一种制备囊泡的方法及其应用

本发明属于生物医药领域，涉及一种囊泡的制备方法及其应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。细胞外囊泡是细胞间通讯的重要媒介，使得细胞内地生物活性分子从一个细胞转移到另一个细胞从而发挥功能。因此，越来越清楚的是，这些囊泡参与许多生理过程，这将为疾病的治疗提供了应用的机会。

2、目前该领域的研究主要集中在外泌体(exosomes)方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，其内含有rna、脂质和蛋白质等成分。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。迄今为止，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。众多的研究发现mscs来源的外泌体能模拟mscs的生物学功能，在促进细胞生长和分化，修复组织缺损等方面发挥了重要的调控作用。因此，近年来以mscs来源的外泌体为基础的细胞囊泡疗法取得了显著的发展。然而，目前以外泌体为基础的细胞囊泡治疗仍然存在诸多问题，主要表现在外泌体的提取和纯化过程复杂，耗时长，对设备和试剂的要求较高，生理性外泌体产量较低等等，这些缺陷都限制了外泌体治疗的临床转化和应用。

3、急性呼吸窘迫综合征(ards)自首次被描述以来，一直受到人们的关注，被认为是呼吸医学的主要临床问题，具有较高的发病率和死亡率。ards是由于肺内或/和肺外各种原因引起的、以肺损伤为主要表现的临床综合征，临床表现的显著特征是进行性呼吸困难和顽固性低氧血症。引起ards的肺内原因有重症肺炎、溺水误吸、肺挫伤、有毒物质吸入等，肺外原因有严重感染、严重外伤、休克、重症胰腺炎、中毒、大手术、心肺复苏后等，它们共同的病理基础是急性肺损伤。除了众所周知的ards的危险因素外，暴露于高臭氧水平和低维生素d血浆浓度也被发现是易感环境。ards治疗费用昂贵,然而目前除保护性肺通气、治疗原发病及支持治疗方法外，仍缺乏针对性治疗手段。基于最新研究，尽管ards总体生存率正在提高，但考虑到几项观察研究的住院死亡率，这可以解释为危险因素、诊断的可用性、识别ards的能力以及影响临床诊断的一些选择偏差试验，这些数据表明ards在世界范围内仍处于诊断不足和治疗不足的状态，目前对ards的定义在大多数临床情况下是不充分的。基于药物的预防战略仍然是一个重大挑战，一些最近的研究致力于改善这种疾病急性呼吸窘迫综合征的预后，但高死亡率和高致残并发症仍然有待改善。

4、结肠炎又称非特异性溃疡性结肠炎，其种类繁多，引发原因多样，并且起病多缓慢，病情轻重不一，主要临床表现腹泻、腹痛、粘液便及脓血便、里急后重、甚则大便秘结、数日内不能通大便，时而腹泻时而便秘，常伴有消瘦乏力等，多反复发作。腹痛一般多为隐痛或绞痛，常位于左下腹或小腹。其它表现有食欲不振、腹胀、恶心、呕吐及肝大等，左下腹可有压痛，有时能触及痉挛的结肠。常见的全身症状有消瘦、乏力、发热、贫血等。有少部分病人在慢性的病程中，病情突然恶化或初次发病就呈暴发性，表现严重腹泻，给人或动物带来极大的痛苦。

技术实现思路

1、一些实施方案中，本发明提供了一种制备囊泡的方法，所述方法包括通过外力诱导来源于人血液的样品凋亡而产生所述囊泡，所述外力包括添加双氧水。

2、一些实施方案中，所述血液为含有血细胞的血液样品。

3、一些实施方案中，所述样品包含人源外周血单个核细胞。

4、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmcs)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，是一个有用的细胞来源，因其收集容易，为临床应用提供了方便。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。

5、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为20～2000μm。

6、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为50～1500μm。

7、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为50～1200μm。

8、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为50～1000μm。

9、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为100～1200μm。

10、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为100～1000μm。

11、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为100～800μm。

12、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为100～500μm。

13、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为100～400μm。

14、一些实施方案中，所述双氧水的浓度为100～300μm。

15、一些实施方案中，所述双氧水的处理时间为4～30h。

16、一些实施方案中，所述双氧水的处理时间为5～25h。

17、一些实施方案中，所述双氧水的处理时间为8～25h。

18、一些实施方案中，所述双氧水的处理时间为10～25h。

19、一些实施方案中，所述双氧水的处理时间为12～25h。

20、一些实施方案中，所述双氧水的处理时间为12～20h。

21、一些实施方案中，所述囊泡为诱导性囊泡。

22、一些实施方案中，本发明提供的这种以外周血为样品，采用双氧水处理的方法获得的所述囊泡由于诱导后所述的双氧水可以分解变成水和氧气，因此，无需担心试剂残留的问题。具有采样方便，来自自体，在体外获得诱导性囊泡之后可以直接再用回原个体的体内，因而具有极好的可操作性和安全性。

23、一些实施方案中，所述囊泡对annexinv,integrin alpha 5和syntaxin 4表达呈阳性。

24、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-6μm。

25、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-4.5μm。

26、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-1μm。

27、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.04-1μm。

28、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05-1μm。

29、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.1-1μm。

30、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.15-1μm。

31、一些实施方案中，所述方法还包括对所述的囊泡进行提取。

32、一些实施方案中，所述的方法包括以下步骤：(1)获得外周血单核细胞，进行培养；(2)在培养基中，对所述的外周血单核细胞进行热处理，诱导所述囊泡的释放；(3)收集步骤(2)的培养基上清，分离出所述囊泡。

33、一些实施方案中，通过选自由聚合物沉淀、免疫分离、磁免疫捕获、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤、超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤和它们的组合所组成的组中的方法从培养基中分离所述囊泡。

34、一些实施方案中，所述分离囊泡的方法包括以annexin v、integrin alpha 5和syntexin 4 为标志物进行分离。

35、一些实施方案中，通过选用超速离心的方法分离所述囊泡。

36、在一些实施方案中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。

37、在一些实施方案中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟；或者所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟；或者所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟；或者第一次离心为800g离心5-10min。在一些实施方案中，所述第二次离心为1000-3000g离心5- 30分钟；或者所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟；或者所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟；或者所述第二次离心为2000g离心5-10分钟。在一些实施方案中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟；或者所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟；或者所述第三次离心为16000-16500g离心30-35分钟。在一些实施方案中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟，或者所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟；或者所述第四次离心为16000-16500g离心30-35分钟。

38、一些实施方案中，所述乙醇的浓度为50～500nm。

39、一些实施方案中，所述乙醇的浓度为100～500nm。

40、一些实施方案中，所述乙醇的浓度为100～300nm。

41、一些实施方案中，所述乙醇的处理时间为4～30h。

42、一些实施方案中，所述乙醇的处理时间为8～25h。

43、一些实施方案中，所述乙醇的处理时间为12～20h。

44、一些实施方案中，所述紫外照射为紫外交联仪200～500mj/cm2处理1～8h。

45、一些实施方案中，所述紫外照射为紫外交联仪200～400mj/cm2处理2～6h。

46、一些实施方案中，所述紫外照射为紫外交联仪200～350mj/cm2处理2～5h。

47、一些实施方案中，本发明提供了一种所述的方法获得的囊泡。

48、一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，包括所述的囊泡以及药学上可接受的辅料；

49、一些实施方案中，所述药物组合物的制剂形式选自冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、或贴剂。

50、一些实施方案中，本发明提供了所述的囊泡在制备治疗或预防或改善疾病或所述疾病并发症的产品中的应用。

51、一些实施方案中，所述产品包括药品、食品、保健品、化妆品、添加剂或中间品。

52、一些实施方案中，所述疾病包括肺部疾病或肠道疾病。

53、一些实施方案中，所述肺部疾病为急性呼吸窘迫综合症。

54、一些实施方案中，所述肠道疾病为肠炎。