miRNA分子作为早期肺癌检测标志物的应用的制作方法

mirna分子作为早期肺癌检测标志物的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及mirna分子标志物在制备早期肺癌检测试剂中的应用。


背景技术：

2.早期筛查及诊断是降低肺癌死亡率的关键手段之一，而早期筛查的敏感性是评判筛查效果的一个重要方面。低剂量螺旋计算机断层扫描(low-dose spiral ct，ldct)是目前常用的肺癌筛查手段之一，已被证明能显著降低肺癌的死亡率，但存在一定的假阳性率，甚至还有可能产生潜在的辐射诱发癌变和增加医疗卫生费用等问题，并且对检测仪器有一定的要求，因此临床应用受限。其他常用的影像学检查尽管在肺癌筛查上发挥了重要的作用，但仍然存在漏诊或过度诊断等问题，难以作为肺癌早期筛查的有效方法，因此需要其他筛查手段加以补充。
3.近些年来，基于表观遗传学、液体活检和生物标志物等肺癌检测技术层出不穷，为肺癌早期筛查与诊断奠定了良好的基础。尽管多种血液肿瘤标志物已被广泛应用，但由于它们在检测癌细胞方面仍存在敏感性和特异性相对较低的情况，在肺癌早期诊断中均不能令人满意，因此必须探索新的潜在肿瘤标志物来提高筛查和诊断水平。
4.微小核糖核苷酸(microrna、mirna)是一类高度保守的、长度约22个核苷酸的内源性非编码rna分子，参与发育、分化、信号转导和宿主感染应答等生物过程，与肿瘤的发生、发展密切相关。mirna由于在肺癌患者的肿瘤组织、血液、痰液和胸腔积液等体液中稳定性高，能够快速定量，单独或联合联测有较好的灵敏度和特异度，目前在肺癌早筛早诊中有一定的应用价值。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种微小rna标志物(mirna分子标志物)在制备早期肺癌检测试剂中的应用。
7.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
8.在一个方面，本发明提供了mirna分子标志物在制备早期肺癌检测试剂中的应用，所述mirna分子标志物包括mir-99a-5p。
9.微小rna(mirna)选自以下组：初始mirna、前体mirna、成熟mirna；初始mirna能在人细胞内被剪切并表达成成熟mirna；前体mirna能在人细胞内被剪切并表达成成熟mirna。在一个具体优选的实施方案中，所述mirna分子标志物为成熟mir-99a-5p。
10.在本发明中，微小rna还包括组成型核酸分子的功能等同物(即变体)，其显示完整微小rna核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。所述变体与对应野生型mirna基因产物具有少于100％(例如90％以上，包括但不限于91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、
99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)的同一性且具有对应野生型mirna基因产物的一个或多个生物活性的mirna。
11.在本发明的一个实施方案中，所述早期肺癌为i期和ii期的非小细胞肺癌。所述肺癌早期指临床上确诊为i期和ii期的非小细胞肺癌，所述mirna标志物能够区分肺癌早期患者与健康人；在肺癌早期患者与健康人之间的表达水平具有统计学显著差异。
12.在本发明中，当测定样本中所述mirna分子的表达水平时，与健康对照相比，如待测样品中所述mirna分子标志物的表达水平显著改变(显著更高)，则显示其患有早期肺癌或罹患早期肺癌的风险很高。
13.在另一个方面，本发明提供了检测前述mirna分子标志物表达水平的试剂在制备筛查/诊断早期肺癌的产品中的应用，所述产品包括试剂盒、试纸或芯片。例如定量检测mir-99a-5p表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断早期肺癌的试剂盒中的应用。进一步地，所述试剂盒包括针对mir-99a-5p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于mir-99a-5p的部分或全部序列；所述试纸包括针对mir-99a-5p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对mir-99a-5p的引物和/或探针。
14.在一个实施方案中，所述试剂包括通过使用qrt-pcr、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测前述的mirna分子标志物(mir-99a-5p)的水平的试剂。
15.在一个实施方案中，检测试剂种类不受限制，只要能检测前面所述的mirna标志物表达水平的试剂均可，所述试剂包括用于检测mir-99a-5p表达的特异性引物和/或探针。
16.在一个实施方案中，所述试剂盒还包含逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、rna酶抑制剂中的一种或多种。
17.在一个实施方案中，所述筛查/诊断早期肺癌的产品用于测量受试者样品中所述mirna分子标志物的表达水平，将其与无患病对照样品的mirna分子标志物的表达水平进行比较。进一步地，与无患病对照样品相比，所述受试者样品中mirna显示显著更高的差异表达，检测或诊断所述受试者患有早期肺癌或罹患早期肺癌风险高。根据受试者mir-99a-5p与正常健康对照的表达水平差异，筛查受试者是否患有早期肺癌；如果检测结果显示受试者微mir-99a-5p或其前体的水平显著高于正常或对照样品中的水平，则提示所述对象早期肺癌预后不良。
18.在一个实施方案中，所述产品的检测对象为血清或血浆。
19.本发明中“微小rna”与“mirna”、“mir”通用具有相同的含义。
20.本发明的mirna分子标志物也可用于制备或筛选人早期肺癌的治疗药物中的应用。
21.在一个实施方案中，本发明还提供了所述mirna分子标志物的表达水平的检测方法包括：
22.(1)从受试者的外周血样本中获取血浆并提取总rna，逆转录得到cdna；
23.(2)测量所述前述mirna生物标志物的表达水平；采用相对定量法对血浆中mirna含量进行分析，得到mirna的相对表达量。
24.在一个实施方案中，本发明还提供了所述mirna分子标志物的筛选方法：
25.(a)提取早期肺癌患者(肺腺癌和肺鳞癌)病例组和无癌对照组的血浆样本，提取
的总rna，构建mirna文库并进行高通量测序分析；
26.(b)筛选出早期肺腺癌组与无癌对照组之间显著差异的mirna，以及早期肺鳞癌与无癌对照组之间显著差异的mirna，对于两组之间一致性差异表达的多个特异性mirna进行后续分析；
27.(c)使用qpcr验证mirna的差异表达趋势；将无统计学差异或特异性较差的mirna排除，筛选得到确定具有显著差异表达的，可用于肺癌早期检测的标志物mir-99a-5p；
28.进一步地，(d)通过将该标志物与肺癌发病风险之间的关系进行逻辑回归分析、通过受试者工作特征曲线(receiver operator characteristiccurve，简称roc曲线)对标志物的诊断价值进行评估，得出mir-99a-5p对肺癌早期诊断有较强的鉴别和预测能力，mir-99a-5p在检测肺癌新发病例的特异性达到了81.2％，曲线下面积为0.757，诊断准确性较好，可以提高肺癌早期筛查和诊断水平。
29.本发明筛选早期肺癌的mirna分子标志物mir-99a-5p，其可应用于检测、诊断、预后判断以及治疗早期肺癌，其可作为早期肺癌诊断的分子标志物或靶点，应用于早期肺癌临床早期诊断、预后判断或靶向治疗。
30.本发明中，术语“表达水平”是指特定的mirna序列从其基因组基因座被转录的的程度，即mirna在一个或多个被分析血清中的浓度。
31.本发明公开的mirna序列已经储存在天根生化科技(北京)有限公司官网的mirna引物库中。
32.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
33.本发明通过研究多个mirna表达水平与肺癌发病之间的关系，发现了多个mirna在早期肺癌患者中表达上调，从中筛选出mir-99a-5p，通过检测mir-99a-5p的表达水平，确定mir-99a-5p的表达水平在健康对照与早期肺癌患者之间存在显著差异，因此，mir-99a-5p可作为预测早期肺癌预后的一个因子，用于判断患者是否患有早期肺癌或者患早期肺癌的风险，从而进行早期肺癌的诊断和预后预测。
34.本发明提供了检测所述mirna分子标志物表达水平的试剂在制备筛查/诊断早期肺癌的产品中的应用，可以实现早期肺癌的诊断或筛查，为及时发现和掌握病情提供支持。mir-99a-5p易于检测和定量，具有较好的特异性和灵敏性，诊断价值高。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1为qpcr检测验证特异性mirna的相对表达量(***：p＜0.001，有显著差异)；
37.图2为本发明实施例提供的mir-99a-5p的roc曲线。
具体实施方式
38.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
40.实施例1：
41.1、研究对象
42.研究对象取自北京胸科医院标本库，均来自于2016年9月至2019年9月通过低剂量ct检查在北京地区开展的流行病学筛查研究。血浆样本包括以24例的新发病例为病例组和按照性别、年龄
±
5岁进行1:2匹配的48例同期进行筛查的未发病健康人群为无癌健康对照组。
43.纳入标准：
①
经组织病理学诊断明确，诊断标准参照中国原发性肺癌诊疗规范(2015版)；
②
临床相关资料完整，包括人口学特征，如年龄、性别、吸烟状况、职业暴露、病理诊断；
③
住院前未接受过放疗、化疗、免疫治疗等内科治疗以及外科手术治疗；
④
未并发其他肿瘤或器官功能障碍性疾病。
44.排除标准：
①
年龄》74岁(参考中国肺癌低剂量螺旋ct筛查指南(2018年版)；
②
肺内合并活动性炎症。本研究获得北京胸科医院伦理委员会批准。
45.2、研究方法
46.2.1标本采集与处理
47.用edta抗凝管采集全血5ml后，上下颠倒混匀，4℃条件下以转速为3000rpm离心10min；取上层血浆置于新的1.5ml rnase-free的离心管中，放到-80℃冰箱保存备用。
48.2.2mirna高通量测序
49.从早期肺癌患者(tnm分期为i-ii期，包括5例鳞癌、4例腺癌)和同期进行健康体检的4例无癌对照者外周血中获取血浆并提取总rna，经电泳质检合格后，使用qiaseq mirna library kit进行文库构建，应用illumina novaseq6000测序仪对mirna文库进行进行高通量测序分析，应用edger进行样本间差异mirna分析，从而筛选出差异表达的特异性mirna。
50.2.3特异性mirna检测
51.(1)mirna的提取和cdna合成：
52.将冻存样本于室温下融解后，置于4℃条件下以16000g转速离心10min后，取上层血浆200μl。按照商品化试剂盒(mircute血清/血浆mirna提取分离试剂盒，tiangen)的操作步骤进行mirna的提取，提取后的mirna溶解在20μl的无酶水中。使用nanodrop2000微量分光光度计测定其浓度与纯度，而后使用商品化试剂盒(mircute增强型mirna cdna第一链合成试剂盒，tiangen)，通过逆转录合成cdna。
53.(2)实时荧光定量聚合酶链式反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qpcr)：
54.取反转录产物5μl加45μl rnase-free水稀释。采用体积为20μl的商品化试剂盒[mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒(sybr green)，tiangen]进行qpcr检测，在quantstudio 7荧光定量pcr仪(thermo fisher scientific，美国)上检测mirna的表达。采用相对定量法对血浆中各mirna含量进行分析。以u6为内参，2-δct
作为其相对含量，其中δct＝ct mirna-ct u6。
99a-5p的熔解曲线平滑，仅有单一峰，引物特异性高。mir-184、mir-483-5p、mir-671-3p、mir-671-5p、mir-885-3p和mir-3940-3p的熔解曲线并非单一峰，可能原因为引物特异性较差，存在引物二聚体或是其他非特异性产物的产生，因此排除这6个mirna的后续研究。另外，经统计学分析，排除了表达量没有统计学差异的mirna(如mir-122-5p、mir-193a-5p、mir-199a-5p、mir-221-3p、mir-27b-3p、mir-574-3p)，最终确定具有统计学差异的mir-99a-5p进行下一步验证。
[0066]
3.3特异性mirna表达水平比较
[0067]
结果如表2与图1所示，mir-99a-5p在新发病例组和对照组中的表达水平存在差异，并且在新发病例组血浆样本中显著升高且具有统计学意义(p《0.001)。
[0068]
表2.两组间特异性mirna的相对表达量及比较
[0069][0070]
所使用的血浆mirna标志物的引物以及内参u6引物为购自天根生化科技(北京)有限公司，hsa-u6检测引物的产品货号为cd201-0145，hsa-mir-99a-5p检测引物的产品货号为cd201-0732。
[0071]
pcr反应程序设置为：
[0072][0073]
4、logistic回归分析
[0074]
将mir-99a-5p的相对表达量按照四分位数分组后，进行logistic回归分析，计算肺癌发病风险。结果(表3)显示在新发病例组与对照组的比较中，mir-99a-5p的第四分位数组的肺癌发病风险是第一分位数组的72.50倍(95％ci:3.52～1493.74)。
[0075]
表3.logistic回归分析
[0076][0077]
5、特异性mirna的诊断价值
[0078]
绘制roc曲线以评估mir-99a-5p在区分早期肺癌患者和无癌健康对照组的诊断价值，对肺癌发病均有预测价值(p《0.05)，见表4与图2。mir-99a-5p对早期肺癌检测的敏感度为66.7％、特异度为81.2％。
[0079]
表4.mir-99a-5p诊断价值
[0080][0081]
本发明将巢式病例对照研究应用到探讨mirna表达水平与肺癌发病之间的关系上，病例组为肺癌新发病例(早期肺癌)发病前的血浆，不同于以往其他研究中的患肺癌后的血浆，起到早期预测作用，更具早期筛查意义，能够更有效的分析mirna相对表达量与肺癌发病风险的关系。
[0082]
结果显示，mir-99a-5p对肺癌早期诊断有较强的鉴别和预测能力。mir-99a-5p在检测肺癌新发病例的特异性达到了81.2％，曲线下面积为0.757，诊断准确性较好。
[0083]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。