环状RNA分子表达元件以及环状RNA分子的表达载体circEXPRO

环状rna分子表达元件以及环状rna分子的表达载体circexpro
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于体外合成特异性环状rna分子的表达载体circexpro。


背景技术：

2.mrna表达系统是从低等原核生物到高等真核生物细胞内普遍存在的基因表达系统。在该系统表达过程中，存在于dna中的基因片段首先转录生成mrna序列，然后细胞以mrna序列为模型启动多肽链的合成过程(又称为翻译过程)，合成的多肽链再组装成有功能活性的蛋白质。真核生物细胞内的mrna序列通常具有典型的5'末端帽子结构和3'末端多聚腺苷酸结构，在多肽链合成过程中翻译起始因子需要准确识别5'末端帽子结构和3'末端多聚腺苷酸结构才能起始多肽链合成。而且mrna序列的稳定性非常差，在细胞内存在的时间很短。因此，在体外利用人工转录合成的mrna序列作为模板合成多肽链时，人工合成的mrna序列不具有天然的5'末端帽子结构和3'末端多聚腺苷酸结构以及稳定性差的问题是目前制约该工艺大规模应用的关键性问题。
3.环状rna(circular rna,circrna)是生物体细胞内一类特殊的单链闭合环状rna分子，由于没有游离的5'末端和3'末端，因此circrna比线性mrna更稳定。大多数circrna分子不具有编码多肽的功能，多作为细胞内的非编码rna，在调节基因表达方面发挥重要作用。但是，也有少数circrna分子，如circfbxw7、circmbl、circznf609等，在细胞内同样具有编码基因并翻译成多肽的能力。这些编码多肽的circrna分子通常在其基因编码序列的上游含有核糖体进入位点(internal ribosome entry site，ires)，以一种与mrna不同的方式启动多肽链合成过程。因此，环状rna表达系统是细胞内mrna表达系统外的另外一种蛋白质表达系统。由于环状rna表达系统只需要在环状rna分子中编码序列的上游插入ires表达元件，不依赖特殊的rna末端结构，且环状rna比mrna更稳定，因此环状rna表达系统是一种比mrna表达系统更理想的体外蛋白质表达系统，但目前尚未发现用于体外合成特异性环状rna分子的表达载体。
4.环状rna的体外转录过程和正常转录过程一样，需要以线性dna为模板，加入rna转录酶和ntp底物(atp、ctp、utp、gtp的混合物)，在反应缓冲液中于37℃条件下进行转录生成线性rna前体分子。体外转录生成的线性前体rna分子可借助dna连接酶通过桥接的方式进行环化(如图1所示)，也可以利用核酶的自剪切功能进行环化(如图2所示)。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于体外合成特异性环状rna分子的表达载体circexpro。
6.本发明的优点是：本发明所达到的技术效果：在体外快速合成可表达特异靶基因的环状rna分子。
7.一种环状rna分子表达元件，自5'端到3'端由互补臂1、核酶1、ires序列、多克隆位点、核酶2、互补臂2依次连接构成；
8.其中，所述互补臂1和互补臂2为互补配对的核苷酸序列，且互补臂1的5'端含有第一酶切点，互补臂2的3'端含有第二酶切位点，所述第一酶切位点和第二酶切位点为两种序列不同的酶切位点，且不与所述多克隆位点中的任一酶切位点相同；
9.所述多克隆位点包含若干限制性内切酶的识别位点，用于插入靶基因的核苷酸序列；
10.所述核酶1为anabaena核酶1，其核苷酸序列为seq id no:5gctgcaagagaatgaaaatccgttgaccttaaacggtcgtgtgggttcaagtccctccaccccca；所述核酶2为anabaena核酶2，其核苷酸序列为seq id no:6agacgctacggacttaaataattg agccttaaag。
11.在根据本发明的一个实施方案中，所述互补臂1为长约20个核苷酸的序列(seq id no:3 ccgtcgattgtccactggtc)；所述互补臂2为长约20个核苷酸的序列(seq id no:4 accagtggacaatcgacgg)。互补臂1序列与互补臂2序列在转录生成的单链rna分子中可反向互补形成双链结构，有利于rna环化。
12.在根据本发明的一个实施方案中，所述ires序列为：seq id no:7
[0013][0014]
在根据本发明的一个实施方案中，环状rna分子表达元件的核苷酸序列为seq id no:2：
[0015][0016]
本发明还提供了一种环状rna分子表达载体，包含上述的环状rna分子表达元件，以及骨架载体；
[0017]
其中，所述环状rna分子表达元件通过酶切后的黏性末端连接到所述骨架载体中；
[0018]
所述黏性末端分别位于所述环状rna分子表达元件的互补臂1的5'端和互补臂2的3'端。
[0019]
在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架载体选自promega公司的-t easy vector载体。
[0020]
在根据本发明的一个实施方案中，所述多克隆位点包含bgl ii、ecor i、aat ii、not i、xba i、xho i、sac ii、sal i、hind iii和sac i中的多个或全部。
[0021]
优选地，所述多克隆位点的核苷酸序列为seq id no:8。
[0022]
在根据本发明的一个实施方案中，环状rna分子表达载体的核苷酸序列为seq id no:1，
[0023]
[0024]
[0025][0026]
本发明还进一步提供了上述的环状rna分子表达元件或环状rna分子表达载体在制备特异性环rna表达分子、突变多肽或蛋白、或者重组融合多肽或蛋白中的应用。
[0027]
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
[0028]
①
将目的基因插入本发明提供的环状rna分子的表达载体circexpro后，无需利用活细胞，可直接将本载体线性化后作为模板，通过体外转录合成与目的基因对应的特异性环rna表达分子；
[0029]
②
本发明提供的表达载体circexpro通过体外转录合成的含特定靶基因的环状
rna表达分子，转入细胞或组织后可使靶基因在相应细胞或组织中表达；
[0030]
③
本发明提供的表达载体circexpro通过体外转录合成的含特定靶基因的环状rna表达分子具有常温下稳定，在细胞内表达持续时间较长的特点。
附图说明
[0031]
图1为线性前体rna分子通过桥接环化的示意图；
[0032]
图2为线性前体rna分子通过自剪切环化的示意图；
[0033]
图3为-t easy vector载体结构示意图；
[0034]
图4为环rna分子表达元件结构示意图；
[0035]
图5为鼠muc1基因表达产物的western blot鉴定结果图；
[0036]
图6为特异性环rna分子表达载体circexpro示意图。
具体实施方式
[0037]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
[0038]
相关材料、试剂、仪器说明
[0039]-t easy vector载体，购自promega公司，货号：a3600；
[0040]
限制性内切酶apa i(1005a)、bst x1(1027a)、ecor v(1042a)、nco i(1160a)、not i(1166a)购自takara公司；
[0041]
t4 dna连接酶(10799009001)为merck公司产品；
[0042]
trizol试剂购自thermo fisher scientific公司，货号15596026；
[0043]
m-mlv反转录酶(m5301)、rna酶抑制剂(n2511)、dntp混合物(u1511)、oligo(dt)(c1101)为promega公司产品；
[0044]
premix taq酶(rr902a)为takara公司产品；
[0045]
质粒提取试剂盒(d0026)为碧云天公司产品；
[0046]
凝胶纯化回收dna试剂盒(d2500-01)购自omega公司；
[0047]
rna合成试剂盒t7 high yield rna synthesis kit(e2050s)为new england biolabs公司产品；
[0048]
上游引物：seq id no:9 5
’‑
ccatggatgaccccgggcattcgggctc-3’；
[0049]
下游引物：seq id no:10 5
’‑
gcggccgcctacaagttggcagaag tggtc-3’；
[0050]
细胞：人宫颈癌hela细胞，小鼠乳腺癌4t1细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；
[0051]
细胞dmem培养基：购自美国hyclone公司，货号：sh30022.01b；
[0052]
胰酶：购自美国hyclone公司，货号：sh30042.01；
[0053]
pbs缓冲液：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：zli-9061；
[0054]
转染试剂lipofectamine messengermax(lmrna003)为invitrogen公司产品；
[0055]
细胞裂解液ripa：购自北京碧云天生物科技有限公司，货号：p0013b；
[0056]
兔抗鼠muc1抗体：购自abcam公司，货号：ab45167，使用浓度1：1000；
[0057]
β-actin抗体：购自美国thermo scientific公司，使用浓度1：3000；
[0058]
蛋白质含量测定试剂盒：bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，购自北京碧云天生物科技有限公司，货号：p0010。
[0059]
实施例1环状rna分子表达载体的构建
[0060]
以-t easy vector载体为基础，如图3所示。在载体中方框所示酶切位点处用相应内切酶将载体进行切割，然后插入一段如图4所示的环状rna分子表达元件。
[0061]
环状rna分子表达元件中包含的互补臂1(seq id no:3ccgtcgattgtccact ggtc)和互补臂2(seq id no:4 accagtggacaatcgacgg)(如图4所示)可互补配对为双链结构，辅助转录生成的rna前体分子进行环化；核酶1(anabaena核酶1，序列为seq id no:5gctgcaagagaatgaaaatccgttgaccttaaacggtcgtgtggg ttcaagtccctccaccccca)和核酶2(anabaena核酶2，序列为seq id no:6 agacgctacggacttaaataattgagccttaaag)(如图4所示)序列可通过其本身的自剪切功能，将转录生成的rna前体分子进行环化；ires序列(seq id no:7
[0062][0063][0063]
(图4中绿色区域)是细胞中核糖体特异性识别并结合的位点，为环状rna分子中特异靶基因的表达所需；多克隆位点(如图4所示)含有多个内切酶位点(包括bgl ii、ecor i、aat ii、not i、xba i、xho i、sac ii、sal i、hind iii、sac i，具体序列为：seq id no:8agatctgaattcgacgtcgcggccgctctagactcgagatccccgcgggtcgacaagcttggagagctc)，用于插入目的基因。整个环状rna分子表达元件大小为979bp，通过化学合成法全合成。环状rna分子表达元件的5
′
末端和3
′
末端分别设计了apa i和bst x1酶切位点，将全合成的片段经apa i和bst x1酶切后与-t easy vector载体片段进行连接，得到环状rna分子表达载体circexpro。该载体总大小为3884 bp，经序列测定确认。该载体的具体序列为seq id no:1。
[0064]
新设计构建的环rna分子表达载体为质粒型表达载体，具有氨苄青霉素抗性，可提纯后于-20℃保存，也可转化大肠杆菌后以菌株形式保存。
[0065]
实施例2鼠muc1基因环状rna表达载体的构建
[0066]
应当理解，本实施例仅用于阐述本发明提供的环状rna表达载体的构建方法，并非仅限于muc1基因环状rna表达载体的构建，其他靶基因同样可采取与下述相同或近似构建方法实现。
[0067]
1.鼠muc1基因的获得
[0068]
根据genbank中小鼠muc1基因序列(nm_013605.2)，利用rt-pcr技术将其编码区(总长1896bp)进行扩增并获取相应核酸片段。具体过程如下：
[0069]
1)总rna的提取：
[0070]
收集小鼠乳腺癌4t1细胞约2
×
106个，经pbs洗涤后加入1ml trizol试剂，上下颠倒充分裂解细胞，然后加入200μl氯仿，颠倒混匀后离心5分钟，吸取上层水相，并加入600μl异丙醇于室温沉淀10分钟，12000rpm离心10分钟，加入1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，再次离心后得到总rna。将总rna溶于无rna酶的去离子水，调整浓度为1μg/μl。
[0071]
2)将mrna反转录合成cdna
[0072]
采用m-mlv反转录酶对提取到的总rna进行反转录，反应总体积为20μl，包括2μg总rna、2μl oligo dt引物、4μl反应缓冲液、1μl dntp底物、1μl反转录酶、0.25μl rna酶抑制剂。混匀后，将pcr管置于pcr仪中按照如下反应程序进行：
[0073]
42℃1小时，
[0074]
70℃15分钟，12℃保存。
[0075]
反应结束后，产物置于冰上冷却或-20℃保存备用。
[0076]
c.pcr扩增反应
[0077]
扩增体系为25μl，包括上游引物(seq id no:9 5
′‑
ccatggatgaccccgggcattcgggctc-3
′
)0.5μl、下游引物(seq id no:10 5
′‑
gcggccgcctacaagttggcagaagt ggtc-3
′
)0.5μl、cdna模板1μl、2
×
taq pcr mastermix 12.5μl、h2o 10.5μl。
[0078]
反应程序为：94℃预变性30sec；
[0079]
95℃变性30s，
[0080]
55℃退火1min，
[0081]
72℃延伸2min，共30个循环；
[0082]
最后72℃再延伸5min。
[0083]
反应结束后，取5μl pcr产物于1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，剩余样品-20℃保存备用。
[0084]
2.鼠muc1基因环rna表达载体的构建
[0085]
a.pcr产物与circexpro表达载体的双酶切反应
[0086]
酶切反应体系为20μl，包括pcr产物或circexpro表达载体2μg，反应缓冲液2μl，内切酶nco i 1μl,内切酶not i 1μl，其余用水补足。将反应体系于37℃中温育3小时左右保证酶切完全。
[0087]
b.凝胶纯化回收目的片段(按照omega公司dna凝胶回收试剂盒操作说明进行)
[0088]
(1)酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶置于长波手提紫外灯下，切取目的条带置于ep管中，加入等体积的溶胶液binding buffer xp2，55℃温育至胶块完全溶解，冷却至室温后，将溶液转移至装在收集管上的吸附柱中，10000rpm，室温离心1分钟。弃去收集
管中的液体。
[0089]
(2)向吸附柱中加入300μl binding buffer xp2，10000rpm，离心1分钟。弃去吸附柱中液体。
[0090]
(3)加入700μl含乙醇的spw漂洗液，10000rpm，离心1分钟。弃去吸附柱中液体。
[0091]
(4)重复步骤(3)一次。将吸附柱放回收集管中，14000rpm，离心2分钟。
[0092]
(5)丢弃收集管，将吸附柱置于新1.5ml ep管上，置于室温静置2分钟左右，充分晾干吸附膜。向吸附柱膜中央滴加30-50μl elution buffer，室温静置2分钟，14000rpm离心2分钟，所得离心产物即为回收dna产物。
[0093]
c.muc1基因片段与载体连接
[0094]
将回收的酶切muc1基因pcr产物与酶切后的circexpro载体以摩尔数比为10：1的比例加入到pcr管中，同时加入0.5μl的t4 dna连接酶与1μl 10
×
dna ligase buffer，用ddh2o将反应体系补足至10μl，置于16℃恒温金属浴中连接过夜。
[0095]
d.转化
[0096]
于-80℃中取出感受态细胞置于冰上溶解，将连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30分钟。42℃热激90秒，立刻置于冰上冷却4-5分钟。加入600μl不含抗生素的lb液体培养基，置于37℃恒温摇床上220转，震荡活化30分钟。5000rpm，离心10分钟，弃去上清，留少量lb液体培养基重悬菌体，将悬液用玻璃棒均匀涂布在含抗生素的lb平板上(由于三个质粒均为氨苄抗性，因此应涂布在含氨苄青霉素的平板上)。37℃孵箱中倒置培养过夜。
[0097]
e.重组表达载体的鉴定
[0098]
挑取平板上的单菌落置于lb液体培养基中于37℃，220转震荡培养过夜，提取质粒后用nco i和not i进行双酶切，电泳初步鉴定正确后挑选阳性结果质粒送英潍捷基广州测序部进行序列测定。经序列比对，正确的质粒保存备用。命名为circexpro-muc1。
[0099]
实施例3鼠muc1基因环rna分子(circ-muc1)的体外转录与纯化
[0100]
1.转录模板的制备
[0101]
从细菌中提取上述构建的circexpro-muc1载体。用单酶切反应使载体线性化，酶切反应体系为20μl，包括质粒载体2μg，反应缓冲液2μl，内切酶ecor v 1μl，其余用水补足。将反应体系于37℃中温育3小时左右保证酶切完全。然后按照上述凝胶纯化回收dna片段的方法回收线性载体片段，该片段即可用作转录模板。
[0102]
2.鼠muc1基因环rna分子(circ-muc1)的体外转录
[0103]
采用t7 high yield rna synthesis kit(new england biolabs，e2050s)进行。具体步骤如下：
[0104]
(1)配制20μl反应体系，包括2
×
t7 transcript solution 10μl，线性转录模板0.5μg，t7 transcript enzyme mix 3μl，rnase-free h2o补充至20μl。
[0105]
(2)37℃反应2～4h，转录rna产量约100μg。
[0106]
(3)转录完毕后，向反应液中加入2μl rnase-free dnase i，37℃孵育15min，以去除dna模板。
[0107]
3.鼠muc1基因环rna分子(circ-muc1)的环化及分离纯化
[0108]
(1)在上述步骤(3)的产物中补充加入gtp，使其终浓度为2 mm,然后置于55 ℃反应15 分钟；
[0109]
(2)将反应产物加入硅胶柱中过柱纯化，75％乙醇洗涤后用无rnase水洗脱溶解。
[0110]
(3)取20 μg总rna溶于86μl无rnase水中，在65 ℃加热3分钟，并置于冰上冷却3分钟。加入20单位rnase r和10 μl rnase r反应缓冲液，在37 ℃反应15分钟，中间再补充10单位rnase r。
[0111]
(4)将反应产物加入硅胶柱中过柱纯化，75％乙醇洗涤后用无rnase水洗脱溶解，即为纯化的鼠muc1基因环rna，circ-muc1。
[0112]
实施例4鼠muc1基因环rna分子(circ-muc1)在细胞内的表达分析
[0113]
1.将鼠muc1基因环rna分子(circ-muc1)转入人宫颈癌hela细胞
[0114]
用invitrogen公司(lmrna003)的转染试剂lipofectamine messengermax，按照操作说明将4 μg纯化的circ-muc1转入3
×
10 5
个hela细胞中。
[0115]
2.鼠muc1基因环rna分子(circ-muc1)表达产物的western blot鉴定
[0116]
转染后48小时，收取细胞，提取细胞总蛋白，按照常规western blot程序用抗鼠muc1抗体检测muc1的表达情况，结果如图5所示。在正常hela细胞中无muc1蛋白表达，而转染鼠muc1基因环rna后细胞中大量表达muc1蛋白。
[0117]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。