速、准确地检测标本中结核分枝杆菌，对于控制结核病是至关重要的。
3.利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，该药对结核分枝杆菌(mtb)和部分非结核分枝杆菌(包括麻风分枝杆菌等)在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。该药物自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的关键药物，而且，利福平耐药是耐多药结核的标志，因此，对结核分枝杆菌利福平耐药性的检测非常必要。
4.氟喹诺酮类药物又称吡啶酮酸类，属于人工化学合成抗菌药。临床上常用氟喹诺酮类药物主要有诺氟沙星、培氟沙星(pefloxacin甲氟哌酸)、依诺沙星 (enoxacin氟啶酸)、氧氟沙星(ofloxacin氟嗪酸)和环丙沙星(ciprofloxacin 环丙氟哌酸)。近几年，又不断研制并上市多氟化喹诺酮类新品种，如洛美沙星(lomefloxacin)、氟罗沙星(fleroxacin多氟哌酸)和二氟沙星(difloxacin 双氟哌酸)等。随着喹诺酮类抗菌药物在结核分枝杆菌感染中使用的增多，结核分枝杆菌对该类抗菌药物的耐药率逐渐上升。因此，对氟喹诺酮耐药突变的检测已成为必要。
5.异烟肼，又名4-吡啶甲酰肼、异烟酸肼，其对结核分枝杆菌有高度选择性、较强的抑制和杀灭作用，其生物膜穿透性好，由于疗效佳、毒性小、价廉、口服方便，故被列为首选抗结核药。由于异烟肼已有约五十年的使用历史，部分病人所感染的结核菌已经产生了耐药性，因此对异烟肼耐药突变的检测也具有必要性。
6.目前，临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和分子检测两类。表型检测法是建立在培养基础上的，通过对比观察结核分枝杆菌在含药和不含药培养基中的生长情况来检测其耐药性，是目前耐药性检测的“金标准”。绝大多数常用的表型检测需要结核分枝杆菌纯培养物，其生长慢的特性决定了该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导致结果的不确定性。
7.已有的基因型检测方法有实时荧光定量pcr法、基因芯片法、反向杂交法、 dna测序法等，但存在操作步骤繁杂、对人员技术水平要求较高，设备昂贵，无法检测所有突变区域等缺点。因此，本领域亟需开发一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、可对多种药物耐药性结核分枝杆菌同时进行检测的方法。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法及试剂盒，本发明以探针熔解曲线技术为依托，开发得到一种可快速鉴别结核杆菌复合群方
法，可以同时判定其对异烟肼、利福平和氟喹诺酮类药物的耐药性。
9.为此，第一方面，本发明提供一种检测结核分枝杆菌复合菌群的多重引物，其包括插入序列is6110、mpb64基因、rpob基因、katg基因、inha基因和gyra基因的特异性引物对；所述特异性引物对的序列为：
10.f-is6110：ctcagcggattcttcggtcgtggtc(seqidno：1)；
11.r-is6110：tgaggtcgcccgtctacttggtgtt(seqidno：2)；
12.f-mpb64：acatcagcctgcccagttactaccc(seqidno：3)；
13.r-mpb64：tcagcctgccacagcgtgtcata(seqidno：4)；
14.f-rpob：tggaggcgatcacaccgcagac(seqidno：5)；
15.r-rpob：gtgcacgtcgcggacctccagcc(seqidno：6)；
16.f-katg：tggagcagatgggcttggg(seqidno：7)；
17.r-katg：ccagcagggctcttcgtca(seqidno：8)；
18.f-inha：cggaaatcgcagccacgttac(seqidno：9)；
19.r-inha：acgggatacgaatgggggtttg(seqidno：10)；
20.f-gyra：gcaatgttcgattccggcttcc(seqidno：11)；
21.r-gyra：cgggcttcggtgtacctcat(seqidno：12)。
22.进一步，所述多重引物还包括插入序列is6110、mpb64基因、rpob基因、katg基因、inha基因和gyra基因的特异性探针。
23.进一步，所述特异性探针的序列为：
24.p-is6110：cggcgcacccacttacgccg(seqidno：13)；
25.p-mpb64：ctggaaaattacatcgcccag(seqidno：14)；
26.p1-rpob：cattggcaccagccagctgagccaatg(seqidno：15)；
27.p2-rpob：cctgcttcatggaccagaacaacccgctggcagg(seqidno：16)；
28.p3-rpob：cctgctcggggttgacccacaagcgcgcagg(seqidno：17)；
29.p4-rpob：ccatggcgactgtcggcgctgccatgg(seqidno：18)；
30.p-katg：cctgcggacgcgatcaccagcggcagcagg(seqidno：19)；
31.p-inha：cctgccccgacaacctatcgtctcgccgcagg(seqidno：20)；
32.p1-gyra：cgaccgcagccacgccaagtcggtc(seqidno：21)；
33.p2-gyra：ccccgttcagttgccgagaccatgggg(seqidno：22)；
34.p3-gyra：cctgccaactaccacccgcacggcgacgcggcagg(seqidno：23)；
35.p4-gyra：cctgctcgatctacgacagcctggtgcggcagg(seqidno：24)；
36.p5-gyra：catggccctgccctggtcgctgcgccatg(seqidno：25)。
37.进一步，所述特异性探针的5’端修饰有荧光基团，选自下组fam、hex、rox、cy5、cy3、tet、joe、vic；所述特异性探针的3’端修饰有淬灭基团，选自下组bhq、dabcy1、tamra、mgb。
38.在一些实施方式中，所述插入序列is6110的特异性探针在5’端修饰有cy5荧光基团，在3’端修饰有bhq2淬灭基团；
39.所述mpb64基因的特异性探针在5’端修饰有cy5荧光基团，在3’端修饰有bhq2淬灭基团；
40.所述rpob基因的特异性探针在5’端修饰有fam荧光基团，在3’端修饰有bhq1淬灭基团；
41.所述katg基因的特异性探针在5’端修饰有rox荧光基团，在3’端修饰有 bhq2淬灭基团；
42.所述inha基因的特异性探针在5’端修饰有rox荧光基团，在3’端修饰有 bhq2淬灭基团；
43.所述gyra基因的特异性探针在5’端修饰有rox或vic荧光基团，在3’端修饰有bhq1或bhq2淬灭基团。
44.进一步，所述特异性探针包含以下修饰中的一种或两种：修饰为肽核酸 (pna)、锁核酸(lna)。
45.在一些实施方式中，以下特异性探针中，标有下划线的碱基修饰为锁核酸 (lna)：
46.p1-rpob：cattggcaccagccagctgagccaatg；
47.p2-rpob：cctgcttcatggaccagaacaacccgctggcagg；
48.p-inha：cctgccccgacaacctatcgtctcgccgcagg；
49.p2-gyra：ccccgttcagttgccgagaccatgggg。
50.本发明的第二方面，提供所述多重引物在检测结核分枝杆菌复合菌群中的应用，包括以待测样本的dna为模板，利用所述多重引物进行扩增和熔解曲线检测。
51.本发明的第三方面，提供所述多重引物在制备检测结核分枝杆菌复合菌群的试剂中的应用。
52.本发明的第四方面，提供一种检测结核分枝杆菌复合菌群的试剂盒，包括 dntps、dna聚合酶、(nh4)2so4、mgcl2、kcl、tris-hcl、本发明所述的多重引物。
53.在一些实施方式中，所述试剂盒包括体系a、体系b和dna聚合酶，所述体系a包括：dntps、(nh4)2so4、mgcl2、kcl、tris-hcl、f-is6110、r-is6110、 f-mpb64、r-mpb64、f-rpob、r-rpob、f-katg、r-katg、f-inha、r-inha、 f-gyra、r-gyra、p-is6110、p-mpb64、p1-rpob、p3-rpob、p-katg、p-inha、 p2-gyra、p4-gyra；
54.所述体系b包括：dntps、(nh4)2so4、mgcl2、kcl、f-is6110、r-is6110、f-mpb64、r-mpb64、f-rpob、r-rpob、f-gyra、r-gyra、p-is6110、p-mpb64、 p2-rpob、p4-rpob、p1-gyra、p3-gyra、p5-gyra。
55.进一步，所述dna聚合酶为热启动dna聚合酶。
56.进一步，所述dna聚合酶的工作浓度为0.05-0.2u/μl；例如0.05u/μl、 0.1u/μl、0.15u/μl、0.2u/μl等。
57.进一步，所述dntps的浓度为0.15-0.25mm；例如0.15mm、0.2mm、0.25 mm等。
58.进一步，每种特异性引物的浓度各自独立地选自0.02-0.5μmol/l；例如0.02 μmol/l、0.05μmol/l、0.1μmol/l、0.15μmol/l、0.2μmol/l、0.25μmol/l、0.3 μmol/l、0.35μmol/l、0.4μmol/l、0.45μmol/l、0.5μmol/l等。
59.进一步，每种特异性探针的浓度各自独立地选自0.02-0.5μmol/l；例如0.02 μmol/l、0.05μmol/l、0.1μmol/l、0.15μmol/l、0.2μmol/l、0.25μmol/l、0.3 μmol/l、0.35μmol/l、0.4μmol/l、0.45μmol/l、0.5μmol/l等。
60.进一步，所述(nh4)2so4的浓度为5-15mm；例如5mm、10mm、15mm 等。
61.进一步，所述mgcl2的浓度为2-5mm；例如2mm、2.5mm、3mm、4mm、 5mm等。
62.进一步，所述kcl的浓度为5-15mm；例如5mm、10mm、15mm等。
63.进一步，所述tris-hcl的浓度为10-30mm；例如10mm、20mm、30mm 等；所述tris-hcl的ph为8-8.5；例如8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5等。
64.进一步，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；例如：所述阴性质控品为水或生理盐水；所述阳性质控品含有所述插入序列is6110、mpb64基因的核苷酸序列，且无法被本发明所述的rpob基因、katg基因、inha基因和gyra 基因的特异性引物对扩增。
65.在一些实施方式中，所述试剂盒还包括dna提取液，所述dna提取液用于从待测样本中提取dna。
66.进一步，所述dna提取液包括乙二胺四乙酸二钠、tris和tritonx-100。
67.本发明的第五方面，提供一种结核分支杆菌复合菌群的检测方法，包括以下步骤：
68.(1)从待测样本中提取dna；
69.(2)以步骤(1)提取得到的dna作为模板，利用本发明所述的多重引物进行pcr扩增和熔解曲线检测。
70.所述检测方法用于非疾病诊断或治疗目的。
71.进一步，所述pcr扩增包括以下两个反应体系：
72.dntps、(nh4)2so4、mgcl2、kcl、tris-hcl、f-is6110、r-is6110、f-mpb64、 r-mpb64、f-rpob、r-rpob、f-katg、r-katg、f-inha、r-inha、f-gyra、r-gyra、 p-is6110、p-mpb64、p1-rpob、p3-rpob、p-katg、p-inha、p2-gyra、p4-gyra、 dna聚合酶、模板；
73.dntps、(nh4)2so4、mgcl2、kcl、f-is6110、r-is6110、f-mpb64、r-mpb64、 f-rpob、r-rpob、f-gyra、r-gyra、p-is6110、p-mpb64、p2-rpob、p4-rpob、 p1-gyra、p3-gyra、p5-gyra、dna复合酶、模板。
74.进一步，所述pcr扩增和熔解曲线检测的反应条件包括：
75.s1：95℃10min；
76.s2：95℃25s，70℃25s(每个循环降低1℃)，72℃30s，13个循环；
77.s3：95℃25s，58℃25s，72℃30s，42个循环，72℃30s处收集荧光信号；
78.s4：95℃1min，45℃1min；
79.s5：45～85℃，每1℃收集荧光信号。
80.根据本发明所述的检测方法，可通过对比待测样本和阳性质控品的熔解曲线，快速判断待测样本是否含有结核分支杆菌复合菌群，其是否具有利福平、异烟肼和/或氟喹诺酮耐药性：
81.通过对比待测样本与阳性质控品的熔解曲线所得cy5通道熔解温度(即 tm值)的差异判断待测样本是否为结核分枝杆菌复合群：当待测样本与阳性质控品间tm值一致或57.3℃与60.8℃的任有一个tm值(误差≤1℃)时判定为结核阳性；待测样本cy5通道无峰或与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为非结核样本；
82.当待测样本cy5判定为结合阳性时，其余三个通道中待测样本与阳性质控品间熔解曲线所得tm均一致(误差≤1℃)时判定为野生型，试验菌株对利福平、异烟肼及氟喹诺酮敏感；若管a或管b中fam通道样本与阳性质控品间tm值差异≥2℃判定为利福平耐药；若管a中rox通道样本与阳性质控品间 tm值差异≥2℃判定为异烟肼耐药；若管a或管b中vic通道
以及管b中rox 通道样本与阳性质控品间tm值差异≥2℃判定为氟喹诺酮耐药。
83.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
84.(1)本发明以探针熔解曲线技术为依托，开发得到一种可快速鉴别结核杆菌复合群方法，可以同时判定其对异烟肼、利福平和氟喹诺酮类药物的耐药性。
85.(2)插入序列is6110是结核分支杆菌基因组中的一个多拷贝的保守片段，且只存在于结核分支杆菌复合群中。该序列在大多数结核分支杆菌分离株中拷贝数较高(约10～25个)，本发明选择is6110作为结核分支杆菌复合群的阴阳性判断靶标，显著提高了检测的灵敏度。
86.(3)本发明选取利福平(rpob)、异烟肼(katg、inha)和氟喹诺酮(gyra) 耐药高频突变决定区设计引物、探针，从而可以快速判断待检样本是否为耐多药/广泛耐药。
87.(4)多重引物体系极易因引物二聚体、非特异性扩增等原因导致扩增结果不理想，本发明提供的多重引物体系设置合理，适于在相同的条件下于同一体系扩增，并且具有检测灵敏度高、准确率高等优点。
附图说明
88.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
89.图1为实施例3中反应体系a和b中cy5通道熔解曲线结果图；
90.图2为实施例3中反应体系a中fam通道熔解曲线结果图；
91.图3为实施例3中反应体系a中hex通道熔解曲线结果图；
92.图4为实施例3中反应体系a中rox通道熔解曲线结果图；
93.图5为实施例3中反应体系b中fam通道熔解曲线结果图；
94.图6为实施例3中反应体系b中hex通道熔解曲线结果图；
95.图7为实施例3中反应体系b中rox通道熔解曲线结果图。
具体实施方式
96.下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
97.实施例1提供引物、探针
98.本实施例提供引物对用于扩增结核分枝杆菌特异性基因is6110和mpb64，同时提供相应探针以确定是否为结核分枝杆菌复合菌群。另外，再根据利福平、异烟肼和氟喹诺酮耐药基因分别设计引物对、探针，用于检测rpob(507-513 位密码子)、gyra(67-106位密码子)、katg315位点、inha(-17～-8位密码子)。
99.探针5’端标记一种荧光基团(fam、vic、rox或cy5)，3’端标记淬灭基团bhq或dabcyl。由于rpob和gyra耐药基因较长，一条探针无法完全覆盖，故提供多条探针。本实施例提供的引物对和探针均通过blast进行同源性比对以保证其特异性。引物和探针由广州
金唯智生物科技有限公司合成。本实施例提供的结核分枝杆菌复合群检测体系引物和探针的具体序列参见表1。
100.表1引物和探针序列
[0101][0102][0103]
实施例2待测样本的dna提取
[0104]
本实施例以痰样作为待测样本，进行dna提取，包括以下步骤：
[0105]
(1)在痰样中加入3倍体积的4％的naoh溶液；涡旋振荡混匀，室温下放置15min，然后吸取1ml加入带旋盖的离心管中；
[0106]
(2)将步骤(1)的离心管12000rpm离心5min，弃去上清液；加入1ml 浓度为0.9％的nacl溶液，混匀，12000rpm离心5min，弃去上清液。
[0107]
(3)向步骤(2)得到的沉淀中加入100μl的dna提取液；100℃加热 10min，加热后迅速冷却(置于-20℃冰箱)10min。
[0108]
(4)将步骤(3)冷却后的离心管12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，即制备得到后续检测中所用的模板。
[0109]
实施例3反应液的制备与检测方法
[0110]
配制两个反应体系进行多重多色检测：
[0111]
反应体系a：1
×
pcr buffer((nh4)2so
4 10mm、mgcl
2 2.5mm、kcl 10mm、 ph为8.3的tris-hcl 20mm)，dntps 0.2mm，f-is6110、r-is6110、f-mpb64、 r-mpb64、f-rpob、r-rpob、f-gyra、r-gyra、f-katg、r-katg、f-inha、r-inha 各0.2μmol/l，p-is6110、p-mpb64、p1-rpob、p3-rpob、p2-gyra、p4-gyra、p-katg、p-inha各0.2μmol/l，2u热启动dna酶(0.3μl)，ddh2o配至总体积为20μl；加入待测模板5μl。
[0112]
反应体系b：1
×
pcr buffer((nh4)2so
4 10mm、mgcl
2 2.5mm、kcl 10mm、 ph为8.3的tris-hcl 20mm)，dntps 0.2mm，f-is6110、r-is6110、f-mpb64、r-mpb64、f-rpob、r-rpob、f-gyra、r-gyra各0.2μmol/l，p-is6110、p-mpb64、 p2-rpob、p4-rpob、p1-gyra、p3-gyra、p5-gyra各0.2μmol/l，2u热启动dna 酶(0.3μl)，ddh2o配至总体积为20μl；加入待测模板5μl。
[0113]
取浓度为100拷贝/μl的野生型(药物敏感型)标准质粒作为阳性对照，实施例2步骤(3)所述的dna提取液做为阴性对照。
[0114]
pcr反应程序为：
[0115]
第一步：95℃10min；
[0116]
第二步：95℃25s，70℃25s(每个循环降低1℃)，72℃30s，13个循环；
[0117]
第三步：95℃25s，58℃25s，72℃30s，42个循环；72℃30s处收集荧光信号；
[0118]
第四步：95℃1min，45℃1min；
[0119]
第五步：45～85℃，每1℃收集荧光信号，荧光通道选用fam、vic、rox 和cy5。
[0120]
结果判读：
[0121]
反应体系a中，参见图1，cy5通道结核分枝杆菌复合群阳性对照tm值为57.3℃
±
1℃和60.8℃
±
1℃的双峰；参见图2，fam通道野生型对照tm值为 62.2℃
±
1℃和81.2℃
±
1℃的双峰；参见图3，vic通道野生型对照tm值为 63.8℃
±
1℃和75.5℃
±
1℃的双峰；参见图4，rox通道野生型对照tm值为 64.5℃
±
1℃和74℃
±
1℃的双峰。
[0122]
反应体系b中，参见图1，cy5通道结核分枝杆菌复合群阳性对照tm值 为57.3℃
±
1℃和60.8℃
±
1℃的双峰；参见图5，fam通道野生型对照tm值为 70.3℃
±
1℃和80.4℃
±
1℃的双峰；参见图6，vic通道野生型对照tm值为64℃
ꢀ±
1℃和73.6℃
±
1℃的双峰；参见图7，rox通道野生型对照tm值为71.5℃
±
1℃ 的单峰。
[0123]
通过对比检测样本与阳性对照间熔解曲线所得cy5通道熔解温度(即tm 值)的差异判断样本是否为结核分枝杆菌复合群：当样本与阳性对照间tm值一致或57.3℃与60.8℃
的任有一个tm值(误差≤1℃)时判定为结核阳性性；样本cy5通道无峰或与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为非结核样本；
[0124]
当检测样本cy5判定为结合阳性时，其余三个通道中样本与阳性对照间熔解曲线所得tm均一致(误差≤1℃)时判定为野生型，试验菌株对利福平、异烟肼及氟喹诺酮敏感；若管a或管b中fam通道样本与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为利福平耐药；若管a中rox通道样本与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为异烟肼耐药；若管a或管b中vic通道以及管b中rox通道样本与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为氟喹诺酮耐药。
[0125]
实施例4试剂盒i
[0126]
本实施例提供一试剂盒，其包括管a、管b、dna聚合酶、阴性质控品和阳性质控品。
[0127]
管a：1
×
pcr buffer((nh4)2so
4 10mm、mgcl
2 2.5mm、kcl 10mm、ph 为8.3的tris-hcl 20mm)，dntps 0.2mm，f-is6110、r-is6110、f-mpb64、 r-mpb64、f-rpob、r-rpob、f-gyra、r-gyra、f-katg、r-katg、f-inha、r-inha 各0.2μmol/l，p-is6110、p-mpb64、p1-rpob、p3-rpob、p2-gyra、p4-gyra、 p-katg、p-inha各0.2μmol/l。
[0128]
管b：1
×
pcr buffer((nh4)2so
4 10mm、mgcl
2 2.5mm、kcl 10mm、ph 为8.3的tris-hcl 20mm)，dntps 0.2mm，f-is6110、r-is6110、f-mpb64、 r-mpb64、f-rpob、r-rpob、f-gyra、r-gyra各0.2μmol/l，p-is6110、p-mpb64、 p2-rpob、p4-rpob、p1-gyra、p3-gyra、p5-gyra各0.2μmol/l。
[0129]
dna聚合酶的浓度为5u/μl。在使用时，取管a溶液或者管b溶液19.7μl，加入0.3μl的dna聚合酶。
[0130]
其中，阳性质控品为野生型(药物敏感型)标准质粒，阴性质控品为dna 提取液或无菌水。
[0131]
通过使用本实施例提供的试剂盒i，可以以待测样本提取得到的dna为模板，进行结核分枝杆菌复合菌群检测。
[0132]
实施例5试剂盒ii
[0133]
本发明提供试剂盒ii，其在实施例4所述的试剂盒i的基础上，还包括了dna提取液。所述dna提取液的成分包括乙二胺四乙酸二钠、tris和tritonx-100。
[0134]
通过使用本实施例提供的试剂盒ii，可以从待测样本中提取dna，并且以提取得到的dna为模板进行结核分枝杆菌复合菌群检测。
[0135]
实施例6样品检测
[0136]
本实施例使用实施例5提供的试剂盒ii对500份待测样本分别进行dna 提取和结核分枝杆菌复合群检测(荧光pcr熔解曲线法)。检测结果显示，有 306份待测样本为结核分枝杆菌阳性菌株，其中118份为利福平耐药菌株，107 份为异烟肼耐药菌株，85份为氟喹诺酮耐药菌株。将本实施例的检测结果与临床药敏结果比较，该试剂盒的总准确率达96.08％，灵敏度96.58％，特异性 94.25％。
[0137]
具体步骤如下：
[0138]
(一)待测样本dna提取：
[0139]
(1)在痰样中加入3倍体积的4％的naoh溶液；涡旋振荡混匀，室温下放置15min，然后吸取1ml加入带旋盖的离心管中；
[0140]
(2)将步骤(1)的离心管12000rpm离心5min，弃去上清液；加入1ml 浓度为0.9％的
nacl溶液，混匀，12000rpm离心5min，弃去上清液。
[0141]
(3)向步骤(2)得到的沉淀中加入100μl的dna提取液；100℃加热 10min，加热后迅速冷却(置于-20℃冰箱)10min。
[0142]
(4)将步骤(3)冷却后的离心管12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，即制备得到后续检测中所用的模板。
[0143]
(二)配制反应体系：
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反应体系a
[0145]
试剂用量管a溶液19.7μldna聚合酶0.3μl模板5μl
[0146]
反应体系b
[0147][0148][0149]
阳性对照：以阳性质控品作为模板；阴性对照：以阴性质控品作为模板。
[0150]
(三)pcr扩增及检测：
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第一步：95℃10min；
[0152]
第二步：95℃25s，70℃25s(每个循环降低1℃)，72℃30s，13个循环；
[0153]
第三步：95℃25s，58℃25s，72℃30s，42个循环，72℃30s处收集荧光信号；
[0154]
第四步：95℃1min，45℃1min；
[0155]
第五步：45～85℃，每1℃收集荧光信号，荧光通道选用fam、vic、rox 和cy5。
[0156]
(四)试剂盒参考值：
[0157]
管a中cy5通道结核分枝杆菌复合群阳性对照tm值为57.3℃
±
1℃和 60.8℃
±
1℃的双峰；fam通道野生型对照tm值为62.2℃
±
1℃和81.2℃
±
1℃的双峰；vic通道野生型对照tm值为63.8℃
±
1℃和75.5℃
±
1℃的双峰；rox通道野生型对照tm值为64.5℃
±
1℃和74℃
±
1℃的双峰。
[0158]
管b中cy5通道结核分枝杆菌复合群阳性对照tm值为57.3℃
±
1℃和 60.8℃
±
1℃的双峰；fam通道野生型对照tm值为70.3℃
±
1℃和80.4℃
±
1℃的双峰；vic通道野生型对照tm值为64℃
±
1℃和73.6℃
±
1℃的双峰；rox通道野生型对照tm值为71.5℃
±
1℃的单峰。
[0159]
(五)结果判读：
[0160]
通过对比检测样本与阳性对照的熔解曲线所得cy5通道熔解温度(即tm 值)的差异判断样本是否为结核分枝杆菌复合群：当样本与阳性对照间tm值一致或只有60.8℃的单个tm值(误差≤1℃)时判定为结核分枝杆菌阳性；样本cy5通道无峰或与阳性对照间tm值差
异≥2℃判定为非结核分枝杆菌样本；
[0161]
当检测样本cy5判定为结合阳性时，其余三个通道中样本与阳性对照的熔解曲线所得tm均一致(误差≤1℃)时判定为野生型，试验菌株对利福平、异烟肼及氟喹诺酮敏感；若管a或管b中fam通道样本与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为利福平耐药；若管a中rox通道样本与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为异烟肼耐药；若管a或管b中vic通道以及管b中rox通道样本与阳性对照间tm值差异≥2℃判定为氟喹诺酮耐药。
[0162]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。