一种具有抗氧化活性的六肽及其应用

1.本发明属于功能食品及生物医药领域，特别涉及一种具有抗氧化活性的六肽及其应用。


背景技术：

2.活性氧(ros)广泛存在于生物体细胞、组织中，具有信号传导、维持内环境稳定等重要的生理作用。然而，ros积累过多会引起机体产生氧化应激，造成细胞内生物活性大分子的氧化损伤，引发糖尿病、高血压、心血管疾病等慢性疾病。除此以外，氧化应激也是产生衰老的重要原因之一。
3.抗氧化剂可以减缓氧化应激带来的危害。食物是抗氧化剂的重要来源，世界卫生组织早已认识到抗氧化对健康的重要作用，一直主张在世界范围内增加饮食中抗氧化剂。与常用的抗氧化剂如bht、bha等相比，抗氧化肽具有分子量小、结构简单、活性强、易于吸收及无毒害等优点。
4.因此，从食物中研究并获得具有无毒副作用的新抗氧化肽，有广阔的发展前景和迫切需求。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有抗氧化活性的六肽。所述的六肽来源于天然产物，是食用酵母酶解产物经lc-ms/ms鉴定、筛选得到，研究发现其具有良好的抗氧化活性。
6.本发明的另一目的在于提供上述具有抗氧化活性的六肽的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种具有抗氧化活性的六肽，其氨基酸序列为色氨酸-缬氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-亮氨酸(trp-val-leu-asp-lys-leu)。
9.所述的具有抗氧化活性的六肽可通过本领域常规技术手段制备得到，例如通过固相合成制备。
10.上述具有抗氧化活性的六肽在制备抗氧化剂中的应用。
11.上述具有抗氧化活性的六肽在制备抗氧化功能食品中的应用。
12.上述具有抗氧化活性的六肽在制备血管内皮细胞保护药物中的应用。
13.一种抗氧化剂，含有所述的具有抗氧化活性的六肽。
14.一种抗氧化功能食品，含有所述的具有抗氧化活性的六肽。
15.一种血管内皮细胞保护药物，含有所述的具有抗氧化活性的六肽。
16.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
17.1.本发明的六肽具有良好的抗氧化活性，其对dpph清除的半最大效应浓度ec
50
为1.20mg/ml。
18.2.本发明的六肽是一种小分子多肽，理论等电点为7.0，分子量为772.93g/mol，结
构易于调控，容易合成、修饰、以得到更好的活力，具有明显的应用潜力。
19.3.本发明的六肽筛选自食用酵母的酶解产物，来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae(strain atcc 204508/s288c))的内源蛋白质：延伸因子1-α(蛋白质登录号：p02994)。食用酵母被列入fda发布的“一般认为安全”(gras)食品配料，安全性高。
附图说明
20.图1是固相合成六肽wvldkl色谱图。
21.图2是固相合成六肽wvldkl质谱图。
22.图3是不同浓度六肽wvldkl对dpph清除活性结果分析图。
23.图4是不同浓度六肽wvldkl还原力结果分析图。
24.图5是阳性对照gsh还原力分析图。
25.图6是六肽wvldkl对人脐静脉内皮细胞增殖影响结果分析图；其中，**和*分别表示样品组与氧化损伤组相比差异极显著(p《0.01)和差异显著(p《0.05)。
26.图7是六肽wvldkl对人脐静脉内皮细胞中mda含量影响结果分析图；其中，**和*分别表示样品组与氧化损伤组相比差异极显著(p《0.01)和差异显著(p《0.05)。
27.图8是六肽wvldkl对人脐静脉内皮细胞中sod活性影响结果分析图；其中，**和*分别表示样品组与氧化损伤组相比差异极显著(p《0.01)和差异显著(p《0.05)。
具体实施方式
28.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
29.实施例1
30.采用fmoc固相合成法人工合成制备序列为色氨酸-缬氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-亮氨酸(trp-val-leu-asp-lys-leu)的六肽。根据六肽的氨基酸残基组成，以氨基端具有芴甲氧羰酰基(fmoc-)保护基团的各种氨基酸(fmoc-trp、fmoc-val、fmoc-leu、fmoc-asp、fmoc-lys)为原料，将fmoc-leu的羧基以共价键与高分子树脂(wang树脂)相连；加入含20％(v/v)的哌啶的二甲基甲酰胺(dmf)，反应0.5h脱去氨基保护基fmoc-；加入过量的fmoc-lys，以羟基苯并三唑为缩合剂，在30℃下反应2h，使得fmoc-lys的羧基与树脂上leu的活性氨基缩合；重复脱保护基和缩合反应，依次连接余下的其它氨基酸后，将六肽从树脂上裂解，经c18柱分离纯化，冷冻干燥，制得该六肽。通过液相色谱图(图1)分析可知，该法合成的本发明所述小分子肽，纯度为99.29％。液相色谱-质谱图(图2)证明合成的该六肽为trp-val-leu-asp-lys-leu。
31.实施例2
32.dpph以乙醇配制(0.1mmol/l)。以去离子水将本发明小分子肽分别配制成为0.5～5mg/ml浓度溶液。取六肽溶液0.15ml加dpph 0.15ml，25℃避光静置1h，测定517nm处的吸光值(am)；取样品0.15ml加入无水乙醇0.15ml，25℃避光静置1h，其吸光值ax作为背景从am中扣除；以去离子水作为对照组，吸光值标记为an。按公式(1)计算dpph自由基清除率(sa)。
33.34.从图3可知，本发明所述六肽对dpph清除的ec
50
值为1.20mg/ml，具有良好的抗氧化活性。
35.实施例3
36.用0.2mol/l的pbs缓冲液(ph 6.6)配制所有样品。以pbs为空白对照，以gsh(0.02-0.16mg/ml)为阳性对照。分别将1.0ml不同质量浓度(0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml)的所述六肽加入1.0ml 1％浓度的k3[fe(cn)6]，于50℃水浴反应30min，用三氯乙酸(10％,2ml)终止反应。加入fecl3(0.1％,1.25ml)静置20min。反应液在700nm处的吸光值指示样品的还原力。
[0037]
由图4和图5可见，在测定范围内，还原力随样品浓度升高而增加，线性关系良好。当a
700
＝0.5时，多肽浓度为1.73mg/ml说明本发明所述六肽具有较强的还原力。
[0038]
实施例4
[0039]
培养人脐静脉内皮细胞系ea.hy 926细胞，细胞培养液由90％dmem培养液(nahco
3 1.5g/l，ph 7.0)、10％南美血源胎牛血清和1％青霉素/链霉素双抗配制。取细胞以1.0e5 cells/ml密度接入t25细胞培养瓶，置于37℃，5％co2培养箱内培养，每2天换一次培养液，每4天传代一次。取3～5代细胞，培养至对数期后，用胰酶消化，以1.0e5 cells/ml密度加入6孔板，每孔1ml，每组4个复孔。待培养至细胞长满孔底80％以上时，吸弃原培养液换以1ml含六肽(323μm或647μm)的无血清培养液培养对细胞预处理24h，吸弃细胞培养液。以抗氧化剂谷胱甘肽(gsh)(浓度为1.63μm)作为阳性对照。
[0040]
之后在各组中加入200μl h2o2(250μm)的无血清培养液诱导细胞产生氧化损伤，继续培养24h后取一组样品以mtt法测定细胞存活率。另一组样品测定细胞内mda和sod指标。
[0041]
mtt法具体操作为：于24h和48h时，每孔加入20μl mtt(5mg/ml)，培养4h，吸弃孔中液体，加入150μl dmso轻微震荡10min，用酶标仪测定570nm处吸光值。以无细胞培养液，加入等量mtt，4h后吸弃培养液，加入150μl dmso作为调零孔。细胞存活率按公式(2)计算。
[0042]
细胞存活率(％)＝实验组吸光值/对照组吸光值
ꢀꢀ
公式(2)
[0043]
mda和sod测定操作为：消化、离心保留沉淀，并用无菌pbs缓冲液(4℃)对细胞沉淀进行清洗，重复两次，利用液氮对细胞进行反复冻融以使细胞破碎。采用总蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所，产品号：a045-4-2)测定细胞内总蛋白，采用丙二醛(mda)试剂盒(南京建成生物工程研究所，产品号：a003-1-2)测定细胞内mda的含量，采用sod试剂盒南京建成生物工程研究所，产品号：a001-3-2)测定细胞内sod的活性。如图6所示，250μm的h2o2处理可以产生氧化损伤，显著抑制ea.hy 926细胞的增殖，损伤模型组的细胞存活率为47.80
±
4.62％。低、高剂量的六肽处理后细胞的存活率分别为53.65
±
4.57％和58.47
±
5.28％。与损伤模型组相比，本发明所述六肽可极显著提高细胞存活率，对细胞氧化损伤的保护作用极显著(p《0.01)。
[0044]
由图7可以发现，与对照组相比，h2o2处理的氧化损伤模型细胞内mda含量由3.09
±
0.65μm/mgprot(毫克蛋白质)升高至11.09
±
1.38μm/mgprot。本发明所述六肽低剂量和高剂量处理后细胞内mda测定值分别为10.09
±
1.03μm/mgprot和8.18
±
0.51μm/mgprot(p《0.01)，表示本发明所述六肽能极显著减少细胞内mda的生成。mda是细胞内氧化应激标志物，其含量的降低表示本发明所述六肽能保护内皮细胞抵抗由h2o2诱导的氧化损伤。
[0045]
由图8可以发现，与对照组相比，h2o2处理的氧化损伤模型细胞内sod活性急剧下
降，由44.08
±
1.97u/mgprot降至23.62
±
2.23u/mgprot(p《0.01)。本发明所述六肽在低、高浓度处理后，细胞内sod活性分别提升至26.87
±
2.62u/mgprot和28.85
±
3.01u/mgprot(p《0.01)。本发明所述六肽能极显著提升血管内皮细胞内抗氧化酶sod的活性。
[0046]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。