抗瓜类果斑病菌抗体及其应用的制作方法

1.本发明涉及植物病原体检测技术领域，具体而言，涉及抗瓜类果斑病菌抗体及其应用。


背景技术：

2.瓜类果斑病是西瓜、甜瓜上的一种毁灭性病害，由噬酸菌属燕麦种西瓜亚种(acidovorax citrulli)引起，是我国进境植物检疫性有害生物和农业检疫性有害生物。该病主要通过种子带菌传播。苗期和成株均可发病。瓜苗染病沿中脉出现不规则褐色病变，有的扩展到叶缘，从叶背面看呈水渍状，种子带菌的瓜苗在发病后1～3周即死亡。西瓜果实染病，初在果实上部表面现数个几毫米大小灰绿色至暗绿色水渍状斑点，后迅速扩展成大型不规则的水浸状斑，变褐或龟裂，致果实腐烂，分泌出一种粘质琥珀色物质，进一步发展，细菌透过瓜皮进入果内。该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎蔫，病瓜周围病叶上现褐色小斑，病斑通常在叶脉边缘，有时被一个黄色组织带包围，病斑周围呈水渍状是该病别于其他细菌病害的重要特征。对于该细菌病害，较为可行的控制措施是实行检疫控制其扩展，而这有赖于准确、快速、灵敏的检测技术的应用。
3.本发明的申请人此前曾提供了一种抗瓜类果斑病菌抗体(申请号 cn201410111292.6，公开日2014年06月25日)，虽然该抗体能够检测瓜类果斑病菌，但特异性和亲和力仍不够理想。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种抗体或其抗原结合片段，其能够特异性识别瓜类果斑病菌，包含氨基酸序列依次如seq id no:1～3所示的重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3以及依次如seq id no:4～6所示的轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3。
6.本发明的第二目的在于提供一种分离的核酸，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段。
7.本发明的第三目的在于提供一种载体，其包含如上所述的核酸。
8.本发明的第四目的在于提供一种宿主细胞，其包含如上所述的核酸或如上所述的载体。
9.本发明的第五目的在于提供一种含有如上所述抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
10.本发明的第六目的在于提供如上所述抗体或其抗原结合片段，或如上所述的试剂盒在检测瓜类果斑病菌中的应用。
11.本发明的有益效果为：相较现有技术所提供的抗瓜类果斑病菌抗体，本发明所提供的抗瓜类果斑病菌的单克隆抗体的特异性好，效价高，与瓜类果斑病菌不同分离物均起反应，具有较好的广谱性。应用于瓜类果斑病菌血清学诊断试剂中，特异性好，避免了交叉反应。本发明研制的瓜类果斑病菌的单克隆抗体可用于研制瓜类果斑病菌的免疫学诊断试9m、10-10
m、10-11
m、10-12
m或更强的亲和力(kd) 结合。
23.在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8 所示。
24.在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区(hcvr)的氨基酸序列如seq id no:7 所示，轻链可变区(lcvr)的氨基酸序列如seq id no:8所示。在一些实施方式中，所述hcvr的氨基酸序列与seq id no:7所示的hcvr序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；所述 lcvr的氨基酸序列与seq id no:8所示的lcvr序列具有至少80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
25.在一些情况下，抗体或其抗原结合片段的变体至少包括上述6个cdr；在一些情况下，抗体的变体至少包括一个重链和一个轻链，而在其他情况下，变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链(或其子部分)。在一些情况下，变体是在本发明所提供的抗体序列上发生保守突变(例如保守置换或修饰)所得到的。“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变，优选为保守置换。“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。
26.在一些实施方式中，所述抗体具有恒定区，重链恒定区序列选自igg、 iga、igm、ige、igd任意一种的恒定区序列；轻链恒定区为κ或λ链。
27.在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源选自兔、牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
28.在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有可检测的标记。
29.可检测的标记可选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。下面非限定部分列出这些标记：
30.·
产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
31.·
发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物和染料。
32.·
具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。
33.·
可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。
34.·
电子致密物质，如放射性分子(如
32
p，
35
s或
125
i)。
35.在一些实施方式中，可检测的标记选自碱性磷酸酶、吖啶酯、辣根过氧化物酶、三联吡啶钌、异鲁米诺或稀土元素中的一种或多种，优选为碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶。
36.本发明还涉及分离的核酸，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段。
37.在本文中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列，亦包括通过密码子优化以在期望的宿主细胞中更高效表达的变体。核酸通常是rna或dna，包
含基因、cdna分子、mrna分子以及它们的片段例如寡核苷酸。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链 dna。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用dna核酸。
38.此外，鉴于抗体为膜蛋白，所以核酸通常带有信号肽序列。
39.本发明还涉及载体，其包含如上所述的核酸。
40.术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或 m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。
41.在本发明中，载体可以为组合物，例如为多种质粒的混合物，不同质粒负载抗体或其抗原结合片段的一部分。
42.本发明还提供宿主细胞，其包含如上所述的核酸或如上所述的载体。
43.适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括：哺乳动物细胞诸如ns0、sp2/0、cho、cos、hek、成纤维细胞和骨髓瘤细胞。可以使用人细胞，因而允许分子用人糖基化模式来修饰。或者，可以采用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生和纯化的方法，是本领域已知的。
44.可以证明，细菌细胞可用作宿主细胞，其适合表达本发明的重组fab 或其他实施方案。但是，由于在细菌细胞中表达的蛋白倾向于未折叠的形式或不正确地折叠的形式或非糖基化形式，必须筛选在细菌细胞中产生的任何重组fab，以保留抗原结合能力。如果细菌细胞表达的分子以适当地折叠的形式产生，该细菌细胞将是期望的宿主，或者，在可替代的实施方案中，可以在细菌宿主中表达分子，然后随后进行重新折叠。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株，是生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其他芽孢杆菌属等的各种菌株，也可以用于该方法中。
45.如果需要，本领域技术人员已知的酵母细胞菌株以及昆虫细胞，例如果蝇和鳞翅目昆虫和病毒表达系统，也可用作宿主细胞。
46.在一些实施方式中，所述细胞基因组中插入有所述核酸，并且能稳定表达。
47.插入的方式可选用如上所述的载体，或者核酸不连入载体直接转入细胞内(例如脂质体介导的转染技术)。
48.根据本发明的一方面，还涉及含有如上所述抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
49.在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含包被缓冲液、封闭液、洗涤缓冲液、样品抽提缓冲液、抗体稀释缓冲液、显色溶液以及瓜类果斑病菌标准品中的至少一种。
50.本发明所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的如下1)-6)试剂中的至少一种：
51.1)包被缓冲液：溶剂为水，溶质为碳酸钠、碳酸氢钠；所述碳酸钠、所述碳酸氢钠在所述包被缓冲液中的终浓度分别为1.59g/l、2.93g/l，ph 值为9.6；
52.2)封闭液：含20g/l牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
53.3)洗涤缓冲液：含有体积分数0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液；
54.4)样品抽提缓冲液：溶剂为洗涤缓冲液，溶质为亚硫酸钠和聚乙烯基吡咯烷酮；
55.所述亚硫酸钠和所述聚乙烯基吡咯烷酮在所述样品抽提缓冲液中的终浓度分别为1.3g/l和20g/l；
56.5)酶标抗体稀释缓冲液：溶剂为所述洗涤缓冲液，溶质为聚乙烯基吡咯烷酮和牛血清白蛋白；所述聚乙烯基吡咯烷酮和所述牛血清白蛋白在所述酶标抗体稀释缓冲液中的终浓度分别为20g/l和2g/l；
57.6)底物溶液：溶剂为水，溶质为二乙醇胺；所述二乙醇胺在所述底物溶液中的终浓度分别为97ml/l，ph值为9.8。
58.在本发明中，以上1)-6)试剂中的所述聚乙烯基吡咯烷酮的分子量为 24000～40000。
59.在本发明中，以上1)-6)试剂中的所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾；所述氯化钠、所述磷酸二氢钾、所述磷酸氢二钠和所述氯化钾在所述洗涤缓冲液中的终浓度分别为8.0g/l、0.2g/l、1.15g/l、0.2g/l，ph值为7.4。
60.根据本发明的一方面，还涉及如上所述抗体或其抗原结合片段，或如上所述的试剂盒在检测瓜类果斑病菌中的应用。
61.检测对象可以为推定可能含有瓜类果斑病菌的样本，其可以分离自西瓜(citrulluslanatus)、甜瓜、厚皮甜瓜(cucuumis melo var.cantalupensis，包括哈密瓜，伽师瓜)、南瓜(cucurbita pepo)、黄瓜(cucumis sativus l.)、西葫芦(cucurbita pepo)、蜜瓜(cucuumis melo var..inodorus)和苦瓜等，也可以为田间的土壤或水等。
62.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
63.下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
64.瓜类果斑病菌(acidovorax citrulli)：引自ncppb，其ncppb编号为 3679。
65.balb/c小鼠：6-8周龄，雌性，购自中国军事科学院。
66.sp2/0骨髓瘤细胞：记载于“李桂芬、马洁、魏梅生等，番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测.植物检疫，2009，23(6)：16-18”一文，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
67.弗氏完全佐剂：sigma公司，产品目录编号为f5881。
68.弗氏不完全佐剂：sigma公司，产品目录编号为f5506。
69.下述实施例中elisa检测中所用到的各溶液配方具体如下：
70.包被缓冲液：将碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g溶于水，用水定容至1l； ph值为9.6。
71.封闭液：含20g/l牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液。其中，磷酸盐缓冲液的配方
为：将氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，氯化钾0.2g，溶于水中，用水定容至1l；ph值为7.4。
72.洗涤缓冲液：含有体积分数0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液。其中，磷酸盐缓冲液的配方为：将氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，氯化钾0.2g，溶于水中，用水定容至1l；ph值为7.4。
73.样品抽提缓冲液液：将亚硫酸钠1.3g和聚乙烯基吡咯烷酮20g溶于所述洗涤缓冲液中，用所述洗涤缓冲液定容至1l。
74.酶标抗体稀释缓冲液：将聚乙烯基吡咯烷酮20g和牛血清白蛋白(bsa) 2g溶于
75.所述洗涤缓冲液中，所述用洗涤缓冲液定容至1l。
76.底物溶液：将二乙醇胺97ml溶于水中，调节ph值至9.8，然后用水定容至1l。
77.如上各溶液中的聚乙烯基吡咯烷酮的分子量为24000～40000。
78.实施例1小鼠杂交瘤细胞株的获得及抗瓜类果斑病菌的单克隆抗体的制备
79.1、细菌培养
80.挑取kb平板培养基上的瓜类果斑病菌(acidovorax citrulli)ncppb 3679的单菌落，划线于kb平板培养基上，26℃培养48h，用生理盐水洗涤菌落至2ml离心管中，生理盐水洗涤2次，调浓度至108cfu/ml，用于小鼠免疫试验。
81.2、小鼠免疫
82.第一次免疫：取等体积的弗氏完全佐剂与步骤1获得的瓜类果斑病菌的菌悬液，乳化完全后腹腔注射balb/c小鼠，每只小鼠用量为108cfu瓜类果斑病菌。
83.第二次免疫：第一次免疫2周后进行第二次免疫，取等体积的弗氏不完全佐剂与步骤1获得的瓜类果斑病菌的菌悬液，乳化后进行腹腔注射，每只小鼠用量同第一次免疫。
84.第三次免疫：第二次免疫2周后，进行第三次免疫，方法和剂量同第二次免疫。
85.加强免疫：第三次免疫后1周尾静脉采血进行血清效价测定(间接 elisa法)，当血清效价达到1:104以上时用步骤1获得的瓜类果斑病菌的菌悬液直接腹腔注射balb/c小鼠加强免疫，用量为108cfu瓜类果斑病菌。
86.上述间接elisa法测定血清效价的步骤具体如下：
87.1)包被：在96孔酶标板中加入100μl浓度108cfu/ml的瓜类果斑病菌的菌悬液(溶剂为包被缓冲液)，37℃孵育2小时，用洗涤缓冲液洗涤3 次。
88.2)封闭：用封闭液封板，37℃孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤3次。
89.3)加待测样本：将100μl按一定比例稀释的待测的免疫后小鼠血清样本加至酶标板中，置湿盒中37℃条件下2小时，洗板4次。同时设置以未经免疫的小鼠血清作为待测样品的对照孔。
90.4)加酶标抗体：将马抗小鼠酶标抗体(购自中山金桥公司-美国 vector公司产品，商品目录号为w0426)用酶标抗体稀释缓冲液稀释1000 倍，每孔加100μl，置湿盒中37℃条件下2小时，用洗涤缓冲液洗板3次。
91.5)显色：将底物对硝基苯磷酸二钠(ρnpp，现配现用)按1mg/ml的浓度溶于底物溶液中，混匀，加入到酶标板孔中，每孔100μl。
92.6)读数：以405nm单波长测定各待测孔od值，以与阴性对照孔(以未经免疫的小鼠血清作为待测样品的对照)od值的比值(p/n)大于2.1 为限，作为判断血清效价的临界点。
elisa结果判定方法：效价用p/n》2.1 的血清的最大稀释倍数表示。
93.二、细胞融合和克隆化
94.在加强免疫后80小时进行细胞融合试验。将免疫小鼠的脾细胞与sp2/0 骨髓瘤细胞进行细胞融合(脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞的数量比例为9:1)。采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株；用浓度为 108cfu/ml的瓜类果斑病菌的菌悬液包被酶标板，采用间接elisa进行测定，筛选分泌抗体效价高且与对照菌不发生反应(见实施例2特异性实验) 的阳性单克隆细胞株。对阳性孔的细胞用有限稀释法克隆3次，使阳性率达100％。
95.上述间接elisa法筛选阳性细胞及测定抗体效价的步骤具体如下：
96.1)包被：在96孔酶标板中加入100μl浓度108cfu/ml的瓜类果斑病菌的菌悬液(溶剂为包被缓冲液)，37℃孵育2小时，用洗涤缓冲液洗涤3 次。
97.2)封闭：用封闭液封板，37℃孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤3次。
98.3)加待测样本：将100μl待测的杂交瘤细胞培养液加至酶标板中，置湿盒中37℃条件下2小时，洗板4次。同时设置以sp2/0细胞培养上清代替待测样品的对照孔。
99.4)加酶标抗体：将马抗小鼠酶标抗体(购自中山金桥公司-美国 vector公司产品，商品目录号为w0426)用酶标抗体稀释缓冲液稀释1000 倍，每孔加100μl，置湿盒中37℃条件下2小时，用洗涤缓冲液洗板3次。
100.5)显色：将底物对硝基苯磷酸二钠(ρnpp)按1mg/ml的浓度溶于底物溶液中，混匀，加入到酶标板孔中，每孔100μl。
101.6)读数：以405nm单波长测定各待测孔od值，以与阴性对照孔(以 sp2/0细胞培养上清代替待测样品的对照)od值的比值(p/n)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。elisa结果判定方法：若p/n》2.1，则判别为阳性细胞；效价用p/n》2.1的细胞培养液上清的最大稀释倍数表示。经间接elisa法筛选，6次亚克隆化获得了1株效价最高，且能稳定分泌瓜类果斑病菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定其分泌的单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为igg1型。通过测序，得知其重链可变区和轻链可变区序列分别为：
102.重链可变区
103.qvqlqqskvvhpvkpgalkisckesgiqpylydsnwvkqipgqkle wlgwifvnnvsikfgekfrgkatltadkssstaywqlssltsedsavyfcv vgfnpgamdywlqgwsvtvsa
104.轻链可变区
105.qavviqspstlsaplgdsstahaywmywiwlswyqdkvsltcmlliy kqksghtgdpsrlsgaerhnssaftltirslqpeyisteycqiqlnswtrtf ggtltleik
106.其中斜体为cdr序列。
107.实施例2抗瓜类果斑病菌的单克隆抗体的特异性检测
108.以实施例1中制备得到的抗体为实验组，以申请号cn201410111292.6，公开日2014年06月25日制备得到的抗体为对照组，进行如下检测。
109.瓜类果斑病菌(acidovorax citrulli)lmg 5376和表1中的对照菌。
110.表1抗瓜类果斑病菌的单克隆抗体特异性检测所用对照菌
[0111][0112][0113]
2、单克隆抗体的特异性检测
[0114]
(1)碱性磷酸酯酶标记的抗瓜类果斑病菌的单克隆抗体的制备
[0115]
取100μl碱性磷酸酯酶(sigma公司，产品目录号为：p6774-10ku) 加入到300μl的0.01m pbs(ph7.2)中，再加入10μl25％的戊二醛(alfaaesar公司，产品目录号为：a17876)混匀，室温(25℃)孵育活化1h，再加入0.5mg实验组或对照组中以相同方法纯化得到的单克隆抗体室温反应2h，即获得碱性磷酸酯酶标记的单克隆抗体。
[0116]
(2)特异性检测
[0117]
采用das-elisa方法，检测实施例或对比例抗体分别与对照菌有无交叉反应。具体步骤为：
[0118]
①
包被：采用瓜类果斑病菌包被抗体(购自acd公司，其产品目录号为b260-c1)按照使用浓度(2μg/ml)包被酶标板，100μl/孔，溶剂为包被缓冲液；37℃孵育2h，用洗涤缓冲液洗酶标板。
[0119]
②
加供试菌：分别加入用样品抽提缓冲液稀释的瓜类果斑病菌、对照菌的108cfu/ml浓度的菌液，100μl/孔，4℃冰箱过夜，用洗涤缓冲液洗酶标板。
[0120]
③
加酶标单抗：将按照体积比1:1000稀释的瓜类果斑病菌碱性磷酸酯酶标记的单克隆抗体(即步骤(1)制备得到的碱性磷酸酯酶标记的单克隆抗体)加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育4h，用洗涤缓冲液洗酶标板。
[0121]
④
显色：将底物对硝基苯磷酸二钠(ρnpp)按1mg/ml的浓度溶于底物溶液中，混匀，加入到酶标板孔中，每孔100μl，37℃避光放置，80min 后进行405nm读数。
[0122]
实验重复三次，结果取平均值。
[0123]
结果见表2。从表2可以看出，瓜类果斑病菌的od405nm值为3.031，而其余对照菌的od405nm值均小于0.2。可见，实验组获得的抗瓜类果斑病菌的单克隆抗体特异性好，与实验所用对照菌均没有交叉反应。
[0124]
表2单克隆抗体的特异性
[0125]
学名编号实施例对比例acidovorax citrullincppb 36794.3653.246acidovorax avenae subsp.avenaeatcc 193070.1191.216acidovorax avenae subsp.cattleyaeatcc 102000.1310.162acidovorax delafieldiiicmp 139250.1062.205acidovorax facilislmg 21940.1021.812acidovorax konjaciatcc 339960.1100.149acidovorax valerianellaeicmp134060.1080.116pseudomonas syringae pv.lachrymansncppb 2270.1210.144xanthomonas campestris pv.cucurbitaencppb 25670.1040.154clavibacter michiganense subsp.michiganenseatcc 144560.1020.162
[0126]
二、单克隆抗体与瓜类果斑病菌不同菌株的反应
[0127]
1、瓜类果斑病菌不同菌株的获得
[0128]
分别收集来自不同国际标准菌株库的瓜类果斑病菌标准菌株，具体见表3：
[0129]
表3
[0130][0131][0132]
2、单克隆抗体与瓜类果斑病菌不同菌株的反应
[0133]
采用das-elisa方法，检测实施例1获得的瓜类果斑病菌单克隆抗体与步骤1获得的瓜类果斑病菌不同分离物的反应。具体操作参见步骤一2 (2)，仅将步骤
②
中加入的供试菌改为步骤1获得的瓜类果斑病菌不同菌株，其用量为108cfu/ml(以瓜类果斑病菌量计)，每孔100μl。
[0134]
实验重复三次，结果取平均值。
[0135]
结果见表4，从表4可以看出，瓜类果斑病菌不同分离物的od405nm 值均大于3.3。
[0136]
可见，实验组获得的瓜类果斑病菌单克隆抗体与瓜类果斑病菌不同菌株的反应均呈阳性反应，具有较好的广谱性。
[0137]
表4单抗与瓜类果斑病菌不同分离物的反应
[0138]
编号实验组对照组
lmg 53763.7653.102lmg 54833.2462.139icmp 65223.1490.144icmp 65213.1621.123icmp 75003.1442.239ncppb 32443.1540.102ncppb 36793.9262.202ncppb 42023.1422.132atcc 296253.2022.364
[0139]
三、抗瓜类果斑病菌的单克隆抗体的灵敏度检测
[0140]
1、不同浓度瓜类果斑病菌的制备
[0141]
利用梯度稀释法制备浓度为2.1
×
108cfu/ml、2.1
×
107cfu/ml、2.1
×
10
6 cfu/ml、2.1
×
105cfu/ml、2.1
×
104cfu/ml、2.1
×
103cfu/ml的菌液 (ncppb 3679)分别进行灵敏度测试。
[0142]
2、单克隆抗体与不同浓度瓜类果斑病菌的反应
[0143]
采用das-elisa方法，检测实验组或对照组获得的瓜类果斑病菌单克隆抗体与步骤1获得的不同浓度瓜类果斑病菌的反应。具体操作参见步骤一2(2)，仅将步骤
②
中加入的供试菌改为步骤1获得的不同浓度瓜类果斑病菌，每孔100μl。实验重复三次，结果取平均值。
[0144]
结果见表5，从表5可以看出，制备的瓜类果斑病菌单克隆抗体灵敏度为。
[0145]
可见，实验组获得的瓜类果斑病菌单克隆抗体具有较好的灵敏度。
[0146]
表5单克隆抗体的灵敏度
[0147]
浓度梯度实验组对照组原液4.7523.49310倍稀释3.2173.051102倍稀释2.1311.178103倍稀释1.1620.210104倍稀释0.8850.205105倍稀释0.4330.130
[0148]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。