一种用于核酸扩增的捕获核苷酸及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种用于核酸扩增的捕获核苷酸及其应用。

背景技术：

1、microrna(mirna)是一类长度大约在18-25bp之间的非编码单链rna小分子，具有稳定的特异性序列以调节基因表达，参与细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和免疫反应等重要生物过程。以循环mirna为生物标志物的高灵敏度、高特异性、单管多重检测方法亟待开发。

2、mirna的异常表达与人类肿瘤和重大疾病的发生发展密切相关，但是mirna与人类疾病的关联是错综复杂的，一种疾病的发生通常有多个mirna的协同作用，而一种mirna也会参与到多种疾病的发生发展。因此，研究mirna与疾病的关系有重大生物学意义，且其可以作为标记物在肿瘤早期诊断及其预后中提供判断依据。虽然mirna的检测意义被人们高度重视，但目前的检测技术仍然有很大制约。mirna的检测难度在于mirna片段极短，在样本中的浓度极低且检测浓度范围横跨几个数量级；检测单一mirna毫无意义，每种肿瘤常常涉及多种mirna异常表达；每种mirna家族同源性极高，特异性检测较难实现。因此建立准确、高效、多重定量的检测方法是mirna作为肿瘤标记物并进行广泛推广的关键。

3、现有检测mirna的方法包括northern blotting、微阵列法、rt-pcr和rna测序等。northern blotting可以定量检测mirna，通过鉴定mirna的分子量大小及亮度来区分mirna的种类及浓度，但是它操作复杂，检测时间长，而且对低丰度的mirna检测灵敏度较差，同时放射性探针对人和环境会有较大隐患。微阵列法可以定量检测mirna，可以在同一份样品中同时检测上百种基因的表达，通量高，但是价格昂贵，步骤繁琐。rna测序通量高，但是价格昂贵，引物设计困难。rt-pcr包括stem-loop rt-pcr和poly a加尾rt-pcr，这两种传统的逆转录-荧光法都有一定的局限性。stem-loop rt-pcr通过设计一条茎环结构的逆转录引物，包括了和目的靶标mirna互补配对的序列，茎部序列，和一条与通用引物互补配对的环部序列，该方法特异性高，但是引物设计困难，特别是单管多重检测，poly a加尾rt-pcr通过poly a聚合酶催化，将atp转化成的amp在不依赖模板的条件下添加到mirna的3’端，然后通过oligo-dt作为引物逆转录完成cdna的合成，然后进行pcr检测，该方法适用于多重检测，但是特异性差。综上所述，这些方法均具有一定的应用前景，但检测方法的设计理念绝大多数是针对单个mirna进行检测，如仅仅将每重mirna检测体系混合来进行多重检测，往往存在扩增引物间的相互干扰，难以同时满足高通量和多重检测的检测要求。

技术实现思路

1、鉴于现有技术检测mirna的方法存在灵敏度低、特异性差和无法保证不同mirna的单管多重检测缺陷，本发明提出了一种基于自折叠引物(即捕获核苷酸)捕获mirna和通用引物扩增的荧光pcr技术，可在实现多重mirna检测的基础上，同时具有灵敏度高、特异性好、等效扩增的优点。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种用于核酸扩增的捕获核苷酸(自折叠引物)，所述捕获核苷酸从5’端到3’端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列，所述第一通用序列的5’端还包括一段无关序列，所述折叠序列和所述结合捕获序列之间还包括一段能够与所述无关序列互补配对的序列；所述折叠序列包含与靶标分子的5’末端相同的序列；所述结合捕获序列与靶标分子的非5’末端序列互补结合。

3、在本发明的优选实施方案中，所述与靶标分子的5’末端相同的序列的长度为8-18bp。

4、如本发明技术方案之一所述的捕获核苷酸，所述无关序列为随机碱基组成的任何序列，且所述无关序列的tm值使其足够能与其互补序列配对结合，使所述捕获核苷酸形成自折叠结构。

5、在本发明的优选实施方案中，所述无关序列包括polya和/或polyt。

6、如本发明技术方案之一所述的捕获核苷酸，所述捕获核苷酸还包括第二通用序列。

7、在本发明的优选实施方案中，所述第二通用序列位于所述折叠序列和所述能够与所述无关序列互补配对的序列之间。

8、在本发明的具体实施方案中，所述第一通用序列的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述第二通用序列的核苷酸序列如seq id no:2所示。

9、如本发明技术方案之一所述的捕获核苷酸，所述捕获核苷酸还包括核酸延伸阻断位点。

10、在本发明的优选实施方案中，所述核酸延伸阻断位点位于所述折叠序列的3’端。

11、按照本领域常规，所述核酸延伸阻断位点修饰可为spacer、无碱基的磷酸骨架(ap位点)和/或尿嘧啶碱基。

12、在本发明的具体实施方案中，所述捕获核苷酸的序列如seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9或seq id no:11所示。

13、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种用于核酸扩增的试剂盒，所述试剂盒包括如本发明技术方案之一所述的捕获核苷酸。

14、如本发明技术方案之二所述的试剂盒，所述试剂盒还包括一对扩增引物，所述扩增引物的正向引物的核苷酸序列为所述捕获核苷酸的第一通用序列+所述靶标分子全长的子集，所述扩增引物的反向引物的核苷酸序列为所述捕获核苷酸的第二通用序列+所述能够与所述无关序列互补配对的序列+所述结合捕获序列全长的子集，正向、反向引物之间留出能够使特异性探针结合的位置。

15、在本发明的优选实施方案中，所述子集的核苷酸序列的长度为15-25bp。

16、在本发明的具体实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no:1或seqid no:2所示。

17、如本发明技术方案之二所述的试剂盒，所述试剂盒还包括特异性探针。

18、在本发明的较佳实施方案中，所述特异性探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。

19、在本发明的更佳实施方案中，所述荧光基团标记在特异性探针的5’端；和/或，所述淬灭基团标记在特异性探针的3’端。

20、按照本领域常规，所述荧光基团可以选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texasred和lc red460中的任意一种；所述淬灭基团可以选自mgb、bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1和tamra中的任意一种。

21、在本发明的具体实施方案中，所述特异性探针的核苷酸序列如seq id no:4、seqid no:6、seq id no:8、seq id no:10或seq id no:12所示。

22、如本发明技术方案之二所述的试剂盒，所述试剂盒还包括特定序列阻断剂，所述特定序列阻断剂含有一段包含核酸类似物修饰的、能够与非特异性产物互补配对的核酸。

23、根据本领域常规，所述核酸类似物可为锁核酸(lna)、肽核酸(pna)、转置碱基、2'-o,4'-c-methylene bridge rna、2’-o-methyl rna或2’-fluoro rna。

24、在本发明的优选实施方案中，所述核酸类似物为锁核酸(lna)。

25、在本发明的具体实施方案中，所述特定序列阻断剂的核苷酸序列如seq id no:13所示。

26、根据本领域常规，所述试剂盒还包括dna聚合酶、dntp、mg2+、酶切缓冲液、pcr缓冲液中的任意一种或多种。所述试剂盒还可包括测序所需试剂，这些试剂为本领域技术人员周知，例如聚合酶、测序引物等。

27、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种核酸扩增方法，所述核酸扩增方法包括采用如本发明技术方案之一所述的捕获核苷酸结合靶标分子并启动特异性线性扩增和基于扩增引物的核酸扩增检测；所述核酸扩增方法包括以下步骤：

28、(1)5’端序列确定的靶标分子与捕获核苷酸的结合捕获序列进行结合。

29、(2)捕获核苷酸以靶标分子为模板进行延伸反应，在捕获核苷酸的3’末端添加与靶标分子互补的核苷酸，从而形成延伸的捕获核苷酸。

30、(3)延伸的捕获核苷酸变性，无关序列与其互补的序列分离，延伸序列与分子内部的折叠序列进行碱基互补配对，形成新的半发夹结构产物。

31、(4)新的半发夹结构产物再进行延伸反应，在3’末端添加与分子内部的第一通用序列和无关序列互补的核苷酸，进而形成完整的发夹结构产物。

32、(5)以完整的发夹结构产物作为模板，采用扩增引物进行指数式扩增，得到扩增产物。

33、在本发明的优选实施方案中，步骤(4)还包括使用能切割dna单链的3’-5’外切酶，如exo i外切酶。

34、在本发明的优选实施方案中，步骤(5)所述指数式扩增包括聚合酶链式反应。

35、在本发明的优选实施方案中，步骤(5)所述扩增引物为如本发明技术方案之二所述的试剂盒中定义的扩增引物。

36、如本发明技术方案之三所述的核酸扩增方法，所述核酸扩增方法还包括扩增产物与特异性探针结合，进行检测的步骤。

37、在本发明的优选实施方案中，所述特异性探针为如本发明技术方案之二所述的试剂盒中定义的特异性探针。

38、如本发明技术方案之三所述的核酸扩增方法，进行指数式扩增时，在扩增体系中添加如本发明技术方案之二所述的试剂盒中定义的特定序列阻断剂。

39、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：如本发明技术方案之一所述的捕获核苷酸，或如本发明技术方案之二所述的试剂盒在检测mirna中的应用。

40、本发明所述的检测mirna的体系，主要包含基于自折叠引物捕获mirna序列完成cdna转化和基于通用引物扩增的荧光pcr技术两部分，其原理如图1所示：

41、本发明自折叠引物的设计主要有6部分：从5’端开始，u3a为一段无关序列，u1s为上游通用引物区域，t1a为自折叠引物延伸产物的折叠区域(优选为11-12bp)，u2s为下游通用引物区域，u3s为一段与u3a互补配对序列可以使长引物形成自折叠结构，t2s为mirna捕获区域(优选为10-11bp)，t1a和u2s之间优选有核酸延伸阻断修饰，修饰方式可以为本领域的常规方式，只要能截断引物延伸即可，如spacer c18修饰(能阻断dna聚合酶延伸，可有可无，有spacer c18产物更纯粹，引物延伸后截断在这里)，也可以有其他修饰产生截断，比如用多个尿嘧啶修饰，然后用user酶切割，使产物截断。

42、所述核酸延伸阻断修饰使得发夹式结构产物在使用通用引物和/或靶标分子特异引物进行pcr扩增时，在核酸延伸阻断修饰处终止延伸，进而产生一个线性化的扩增模板，用于后续的指数式扩增，提高扩增的效率。本发明中，将核酸延伸阻断修饰设置在t1a和u2s之间，不仅不影响延长的捕获核苷酸的自我折叠，而且还可以在捕获核苷酸自我折叠后，以自身为模板进行自我延伸，从而形成具有完整的发夹式结构的产物；所述发夹式结构产物可以作为通用引物和/或靶标分子特异性引物进行pcr扩增时的模板，进行pcr指数式扩增，有效保证了扩增的特异性和准确性。

43、如图1所示，本发明检测mirna的原理主要分为两大步骤：

44、步骤一：基于u3a/u3s自折叠引物的逆转录。当存在目的靶标mirna时，t2s可以与mirna序列的3’端通过碱基互补配对，在逆转录酶的作用下，延伸出与mirna序列的5’互补的t1s，当变性时，mirna与延伸后的自折叠引物分离，延伸后产物通过t1s与t1a的重组自折叠形成新的半发卡结构，在逆转录酶的作用下延伸出完整的茎环结构，而脱落下的目的靶标mirna进入下一逆转录循环过程中。

45、步骤二：基于通用引物的pcr扩增。步骤一形成的完整茎环结构在通用引物和特异性探针的作用下，完成pcr指数扩增及检测。

46、本发明所述mirna检测体系，为了提高pcr扩增效率，引入了exo i外切酶(具有3’-5’外切酶活性，只切割dna单链)，可以在逆转录完成后，切割过量的自折叠引物和非特异性单链产物，其中过量的自折叠引物被切割掉t2s使其变成无法作用的残次片段。

47、本发明所述mirna检测体系，所涉及的特异性探针两端分别标记有荧光检测基团和淬灭基团。所优选的荧光检测基团是fam、vic、texas red、cy5中的任意一种。所优选的淬灭基团可以是mgb。

48、本发明所述mirna检测体系，所涉及的引物可以不是双通用引物，可以是单条通用引物+一条特异性引物进行扩增。

49、如图1所示，捕获核苷酸的t2s和t1a可以根据mirna的长度、gc含量作出改变，比如如果t2s区域gc含量高，就可以变短序列长度但是又不能影响逆转录的结合，从而增加t1a的长度；通用引物长度也可以改变，只要满足pcr扩增要求就可以。

50、只要满足扩增原理，捕获核苷酸的各部分可以进行变形，比如u3a的5’端可以有部分碱基不与任何序列互补配对；u3a和u3s只要能互补结合，可以有少量错配碱基；t2s和t2a只要能互补结合，可以有少量错配碱基。

51、步骤二中的扩增引物的长度或比例可根据待扩增序列的组成、长度、所需特异性等进行常规调节。除使用u1s之外，引物序列可以为u1s(第一通用序列)+t1a+t2a(靶标分子)全长的子集，反向引物u2s也可以用u2s(第二通用序列)+u3s(能够与所述无关序列互补配对的序列)+t2s(结合捕获序列)全长的子集(正反引物之间需要留出探针位置，即如果正向引物是t1a+t2a，则反向引物就不能包括t2s甚至是u3s。

52、本发明所述互补包括完全互补和部分互补。通常，对于需要延伸的核酸链，其3’端序列在对应的互补链上至少90％互补，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或完全互补，只要不影响核酸链延伸即可。

53、本发明中，通过设置位于折叠序列和能够与所述无关序列互补配对的序列之间的第二通用序列，在进行捕获核苷酸的延长和自我折叠后，得到的新的发夹式结构产物可以采用特异引物和/或通用引物作为上下游引物，进行pcr扩增检测，可以实现对多重靶标分子等效扩增的效果。

54、本发明中，第一通用序列、第二通用序列和无关序列可以是人工合成序列。因此，在针对不同靶标分子进行检测时，只需要根据靶标分子设计捕获核苷酸的折叠序列和结合捕获序列，而第一通用序列、第二通用序列和无关序列可保持不变。在一些实施方案中，为了降低非特异性扩增，根据不同靶标分子设计捕获核苷酸的折叠序列和结合捕获序列，而第一通用序列和第二通用序列保持不变。

55、本发明中第一通用序列、第二通用序列可以根据所检测的靶标的不同进行不同的选择和配置。

56、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

57、本发明所用试剂和原料均市售可得。

58、本发明的积极进步效果在于：

59、(1)本发明的mirna检测技术，利用通用引物扩增技术，实现了对不同mirna的单管多重检测，减少了引物之间的相互干扰，且满足等效扩增。

60、(2)本发明中，具有特殊自折叠结构的引物，可以有效提高mirna的捕获效率以增加灵敏度，而且具有二次识别mirna的作用，第一次是依靠t2s识别捕获靶标，第二次是依靠延伸靶标序列后的t1s折叠识别，可以极大程度提高反应特异性。

61、(3)本发明中引入特定序列阻断剂，可以抑制非特异性逆转录产物的扩增，提高阳性信号的扩增。