一种烟草渗调蛋白相关基因的应用及方法与流程

1.本发明涉及一种烟草渗调蛋白相关基因的应用及方法，属于植物基因工程技术领域。


背景技术：

2.植物渗调蛋白是植物在逆境下会产生许多逆境响应蛋白中重要的一种。渗调蛋白是一种基本的24 kda的病机相关(pr)蛋白，在nacl和干旱适应的烟草细胞中积累。渗调蛋白基因可被nacl、干旱、乙烯、受伤、脱落酸、烟草花叶病毒、真菌和紫外线等多种因素激活。然而，在非超敏反应基因型中，该蛋白主要在渗透胁迫下积累。渗调蛋白是一种逆境适应蛋白，不是胁迫蛋白；细胞的渗调蛋白定位于液泡，这是离子分室性积累的场所。植物的渗调蛋白积累在根, 是最先涉及离子吸收和运输的器官。所以，渗调蛋白可能与植物适应渗透胁迫有密切的关系。许多渗调蛋白集中在液泡中，液泡中含有较高水平的渗调蛋白。因此，渗调蛋白可能是一种盐适应过程中形成的脱水储藏蛋白。
3.渗调蛋白是一种阳离子蛋白，多数以颗粒状存在。可能在渗透胁迫下，本身吸附水分或改变膜对水的透性，减少细胞失水，维持细胞膨压；螯合细胞脱水过程中浓缩的离子，减少离子毒害的作用。还可能通过与液泡膜上离子通道的静电相互作用，减少或增加液泡膜对某些离子的吸入，改变该离子在细胞质和液泡的浓度，来传递胁迫信号，诱导胁迫相关基因的表达，从而增加了植物对胁迫的适应性。
4.研究烟草渗调蛋白基因响应的分子机制具有重要意义。在烟草渗透蛋白基因克隆与功能研究方面，有研究表明盐适应烟草细胞内渗调蛋白的氨基酸组成中，含有高比例的半胱氨酸和脯氨酸而组氨酸和蛋氨酸较低，这可能与其功能相关。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种烟草渗调蛋白相关基因的应用；为研究烟草基因功能解析提供遗传材料和理论依据。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种烟草渗调蛋白相关基因在种子萌发苗期在抗盐胁迫、干旱胁迫方面的应用。
7.本发明上述技术方案中，所述的烟草渗调蛋白相关基因，核苷酸序列如seq id no.1所示，包括744bp个碱基，该基因来源于烟草（nicotiana tabacum，命名为渗调蛋白（osmotin）。
8.seq id no.1：tgggcaacttgagatcttcttttgttttcttcctccttgccttggtgacttatacttatgctgccactatcgaggtccgaaacaactgtccgtacaccgtttgggcggcgtcgacacccataggcggtggccggcgtctcgatcgaggccaaacttgggtgatcaatgcgccacgaggtactaaaatggcacgtgtatggggccgtactaattgtaacttcaatgctgctggtaggggtacgtgccaaaccggtgactgtggtggagtcctacagtgcaccgggtggggtaaaccaccaaacaccttggctgaatacgctttggaccaattcagtggtttagatttctgggacatttctttagttgatggat
tcaacattccgatgactttcgccccgactaaccctagtggagggaaatgccatgcaattcattgtacggctaatataaacggcgaatgtccccgcgaacttagggttcccggaggatgtaataacccttgtactacattcggaggacaacaatattgttgcacacaaggaccttgtggtcctacatttttctcaaaatttttcaaacaaagatgccctgatgcctatagctacccacaagatgatcctactagcacttttacttgccctggtggtagtacaaattatagggttatcttttgtcctaatggtcaagctcacccaaattttcccttggaaatgcctggaagtgatgaagtggctaagtag。
9.本发明的第二个目的是，提供上述烟草渗调蛋白相关基因在降低植株中脯氨酸含量方面的应用。
10.本发明的第三个目的是，提供上述烟草渗调蛋白相关基因在提高植株中叶绿素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量方面的应用。
11.本发明的第四个目的是，提供上述烟草渗调蛋白相关基因在种子萌发苗期抗盐胁迫、干旱胁迫的方法。
12.为实现上述第四个目的，本发明采用的技术方案如下：一种烟草渗调蛋白相关基因在种子萌发苗期抗盐胁迫、干旱胁迫的方法，通过crispr/cas9介导的基因编辑，构建含烟草渗调蛋白相关基因的编辑载体，经遗传转化后获得在种子萌发苗期在抗盐胁迫、干旱胁迫方面提高的烟草植株。
13.本发明的第五个目的是，提供上述烟草渗调蛋白相关基因在降低植株中脯氨酸含量的方法。
14.为实现上述第五个目的，本发明采用的技术方案如下：一种烟草渗调蛋白相关基因在降低植株中脯氨酸含量的方法，通过crispr/cas9介导的基因编辑，构建含烟草渗调蛋白相关基因的编辑载体，经遗传转化后获得植株中脯氨酸含量降低的烟草植株。
15.本发明的最后一个目的是，提供上述烟草渗调蛋白相关基因在提高植株中叶绿素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量的方法。
16.为实现上述最后一个目的，本发明采用的技术方案如下：一种烟草渗调蛋白相关基因在提高植株中叶绿素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量的方法，通过crispr/cas9介导的基因编辑，构建含烟草渗调蛋白相关基因的编辑载体，经遗传转化后获得植株中叶绿素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量提高的烟草植株。
17.本发明上述技术方案中，烟草渗调蛋白相关基因的编码蛋白，氨基酸序列如seq id no.2所示，包括247个氨基酸。
18.seq id no.2：mgnlrssfvffllalvtytyaatievrnncpytvwaastpigggrrldrgqtwvinaprgtkmarvwgrtncnfnaagrgtcqtgdcggvlqctgwgkppntlaeyaldqfsgldfwdislvdgfnipmtfaptnpsggkchaihctaningecprelrvpggcnnpcttfggqqycctqgpcgptffskffkqrcpdaysypqddptstftcpggstnyrvifcpngqahpnfplempgsdevak。
19.本发明上述技术方案中，将目的基因编辑提取后，设计sgrna引物并构建质粒，又转化到红花大金元中，得到基因编辑的植株。该基因编辑的植株在种子萌发苗期对于盐胁迫、干旱胁迫具有一定抗性。在苗期干旱胁迫、盐胁迫条件下，进行光合指标测定，发现渗调蛋白基因编辑植株的脯氨酸含量均低于对照植株，以及在成熟期新鲜烟叶中脯氨酸含量明显低于对照植株。同时通过实时荧光定量pcr发现，在正常条件下，成熟期新鲜烟叶中所获
基因编辑植株的基因表达量与对照（未转化）植株相比降低；表明渗调蛋白基因敲除影响脯氨酸含量变化。这为渗调蛋白基因功能的研究将为烟草遗传改良提供遗传材料和理论依据。
20.综上所述，本发明具有以下有益效果：1、本发明通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除渗调蛋白基因的crispr/cas9编辑载体，经遗传转化后获得了渗调蛋白基因发生编辑的红花大金元植株。本发明通过在种子萌发苗期进行干旱胁迫、盐胁迫处理，发现基因编辑植株在胁迫处理下，生长均优于对照（未转化）植株；在苗期进行干旱胁迫、盐胁迫处理后进行光合指标测定，编辑素材中脯氨酸含量低于对照植株；正常条件下，对成熟期新鲜烟叶进行脯氨酸含量进行检测，发现编辑植株中脯氨酸含量低于对照植株，同时进行荧光定量pcr检测，发现渗透蛋白基因表达量低于对照；2、本发明利用crispr/cas9介导的基因编辑技术敲除渗透蛋白基因获得在影响脯氨酸含量及抗逆方面具有重要作用，这为烟草渗透蛋白影响脯氨酸含量变化及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。
附图说明
21.图1为对照（未转化）植株和基因编辑植株萌发期在蒸馏水、5%peg-6000与100mmol/lnacl处理条件下（正常条件、干旱胁迫、盐胁迫）的10天表型对比图；图2为对照（未转化）植株和基因编辑植株在苗期5%peg-6000的干旱胁迫下，处理15天后，进行相关生理生化指标（包括叶绿素，4个光合指标，生物量，脯氨酸，可溶性糖和总蛋白）的测定；图3为对照（未转化）植株和基因编辑植株在苗期200mmol/l nacl的盐胁迫下，处理15天后，进行相关生理生化指标（包括叶绿素，4个光合指标，生物量，脯氨酸，可溶性糖和总蛋白）的测定；图4为对照（未转化）植株和基因编辑植株在成熟期正常条件下，进行植株叶片7种游离氨基酸测定；图5为对照（未转化）植株和基因编辑植株在成熟期正常条件下，进行渗透蛋白基因表达量检测。
具体实施方式
22.下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
23.本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
24.本发明除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。
25.烟草品种：红花大金元，一种商品化烟草品种；实施例1本实施例主要就烟草渗调蛋白相关的基因的获得过程，简要介绍如下。
26.以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用rna提取试剂盒提取烟草叶片总rna，反转录为cdna备用：按照植物rna提取试剂盒说明书提取烟草总rna。
27.1μg从叶片中提取总rna用于反转录，转录体系如下：total rna
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1μgoligo(dt) (10μm)
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1.5μlddh2o
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up to 15μl将上述体系混匀后置于pcr中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：m-mlv buffer（5x）
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5μlm-mlv逆转录酶
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0.5μlrnase 抑制剂
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0.5μldntp mixture
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4μlddh2o
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up to 25μl上述体系放入pcr仪中，42℃ 65min，65℃ 10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。
28.通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：f：5
’‑
atgggcaacttgagatcttc-3’，（seq id no.3）r：5
’‑
ctacttagccacttcatcac-3’；（seq id no.4）以上述所制备cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增：扩增体系（50μl）：cdna
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0.5μl5
×
reaction buffer
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10μl上游引物（10mmol/l）
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2.5μl下游引物（10mmol/l）
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2.5μldntp (10 mm)
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5μlphusion dna polymerase
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0.5μlddh2o
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up to 50μl混匀离心后进行pcr 扩增，pcr反应条件为：95℃ 10sec，52℃ 30sec，72℃ 2.5min，共30个循环；72℃ 10min；12℃ hold。
29.对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草渗调蛋白相关的基因序列，其碱基序列如seq id no.1所示，共包括744bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如seq id no.2所示，共包括247个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。
30.实施例2利用实施例1中所获得烟草过渗调蛋白相关的基因，本发明进一步构建了crispr/cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。
31.选择渗调蛋白基因中较特异的20nt核苷酸序列为crispr/cas9（seq id no.5）的
引导序列，并将该序列片段与crispr/cas9载体（由西南大学提供）进行连接，获得转化的克隆子，进行pcr扩增检测，后将pcr阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到crispr/cas9-ntpod7编辑载体。
32.利用上一步所构建的crispr/cas9-ntpod7编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化试验，以敲除植物体内的烟草渗调蛋白相关的基因，相关实验过程简要介绍如下。
33.无菌苗获得：将烟草种子点种于培养皿中，待长到4片子叶（15-20d），便可将其移入培养瓶中（含80ml ms液体培养基），每瓶2株，于25
±
1℃、光照强度30-50μmol/(m2·
s)，光照时间为16h/d条件继续培养40d，备用。
34.农杆菌转化：取出-80℃保存的lba4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入含有编辑渗调蛋白基因的2μl质粒，轻轻弹混匀，置于冰上。后将混匀的液体转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1ml的yeb液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。8,000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μl的yeb液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/l利福平、50mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素的yeb固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。
35.转化烟草叶盘获得转化植株：在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用ms液体制备含有目的基因编辑载体的农杆菌侵染烟草叶盘10min。之后将叶盘置于含2.0mg/l naa+0.5mg/l 6-ba的ms固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。之后进行继代培养，放置于含2.0mg/l naa+0.5mg/l 6-ba+250mg/l cb+50mg/l kan的ms固体培养基上，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·
s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成；将分化芽切下，插入含有500mg/l羧苄青霉素与50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养7-10d，获得经lba4404农杆菌介导转化渗透蛋白基因的再生植株，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得渗透蛋白基因编辑植株。
36.实施例3利用实施例2中分子检测确定为渗透蛋白基因敲除植株，进行收种获得基因编辑素材。渗透蛋白基因编辑素材与红花大金元（对照）在正常条件（蒸馏水），5%peg-6000的干旱胁迫，100mmol/l nacl的盐胁迫下，处理10天后拍照，并进行表型鉴定。
37.将挑选籽粒饱满的烟草种子用蒸馏水冲洗两遍，培养在同一个铺有灭菌卫生纸的圆形培养皿中，对照组中加入蒸馏水，相应处理试剂，3次生物学重复，处理10d后，观察表型。布种后将培养皿置于光照培养箱中25℃，16h光/8h 暗，光强60μmol m-2 s-1
的条件下进行培养。
38.渗调蛋白基因编辑素材与红花大金元（对照）在种子萌发期正常条件下无明显差异，而在5%peg-6000的干旱胁迫，100mmol/l nacl的盐胁迫处理下，均表现出较好的长势（结果如图1所示）。
39.实施例4基因编辑素材与底盘品种红花大金元（对照）在5%peg-6000的干旱胁迫，200mmol/l nacl的盐胁迫下，处理15天后，进行相关生理生化指标（包括叶绿素，4个光合指标，生物量，脯氨酸，可溶性糖和总蛋白）的测定。
40.采用改造的hoagland's (霍格兰氏)营养液进行水培实验，添加5%peg-6000处理
烟草幼苗，处理15天后照相并测定相关生理指标。
41.叶绿素含量的测定：取新鲜烟草叶片，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品 2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm和652nm下测定吸光度，以95%乙醇为空白对照。
42.光合指标的测定：随机挑选4个株系长势一致的烟草，用li-6400光合仪进行光合的测定，测定时间选在当地时间早上10：00-12：00进行。测定每一株的从中心叶开始往下数的第3-4片叶，测定时使用仪器自带光源，光强统一设置为800umol m-2
.s-1
。测定参数包括：净光合速率(pn），气孔导度(gs），蒸腾速率（tr），胞间co2浓度(ci）荧光参数由仪器给出。
43.生物量的测定：随机挑选4个株系长势一致的烟草，整株取样，用清水将烟苗清洗干净后，擦干表面水分﹐烟苗的生物量用电子天平称量。
44.脯氨酸含量的测定：利用酸性茚三酮溶液方法。
45.可溶性糖含量的测定：蒽酮法检测可溶性糖含量测定。
46.可溶性蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝g-250溶液。
47.结果表明基因编辑素材苗期在5%peg-6000与200mmol/l nacl处理烟草幼苗处理15天后，进行生理指标测定，渗调蛋白基因编辑素材除了脯氨酸含量低于对照红花大金元，其余的叶绿素含量，光合指标测定的净光合速率、气孔导度、胞间co2浓度和蒸腾速率，生物量，可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于对照红花大金元（结果如图2、3所示）。苗期生理指标测定发现，在干旱胁迫与盐胁迫下的编辑素材中除了脯氨酸含量低于对照，其余测定生理指标均高于对照，结果表明基因编辑素材的预设靶标物为脯氨酸，即脯氨酸含量在编辑素材中降低，而在干旱胁迫与盐胁迫条件下的其他生理指标均高于对照，说明与对照相比，编辑素材在干旱胁迫与盐胁迫下抗逆性更强。
48.实施例5种植编辑植株与对照植株，成熟期进行新鲜烟叶取样，进行7种氨基酸检测，对新鲜烟叶中7种游离氨基酸进行测定，包括天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、蛋氨酸及亮氨酸分别检测，编辑素材中除了脯氨酸含量显著低于对照素材，其余6种游离氨基酸与对照中氨基酸均无明显差异（结果如图4所示）。
49.为了检测烟草渗调蛋白基因的表达情况，利用实时荧光定量pcr方法检测该基因在成熟期烟草叶片的表达量。实时荧光定量pcr试剂用的是takara公司的sybr premix ex taq tmⅱ。具体检测方法如下：采取在正常条件下，渗调蛋白基因编辑植株与对照（未转化）植株叶片；随后标记放置于液氮中保存，以便后续rna提取及实时荧光定量pcr检测试验。
50.渗调蛋白 qpcr扩增引物如下：qpcr-渗调蛋白-f1：gtggtggagtcctacagtgc（seq id no.6）qpcr-渗调蛋白-r1：gttagtcggggcgaaagtca（seq id no.7）内参基因（18s）扩增引物如下：18s-f：cctacgctctgtatacattagc（seq id no.8）18s-r：gtgttgagtcaaattaagccgc（seq id no.9）每个样品进行三次技术重复，反应体系如下：
sybr premix-ex taq
tm ⅱꢀꢀ
（2
×
）10μl正向引物(10μm）
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.8μl反向引物(10μm）
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0.8μlrox reference dye
ⅱꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.4μlcdna模板
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2μlddh2o
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up to 20μl扩增条件：95℃ 30s；95℃ 10s，60℃ 10s，共40个循环。
51.溶解曲线：95℃ 10s，60℃ 60s, 95℃
ꢀ‑
0.29℃/s。
52.结果表明，烟草渗调蛋白相关的基因在成熟期正常条件下编辑烟草烟草叶片与对照（未转化）中有表达（结果如图5所示）。
53.在成熟期烟叶中，编辑素材中脯氨酸含量及渗调蛋白基因表达量均低于对照，说明烟草渗透蛋白基因从转隶水平与代谢水平影响脯氨酸含量变化，且检测结果相对应。
54.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。