黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因及其应用

黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因及其应用
技术领域
1.本发明属于内参基因领域，具体涉及一种黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因及其应用。


背景技术：

2.黑药仲彬草(k.melanthera)属禾本科(poaeeae)小麦族(triticeae)仲彬草属(kengyilia) 多年生异源六倍体自花授粉植物，主要分布于海拔3300-4750m的青藏高原干旱和半干旱的山坡、河谷、草原和草甸，对寒冷、干旱和盐碱等不良环境具有高度的适应性，可用于高原荒漠化防治和生态恢复，其具有较高的饲用价值，也可作为高原牧草。此外，研究发现黑药仲彬草对小麦赤霉病具有很强的抗性。这些优良特性，大都是麦类作物和牧草遗传改良中需要改进的性状，通过远缘杂交、染色体工程、基因工程等现代遗传和生物技术的方法将这些优良性状的基因转移到麦类作物和牧草的遗传背景中是完全可能的。因此，作为麦类作物和牧草育种的重要基因资源，黑药仲彬草具有重要意义。
3.实时荧光定量pcr(qrt-pcr)具有灵敏度高、特异性强、重复的动态定量范围和高通量等优点，是植物科学领域中研究基因表达水平的常用技术之一。然而，在其分析过程中rna 的质量和产量、反转录效率的差异以及其它阻碍因素等都会对目的基因表达分析结果的准确性产生影响。因此需要选择合适的内参基因进行校正，从而减小检测样本之间的差异。理想的内参基因应该在各种条件下具有稳定的表达水平，例如不同组织、不同发育阶段以及各种生物和非生物胁迫。在植物qrt-pcr分析中，常见的内参基因包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (gapdh)、延伸因子-1a(ef-1α)、泛素(ubq)、肌动蛋白(actin)、α-微管蛋白(tua)、β-微管蛋白(tub)、18s rrna和亲环素(cyp)。而近年来的研究发现，这些常用内参基因在不同的环境条件、不同的发育阶段和组织器官中表达并不是恒定不变的。同时，不同植物有最合适的内参基因，而同一种植物不同组织之间内参基因的稳定性也存在差异，只能在一定的试验范围内相对稳定。当选择不适当的内参基因进行数据标准化时，往往会得到不正确的分析结果。因此，在特定实验条件下为特定物种选择表达稳定的内参基因对于目的基因表达水平分析至关重要。
4.然而，目前国内外尚无黑药仲彬草内参基因的报道，严重制约了其优异抗性基因的挖掘与利用。本发明基于全长转录组数据开发在不同非生物胁迫(干旱、高温和低温)处理下黑药仲彬草最稳定内参基因，并通过胁迫相关基因过氧化氢酶(cat)进行了验证。旨在找到黑药仲彬草开展实时荧光定量pcr研究最稳定，最合适的内参基因，为今后探索和利用黑药仲彬草抗性基因奠定基础。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理下均能够稳定表达的黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该黑药仲彬草实时荧光定量pcr内
95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号， ct值数据由cfx96
tm real time system荧光定量pcr仪自动读取；
21.5)、将获得的ct值用2
‑△△
ct
法计算相对表达量,具体步骤如下：
22.△
ct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)
23.△△
ct＝
△
ct(处理)
‑△
ct(对照)
[0024]2‑△△
ct
＝相对表达量。
[0025]
本发明的有益效果在于：本发明所述黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因以全长转录组数据为基础,筛选出最优内参基因,比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好,稳定性高等优点,同时通过对内参基因在黑药仲彬草高温、低温和干旱胁迫不同处理条件的表达分析研究,较好地验证了本发明所述的内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，而现有的内参基因均无法实现在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，因此，本发明所属的内参基因比现有的通用内参基因具有更好的校正能力，填补了黑药仲彬草研究领域中缺少合适的、通用的荧光定量pcr内参基因的空白,为今后黑药仲彬草以及其他小麦族植物基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。
附图说明
[0026]
图1为实施例1中14个内参基因以黑药仲彬草cdna为模板扩得到的序列电泳图；
[0027]
图2为实施例1中所有样品14个内参基因的ct值；
[0028]
图3为实施例1中14个内参基因的溶解曲线；
[0029]
图4为实施例1中利用genorm软件计算得到的14个内参基因的表达稳定性值m排序图；
[0030]
图5为应用transcript-28482、tcip、tua对低温处理条件下黑药仲彬草目标cat基因表达量变化进行分析图；
[0031]
图6为应用transcript-28482、f-box、tub对高温处理条件下黑药仲彬草目标cat基因表达量变化进行分析图；
[0032]
图7为应用transcript-28482、f-box、abc对干旱处理条件下黑药仲彬草目标cat基因表达量变化进行分析图。
具体实施方式
[0033]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0034]
该黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因内参基因为transcript-28482；所述 transcript-28482内参基因的cdna序列如序列如下所示：
[0035]
gattctggaaaacacacacgaaaaagcgctcctggacggggaagacgacttggtgctcgtgcctcc cctgccccgagatctaccaaaacccgcgcccccgtcaatcccgttcctcctcctcaccgtccggcga gccccgagcacaccagatcgcccgctacgacctgtagctggcggcgcaccgtgcaaacgcgagcca gttaagggtggtggtggtcccaggcgctcgagcggggcgcgggcgacgcggagacgatgccggtgg cggcgtcggccatctacttcctcaacctccgcggggacgtcctcatcaaccgcctataccgcgacga tgtcgggggaaatatggttgatgcattcaggatgcacattatgcaaacaaaagaacttggtacatg ccctgttcgacaaataggaggctgttccttcctttacatgagga
tcagtaatgtttacattgtgatcg ttgttagcagcaatgctaatgtttcttgtgctttcaagtttgttgtggaggcagtggccctcttcaag tcctactttggtggaacttttgatgaagatgctatcaggaataactttgtgttaatatacgaacttct tgatgagattatggacttcggttatcctcagaatctttcacctgaaattttgaagttatatataaccc aggaaggcgtacggtcgccattttcctccaagccttcggataagcctgttccaaatgcgaccctgca agttaccggcgctgttggttggagaagagagggtcttgtgtacaagaagaatgaggttttcttggac attgttgagagtgtaaaccttcttatgtcttctaaagggagtgttctacgatgtgacgtgacgggaa agattcttatgaagtgtttcctttctggaatgcctgatctgaagttgggactaaatgacaagattgg acttgaaaaggaagcccaactgaagtccaggccttcaaagagtgggaagaccatagaactcgatga tgtcacgttccaccagtgcgtcaacctaacaagatttaactcagaaaaaacagtcagctttgtgcca ccagatggtgaattcgaattgatgaaatatcgaatcacggagggcgtaaatcttcctttccgggttc tgcccacaattaaggagttgggccgaacacgcatggagattaacgtgaaagttaagagtgtttttg gtgctaagatgtttgcacttggtgttgtggtcaaagttccagttccaaagcagacagcaaagacgag tttccaaacaacatctggcaaagccaaatataatgcttcgattgattccctggtgtggaagatcagg aaattccctggacagaccgaggcaacgatgagtgcagaagttgaactgatctctacaatgggggaa aagaagttagcgaacaggccaccgattcagatggaattccaggttccgatgttcacctgcttctggt ttacgtgttcggttcctcaaggtgtgggagaagagtggctacaacaccgttgagtgggttcgctaca tcacaagggctggatcatacgaaatcaggtgttagtgaccaagaaaaatggcgtgggctccttattt cgtggattcgtggagctctttttgtacgcagcatgattgatcggaagcacgtaaattatgacccagt tctctgtgagtttgtactagcagagggcagatcagagcaggcagttttccgatgttccttattttcat gttgacatgggatatgtattctccccccatgtcctgtttgtgtcatagggcatatttttattgtatatt tgacagtagcattcgttatcgttgaccaatacaccccttgccggctcgtgctgttttctcgttgaacg ggtgtcaaatctcttgcaaaacggtgtataaatatatgatgataatgttgttggcttgctgtggctgt gtttgacgtaagtccatcgttgag
[0036]
本发明所述黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因以全长转录组数据为基础,筛选出最优内参基因,比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好,稳定性高等优点,同时通过对内参基因在黑药仲彬草高温、低温和干旱胁迫不同处理条件的表达分析研究,较好地验证了本发明所述的最优内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，而现有的内参基因均无法实现在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，因此，本发明所属的内参基因比现有的通用内参基因具有更好的校正能力，填补了黑药仲彬草研究领域中缺少合适的、通用的荧光定量pcr内参基因的空白,为今后黑药仲彬草以及其他小麦族植物基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。
[0037]
本发明还发现了黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理后基因表达分析中的应用。
[0038]
本发明还提供了利用所述黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理后基因表达分析方法，包括如下步骤：
[0039]
1)材料培养与处理：选取黑药仲彬草种子，经1％次氯酸钠消毒，无菌蒸馏水冲洗5遍后，将种子播于20
×
15
×
5cm塑料盆中，每盆1.5g，用石英砂覆盖，浇注1/2倍的霍格兰营养液，在昼夜温度分别为23℃和19℃、光周期12h、相对湿度75％、光照强度250umol
·
m-2
·
s-1
的生长室中培养21天后，将黑药仲彬草植株分成三个处理组，将三个处理组的植株分别置于 4℃的培养箱中进行冷胁迫、置于白天38/晚上33℃的培养箱中进行高温处理以及用
20％浓度的peg-6000进行干旱胁迫，分别在每个处理开始后0小时、12小时、24小时、48小时和 96小时采集叶片样品，采集的样品立即在液氮中冷冻，并储存于-80℃的冰箱用于rna的提取；
[0040]
2)、黑药仲彬草总rna的提取：采用rna提取试剂盒(tiangen biotech,beijing,china) 提取总rna，1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性,并使用nanodrop(eppendorf,germany) 对提取的rna进行纯度检测以及浓度的定量；
[0041]
3)、cdna的合成：合格样品采用evo m-mlv rt mix试剂盒(accurate biotech,hunan, china)合成cdna，储存于-20℃备用；cdna的合成的具体步骤如下：
[0042]
首先，在pcr管中配制反应液总量为20ul，反应过程如下：先在37℃下反应15min后，再85℃反应5s，之后保持在4℃；所述反转录反应液体系如表3所示:
[0043]
表3反转录反应液体系
[0044][0045]
4)、目标基因和内参基因的qrt-pcr反应：
[0046]
使用2
×
sybr green pro taq hs premix(accurate biotech,hunan,china)进行qrt-pcr，将内参基因和目标基因点在同一块pcr板上，反应在cfx96tm real time system荧光定量仪上进行，所述pcr反应体系如表4所示：
[0047]
表4 pcr反应体系
[0048][0049]
扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环，然后进行65～ 95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号， ct值数据由cfx96
tm real time system荧光定量pcr仪自动读取；
[0050]
5)、将获得的ct值用2
‑△△
ct法计算相对表达量,具体步骤如下：
[0051]
△
ct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)
[0052]
△△
ct＝
△
ct(处理)
‑△
ct(对照)
[0053]2‑△△
ct
＝相对表达量。
[0054]
实施例1
[0055]
本实施例为本发明所述的黑药仲彬草实时荧光定量pcr内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理后表达稳定性分析中与13个传统内参基因的比较应用，为对比开发新内参基因的效果，选择以下13个常用的传统内参基因ef-1α(elongation factor 1-alpha)，gapdh (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2)，actin(actin-1)，ubi
95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号， ct值数据由cfx96
tm
real time system荧光定量pcr仪自动读取；图1为14个内参基因扩增电泳图,其中m为dl2000dna marker,1为ef-1α,2为gapdh,3为actin,4为ubi,5为tub,6 为tip41，7为transcript-28482,8为pp2a,9为tua,10为eif4a,11为cyp,12为tct，13 为abc，14为f-box；图2为所有样品14个内参基因的ct值,每个箱的中线表示各个内参的 ct中值,箱的两端表示25％-75％的数据所在范围,上下边缘表示最大值和最小值；图3为14个内参基因的溶解曲线；反应所用内参基因引物见表7:
[0067]
表7 qrt-pcr内参基因引物序列
[0068][0069][0070]
5)、将获得的ct值用2
‑△△
ct法计算相对表达量,具体步骤如下：
[0071]
△
ct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)
[0072]
△△
ct＝
△
ct(处理)
‑△
ct(对照)
[0073]2‑△△
ct
＝相对表达量。
[0074]
根据14个内参基因数据，利用genorm软件计算得到的14个内参基因的表达稳定性值m 排序图，如图4所示，图4a为低温处理条件；图4b为高温处理条件，图4c为干旱处理条件，图4d为所有胁迫处理综合分析；利用genorm(v3.5),bestkeeper(v1.0)和normfinder
(v0.953)3 种软件程序对候选内参基因的表达量稳定性进行分析，最后利用 reffinder(http://www.leonxie.com/referencegene.php)对内参基因进行综合排序，如表8所示:
[0075]
表8内参基因综合分析后排序情况
[0076][0077]
由图1、图2、图3、图4和表8可以看出,最后综合排序中,排名最前的内参基因是 transcript-28482。结果表明新开发的内参基因transcript-28482比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好,稳定性高等优点,同时通过对内参基因在黑药仲彬草高温、低温和干旱胁迫不同处理条件的表达分析研究,较好地验证了本发明所述的最优内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，而现有的内参基因均无法实现在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，因此，本发明所属的内参基因比现有的通用内参基因具有更好的校正能力，填补了黑药仲彬草研究领域中缺少合适的、通用的荧光定量pcr内参基因的空白,为今后黑药仲彬草以及其他小麦族植物基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。
[0078]
实施例2
[0079]
本实施例为验证内参基因应用的效果，选用过氧化氢酶(cat)基因作为目标基因，cat 是植物体内常见的抗氧化酶，可以帮助植物清除体内的活性氧，保护细胞免受氧化损伤，通常在受到胁迫后其表达量会有所增加。因此，本实施例分别选取本发明提供的内参基因 transcript-28482和其他物种通用型内参基因(见表11)，利用qrt-pcr方法对黑药仲彬草cat 基因在干旱、高温和低温处理下的表达量进行验证、比较应用效果。具体步骤如下:
[0080]
1)、材料培养与处理：选取黑药仲彬草种子，经1％次氯酸钠消毒，无菌蒸馏水冲洗5 遍后，将种子播于20
×
15
×
5cm塑料盆中，每盆1.5g，用石英砂覆盖，浇注1/2倍的霍格兰营养液，在昼夜温度分别为23℃和19℃、光周期12h、相对湿度75％、光照强度250umol
·
m-2
·
s-1
的生长室中培养21天后，将黑药仲彬草植株分成三个处理组，将三个处理组的植株分别置于 4℃的培养箱中进行冷胁迫、置于白天38/晚上33℃的培养箱中进行高温处理以及用20％浓度的peg-6000进行干旱胁迫，分别在每个处理开始后0小时、12小时、24小时、48小时和 96小时采集叶片样品，采集的样品立即在液氮中冷冻，并储存于-80℃的冰箱于rna的提取；
[0081]
2)、黑药仲彬草总rna的提取：采用rna提取试剂盒(tiangen biotech,beijing,china) 提取总rna，1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性,并使用nanodrop(eppendorf,
germany) 对提取的rna进行纯度检测以及浓度的定量；
[0082]
3)、cdna的合成：合格样品采用evo m-mlv rt mix试剂盒(accurate biotech,hunan, china)合成cdna，储存于-20℃备用；cdna的合成的具体步骤如下：
[0083]
首先，在pcr管中配制反应液总量为20ul，反应过程如下：先在37℃下反应15min后，再85℃反应5s，之后保持在4℃；所述反转录反应液体系如表9所示:
[0084]
表9反转录反应液体系
[0085][0086]
4)、目标基因和内参基因的qrt-pcr反应：
[0087]
使用2
×
sybr green pro taq hs premix(accurate biotech,hunan,china)进行qrt-pcr，将内参基因和目标基因点在同一块pcr板上，反应在cfx96tm real time system荧光定量仪上进行，所述pcr反应体系如表10所示：
[0088]
表10pcr反应体系
[0089][0090]
扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环，然后进行65～ 95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号， ct值数据由cfx96
tm
real time system荧光定量pcr仪自动读取；qrt-pcr内参基因和cat 基因引物序列见表11:
[0091]
表11 qrt-pcr内参基因和cat基因引物序列
[0092]
[0093]
5)、将获得的ct值用2
‑△△
ct法计算相对表达量,具体步骤如下：
[0094]
△
ct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)
[0095]
△△
ct＝
△
ct(处理)
‑△
ct(对照)
[0096]2‑△△
ct
＝相对表达量。
[0097]
选取不同内参基因进行qrt-pcr验证本发明提供的内参基因应用的效果:图5为应用 transcript-28482、tcip、tua对低温处理条件下黑药仲彬草目标cat基因表达量变化进行分析图；图6为应用transcript-28482、f-box、tub对高温处理条件下黑药仲彬草目标cat 基因表达量变化进行分析图；图7为应用transcript-28482、f-box、abc对干旱处理条件下黑药仲彬草目标cat基因表达量变化进行分析图；
[0098]
由图5可知,在低温处理条件下，其中transcript-28482稳定性最好，tcip为稳定性较好的内参基因,而tua稳定性较差；qrt-pcr结果可见,使用相对不稳定的tua基因,在低温处理24h，48h和96h时cat的表达量变化差异较大,出现了与使用其它内参基因相反的趋势, 而使用稳定性好的cyp2和act,趋势是一致且重复性好。
[0099]
由图6可知,在高温处理条件下,其中transcript-28482稳定性最好，f-box为相对稳定性好的内参基因,而tub稳定性较差；qrt-pcr结果可见,使用不稳定的tub基因,在高温处理后cat的表达量变化不一致,在12h出现了相反的趋势,而使用稳定性好的transcript-28482 和f-box,cat表达趋势是一致的,结果更可靠。
[0100]
由图7可知,在干旱处理条件下,其中transcript-28482稳定性最好，f-box为评估相对稳定性较好的内参基因,abc相对稳定性较差；而qrt-pcr结果可见,使用不稳定的abc基因, 在干旱处理后cat的表达量变化不一致,在12h,24h和48h出现了相反的趋势,而使用稳定性较好的transcript-28482和f-box,cat表达趋势是一致的,结果更可靠。
[0101]
由图5-7可知，本发明开发的内参基因transcript-28482与常用内参相比对低温胁迫、高温胁迫、干旱胁迫目标基因表达分析均有较好的效果,清楚表现出目标基因cat在不同胁迫处理12h，24h，48h和96h后基因的表达变化情况；单独使用时使试验操作简便、减少成本。
[0102]
综上所述,本发明所述的内参基因序列来自黑药仲彬草全长转录组序列，比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好，稳定性高等优点，同时通过对过氧化氢酶(cat)基因在黑药仲彬草不同处理下的表达分析研究中，较好地验证了本发明开发的稳定内参基因具有更好地校正能力，为今后黑药仲彬草及其它小麦族植物抗性基因表达分析、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。