新型冠状病毒抗体及其用途的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及高中和活性的新型冠状病毒sars-cov-2或其变体的抗体或其抗原结合片段及其应用。还提供了编码本发明抗体或其抗原结合片段的核酸分子，用于表达本发明抗体或其抗原结合片段的载体和宿主细胞，以及本发明抗体或其抗原结合片段的治疗和诊断方法和用途。


背景技术：

2.截至2020年10月22日，新型冠状病毒2019-ncov导致的疾病(covid-19)的全球确诊病例已超4000万例，死亡病例累计已超110万例，对公众的生命和健康造成重大威胁。然而，目前对于该病毒还没有特效药物。
3.治疗性抗体药物不但在肿瘤和自身免疫疾病方面占有重要地位，在传染性疾病的治疗中也同样有效。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(rsv)感染的帕利珠单抗(synagis)，治疗hiv感染的艾巴利珠单抗(trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的rabishield。同时还有针对众多病毒的单克隆抗体处于临床研究的不同阶段。
4.2019-ncov属于冠状病毒。同属冠状病毒的重症急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)以及中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)也曾在分别在2002-2003年和2012年引发疫情。据世界卫生组织(who)统计sars-cov共引发8000人感染，794人死亡(https://www.who.int/)。自2012年至今，mers-cov感染病毒病例在持续增加，截至2019年底，全球确诊2499例感染病例，861例死亡病例。2020年1月12日，世界卫生组织正式将该新型冠状病毒命名为“2019新型冠状病毒(2019-ncov)”，其后在2020年2月11-12日国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy of viruses,ictv)宣布，新型冠状病毒(2019-ncov)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)，世界卫生组织(who)同日在日内瓦举办全球研究和创新论坛上宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为“covid-19”。
5.近日，南非又曝出了另一种更具传染性的新冠病毒变体，其导致南非近期新冠确诊病例数激增，南非科学家和卫生官员将其命名为“501.v2”，并认为这种变异病毒可能是引发南非第二波疫情的主要原因。然而，目前的多种新冠疫苗均对南非变异的病毒无效。
6.病毒要感染细胞，首先需要通过囊膜蛋白结合宿主的受体。抗体，尤其是中和活性抗体，通过结合到囊膜蛋白上，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染。同时，抗体结合到囊膜蛋白上，从而对游离的病毒或是被感染的细胞进行标记，通过抗体的fc区募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。因此，靶向受体结合区(receptor binding domain，rbd)的抗体，不但具有中和病毒感染的活性，还可以通过fc区发挥作用，促进病毒以及被感染细胞的清除。
7.与受体结合的重要囊膜蛋白是刺突蛋白(s)，s可进一步分为s1和s2两部分。s2的作用是介导膜融合。s1的n端(ntd)和c端(ctd)都可能是rbd，ctd是此冠状病毒的rbd，结合
受体ace2。因此靶向rbd的抗体，并且是阻断s与ace2结合的抗体，可能成为抑制病毒感染的中和抗体。


技术实现要素：

8.本发明提供了特异性结合sars-cov-2或其变体rbd的抗体或其抗原结合片段，其具有针对sars-cov-2或其变体的高中和活性等优势。本发明提供的中和sars-cov-2或其变体的抗体或其抗原结合片段可作为独立的疗法或与其它疗法/或其他药物联合。
9.在一个方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars-cov-2或其变体的受体结合结构域(rbd)，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示的重链可变区的cdr序列hcdr1、hcdr2与hcdr3和/或轻链可变区的cdr序列lcdr1、lcdr2和lcdr3：
10.hcdr1：gfx1vx2x3ny(seq id no:144)，其中，x1选自l、t、e、r、q、v、w、i或s，优选地，x1选自l、t、e、r、q、v或i；x2选自q、g、d、r、p、m、k、v、a、n或y，优选地，x2选自q、g、d、r、p、n或y；x3选自r、w、y、a、f、v或h，优选地，x3选自w、r、a、f或v；
11.hcdr2：iypggx4t(seq id no:145)，其中，x4为t或s；
12.hcdr3：arvlpmygdyldy(seq id no:3)；
13.lcdr1：qx5ix6x7y(seq id no:146)，其中，x5选自v、d、q、a、w、r、n、s、d、m、k或p，优选地，x5选自q、a、r、n、s、d或m；x6选自n、h、l、g、p、s、m、e、v、r、d、a或i，优选地，x6选自e、l、v、r、d、e或a；x7选自h、v、f、p、n、s、r、q、g、y或t，优选地，x7选自q、p、s、g、p、r或y；
14.lcdr2：aas(seq id no:5)；
15.lcdr3：qqsx8sx9x
10
peyt(seq id no:147)，其中，x8选自g、y、t、s、k、a、n、e或p，优选地，x8选自a、n、s或p；x9选自p、s、i、n、a、w或f，优选地，x9选自s、p或a；x
10
选自t、v、l、i、r、k、s、m或f，优选地，x
10
选自s、r、t、k、v、l或f。
16.在一些实施方式中，seq id no:146所示的lcdr1不包括seq id no:4所示的lcdr1。
17.在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含seq id no:144、145和3所示的hcdr1、hcdr2与hcdr3和seq id no:146、5和147所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
18.在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含seq id no:144、145和3所示的hcdr1、hcdr2与hcdr3和seq id no:4、5和6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
19.在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含seq id no:1、2和3所示的hcdr1、hcdr2与hcdr3和seq id no:146、5和147所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
20.优选地，本文任一实施方式所述的seq id no:144所示的hcdr1选自seq id no:26、28、29、31、32、33、34、35、104、105、106、107、108、109、110和111中任一所示的hcdr1，优选选自seq id no:26、28、29、31、32、33、34和35中任一所示的hcdr1。
21.优选地，本文任一实施方式所述的seq id no:145所示的hcdr2选自seq id no:27和30任一所示的hcdr2。
22.优选地，本文任一实施方式所述的seq id no:146所示的lcdr1选自seq id no:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140和142中任一所示的lcdr1，优选选自seq id no:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和56中任一所示的lcdr1。
23.优选地，本文任一实施方式所述的seq id no:147所示的lcdr3选自seq id no:37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141和143中任一所示的lcdr3，优选选自seq id no:37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57中任一所示的lcdr3。
24.在一些实施方式中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区含有选自以下组的hcdr1、hcdr2和hcdr3：seq id no:104、27和3；seq id no:26、27和3；seq id no:28、27和3；seq id no:29、30和3；seq id no:105、27和3；seq id no:31、30和3；seq id no:32、30和3；seq id no:106、30和3；seq id no:107、30和3；seq id no:108、27和3；seq id no:33、30和3；seq id no:109、27和3；seq id no:110、30和3；seq id no:111、30和3；seq id no:34、30和3；和seq id no:35、30和3。在一些实施方式中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:31、30和3所示。优选地，在这些实施方式的一部分实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:4、5和6所示。
25.在一些实施方式中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区含有选自以下组的lcdr1、lcdr2和lcdr3：seq id no:112、5、113；seq id no:114、5、115；seq id no:116、5、117；seq id no:118、5、119；seq id no:120、5、121；seq id no:122、5、123；seq id no:124、5、125；seq id no:126、5、127；seq id no:128、5、129；seq id no:130、5、131；seq id no:132、5、133；seq id no:134、5、135；seq id no:136、5、137；seq id no:138、5、139；seq id no:140、5、141；seq id no:142、5、143；seq id no:36、5、37；seq id no:38、5、39；seq id no:40、5、41；seq id no:42、5、43；seq id no:44、5、45；seq id no:46、5、47；seq id no:48、5、49；seq id no:50、5、51；seq id no:52、5、53；seq id no:54、5、55；和seq id no:56、5、57。在一些实施方式中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区含有选自以下组的lcdr1、lcdr2和lcdr3：seq id no:48、5、49；和seq id no:54、5、55。优选地，在这些实施方式的一部分实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1、2和3所示。
26.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中：
27.所述重链可变区包含：
28.(ⅰ)氨基酸序列分别如seq id no:26、seq id no:27和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:26、seq id no:27和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
29.(ⅱ)氨基酸序列分别如seq id no:28、seq id no:27和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:28、seq id no:27和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
30.(ⅲ)氨基酸序列分别如seq id no:29、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:29、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
31.(ⅳ)氨基酸序列分别如seq id no:31、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:31、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分
别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
32.(
ⅴ
)氨基酸序列分别如seq id no32、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:32、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
33.(ⅵ)氨基酸序列分别如seq id no:33、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:33、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
34.(ⅶ)氨基酸序列分别如seq id no:34、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:34、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
35.(
ⅷ
)氨基酸序列分别如seq id no:35、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:35、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
36.(ix)氨基酸序列分别如seq id no:104、seq id no:27和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:104、seq id no:27和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
37.(x)氨基酸序列分别如seq id no:105、seq id no:27和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:105、seq id no:27和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
38.(xi)氨基酸序列分别如seq id no:106、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:106、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
39.(xii)氨基酸序列分别如seq id no:107、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:107、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
40.(xiii)氨基酸序列分别如seq id no:108、seq id no:27和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:108、seq id no:27和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
41.(xiv)氨基酸序列分别如seq id no:109、seq id no:27和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:109、seq id no:27和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3
42.(xv)氨基酸序列分别如seq id no:110、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:110、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
43.(xvi)氨基酸序列分别如seq id no:111、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或与seq id no:111、seq id no:30和seq id no:3所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
44.所述轻链可变区包含：
45.(ⅰ)氨基酸序列分别如seq id no:36、seq id no:5和seq id no:37所示的lcdr1、
lcdr2和lcdr3；或与seq id no:36、seq id no:5和seq id no:37所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
46.(ⅱ)氨基酸序列分别如seq id no:38、seq id no:5和seq id no:39所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:38、seq id no:5和seq id no:39所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
47.(ⅲ)氨基酸序列分别如seq id no:40、seq id no:5和seq id no:41所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:40、seq id no:5和seq id no:41所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
48.(ⅳ)氨基酸序列分别如seq id no:42、seq id no:5和seq id no:43所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:42、seq id no:5和seq id no:43所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
49.(
ⅴ
)氨基酸序列分别如seq id no:44、seq id no:5和seq id no:45所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:44、seq id no:5和seq id no:45所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
50.(ⅵ)氨基酸序列分别如seq id no:46、seq id no:5和seq id no:47所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:46、seq id no:5和seq id no:47所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
51.(ⅶ)氨基酸序列分别如seq id no:48、seq id no:5和seq id no:49所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:48、seq id no:5和seq id no:49所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
52.(
ⅷ
)氨基酸序列分别如seq id no:50、seq id no:5和seq id no:51所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:50、seq id no:5和seq id no:51所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
53.(
ⅸ
)氨基酸序列分别如seq id no:52、seq id no:5和seq id no:53所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:52、seq id no:5和seq id no:53所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
54.(
ⅹ
)氨基酸序列分别如seq id no:54、seq id no:5和seq id no:55所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:54、seq id no:5和seq id no:55所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
55.(
ⅺ
)氨基酸序列分别如seq id no:56、seq id no:5和seq id no:57所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:56、seq id no:5和seq id no:57所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
56.(xii)氨基酸序列分别如seq id no:112、seq id no:5和seq id no:113所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:112、seq id no:5和seq id no:113所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
57.(xiii)氨基酸序列分别如seq id no:114、seq id no:5和seq id no:115所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:114、seq id no:5和seq id no:115所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
58.(xiv)氨基酸序列分别如seq id no:116、seq id no:5和seq id no:117所示的
lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:116、seq id no:5和seq id no:117所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
59.(xv)氨基酸序列分别如seq id no:118、seq id no:5和seq id no:119所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:118、seq id no:5和seq id no:119所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
60.(xvi)氨基酸序列分别如seq id no:120、seq id no:5和seq id no:121所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:120、seq id no:5和seq id no:121所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
61.(xvii)氨基酸序列分别如seq id no:122、seq id no:5和seq id no:123所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:122、seq id no:5和seq id no:123所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
62.(xviii)氨基酸序列分别如seq id no:124、seq id no:5和seq id no:125所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:124、seq id no:5和seq id no:125所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
63.(xix)氨基酸序列分别如seq id no:126、seq id no:5和seq id no:127所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:126、seq id no:5和seq id no:127所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
64.(xx)氨基酸序列分别如seq id no:128、seq id no:5和seq id no:129所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:128、seq id no:5和seq id no:129所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
65.(xxi)氨基酸序列分别如seq id no:130、seq id no:5和seq id no:131所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:130、seq id no:5和seq id no:131所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
66.(xxii)氨基酸序列分别如seq id no:132、seq id no:5和seq id no:133所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:132、seq id no:5和seq id no:133所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
67.(xxiii)氨基酸序列分别如seq id no:134、seq id no:5和seq id no:135所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:134、seq id no:5和seq id no:135所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
68.(xxiv)氨基酸序列分别如seq id no:136、seq id no:5和seq id no:137所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:136、seq id no:5和seq id no:137所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
69.(xxv)氨基酸序列分别如seq id no:138、seq id no:5和seq id no:139所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:138、seq id no:5和seq id no:139所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
70.(xxvi)氨基酸序列分别如seq id no:140、seq id no:5和seq id no:141所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:140、seq id no:5和seq id no:141所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
71.(xxvii)氨基酸序列分别如seq id no:142、seq id no:5和seq id no:143所示的
lcdr1、lcdr2和lcdr3；或与seq id no:142、seq id no:5和seq id no:143所示氨基酸序列分别具有1、2或3个氨基酸差异的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
72.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段不包括hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:35、30和3所示，lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:54、5和55所示的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段也不包括hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1、2和3所示，lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:38、5和39所示的抗体或其抗原结合片段。
73.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段包含：
74.(ⅰ)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:29、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:54、seq id no:5和seq id no:55所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
75.(ⅱ)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:32、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:54、seq id no:5和seq id no:55所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
76.(ⅲ)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:26、seq id no:27和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:54、seq id no:5和seq id no:55所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
77.(ⅳ)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:35、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:48、seq id no:5和seq id no:49所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
78.(
ⅴ
)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:29、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:36、seq id no:5和seq id no:37所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
79.(ⅵ)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:32、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:36、seq id no:5和seq id no:37所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
80.(ⅶ)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:33、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:36、seq id no:5和seq id no:37所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
81.(
ⅷ
)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:33、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
82.(
ⅸ
)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:34、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
83.(
ⅹ
)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:31、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:54、seq id no:5和seq id no:55所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或
84.(
ⅺ
)重链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:31、seq id no:30和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和轻链可变区，其包含氨基酸序列分别如seq id no:48、seq id no:5和seq id no:49所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
85.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自seq id no:58-73中任一所示的重链可变区或与所述任一重链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区，优选选自seq id no:59、60、61、63、64、68、72和73中任一所示的重链可变区或与所述任一重链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区，更优选选自seq id no:59、61、64、72和73中任一所示的重链可变区或与所述任一重链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区。在这些方案的一些优选实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区如seq id no:8所示。
86.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自seq id no:74-100中任一所示的轻链可变区或与所述任一轻链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区，优选选自seq id no:83、84、85、86、88、89、90、93、94、95和98中任一所示的轻链可变区或与所述任一轻链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区，更优选选自seq id no:83、90和95中任一所示的轻链可变区或与所述任一轻链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区。在这些方案的一些优选实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区如seq id no:7所示。
87.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自seq id no:58-73中任一所示的重链可变区或与所述任一重链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区，优选选自seq id no:59、60、61、63、64、68、72和73中任一所示的重链可变区或与所述任一重链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区，更优选选自seq id no:59、61、64、72和73中任一所示的重链可变区或与所述任一重链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区；轻链可变区选自seq id no:74-100中任一所示的轻链可变区或与所述任一轻链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区，优选选自seq id no:83、84、85、86、88、89、90、93、94、95和98中任一所示的轻链可变区或与所述任一轻链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区，更优选选自seq id no:83、90和95中任一所示的轻链可变区或与所述任一轻链可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区。
88.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区：
89.(ⅰ)所述重链可变区包含如seq id no:59、60、61、63、64、68、72或73中任一项所示的氨基酸序列，或与seq id no:59、60、61、63、64、68、72或73中任一项所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:83、84、85、86、88、89、90、93、94、95或98中任一项所示的氨基酸序列，或与seq id no:83、84、85、86、88、89、90、93、94、95或98中任一项所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
90.(ⅱ)所述重链可变区包含如seq id no:61所示的氨基酸序列，或与seq id no:61所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:95所示的氨基酸序列，或与seq id no:95所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
91.(ⅲ)所述重链可变区包含如seq id no:64所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:64所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:95所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:95所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
92.(ⅳ)所述重链可变区包含如seq id no:59所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:59所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:95所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:95所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
93.(
ⅴ
)所述重链可变区包含如seq id no:73所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:73所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:90所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:90所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
94.(ⅵ)所述重链可变区包含如seq id no:61所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:61所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:83所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:83所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
95.(ⅶ)所述重链可变区包含如seq id no:64所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:64所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:83所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:83所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
96.(
ⅷ
)所述重链可变区包含如seq id no:68所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:68所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:83所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:83所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
97.(
ⅸ
)所述重链可变区包含如seq id no:68所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:68所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:8所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:8所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
98.(
ⅹ
)所述重链可变区包含如seq id no:72所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:72所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:8所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:8所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
99.(
ⅺ
)所述重链可变区包含如seq id no:63所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:63所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:95所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:95所示的
氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
100.(xii)所述重链可变区包含如seq id no:63所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:63所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含如seq id no:90所示的氨基酸序列，或包含与seq id no:90所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
101.(xiii)所述重链可变区包含如seq id no:61、64或59所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含如seq id no:95所示的氨基酸序列；或所述重链可变区包含如seq id no:73所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含如seq id no:90所示的氨基酸序列；或所述重链可变区包含如seq id no:61、64或68所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含如seq id no:83所示的氨基酸序列；或所述重链可变区包含如seq id no:68或72所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含如seq id no:8所示的氨基酸序列。
102.在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段不包括重链可变区的氨基酸序列如seq id no:73所示、轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:95所示的抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段也不包括重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示、轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:84所示的抗体或其抗原结合片段。
103.在一些实施方式中，本发明所述抗体包含重链和轻链：
104.(ⅰ)所述重链包含如seq id no:101所示的氨基酸序列，或与seq id no:101所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链包含如seq id no:102所示的氨基酸序列，或与seq id no:102所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
105.(ⅱ)所述重链包含如seq id no:103所示的氨基酸序列，或与seq id no:103所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链包含如seq id no:102所示的氨基酸序列，或与seq id no:102所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
106.(iii)所述重链包含如seq id no:101或103所示的氨基酸序列，和所述轻链包含如seq id no:102所示的氨基酸序列；或
107.(ⅳ)所述重链包含如seq id no:148所示的氨基酸序列，或与seq id no:148所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链包含如seq id no:149所示的氨基酸序列，或与seq id no:149所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
108.(
ⅴ
)所述重链包含如seq id no:148所示的氨基酸序列，或与seq id no:148所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和所述轻链包含如seq id no:150所示的氨基酸序列，或与seq id no:150所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
109.在一些实施方式中，本发明所述抗体为全人抗体或人源化抗体。
110.在一些实施方式中，本发明所述抗原结合片段选自fab、fab'、fab'-sh、fv、scfv、f(ab')2、sdab或双抗体。
111.在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段是任何igg亚型，如igg1、igg2、igg3或igg4。在一些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段是igg1型。
112.在一些实施方式中，本发明所述的抗体是单克隆抗体。
113.本发明还提供了一种多特异性抗体，包含本文所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区。
114.本发明还提供了一种单链抗体，包含本文所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区。
115.本发明还提供了一种免疫缀合物，其包含与治疗剂或诊断剂缀合的本文所述抗体或其抗原结合片段。
116.在又一个方面，本发明提供了多核苷酸分子，其编码权利要求本文所述的抗体或其抗原结合片段。
117.在又一个方面，本发明提供了表达载体，其包含本文所述的多核苷酸分子，优选地，所述载体为真核表达载体。
118.在又一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本文所述的多核苷酸或表达载体，或表达本文所述的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述宿主细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
119.在又一个方面，本发明提供了一种制备本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，以使其表达所述抗体或其抗原结合片段，并回收所表达的抗体或其抗原结合片段。
120.在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其含有本文所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、所述表达载体和/或所述宿主细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
121.在又一个方面，本发明提供了药物组合，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，以及一种或多种另外的治疗剂。
122.在又一个方面，本发明提供了如本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、本文所述的药物组合物和/或本文所述的药物组合在制备治疗和/或预防sars-cov-2或其变体感染的药物中的用途。
123.在又一个方面，本发明提供了一种治疗和/或预防sars-cov-2或其变体感染的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段、所述多核苷酸分子、所述表达载体、所述宿主细胞、所述药物组合物和/或所述的药物组合。
124.在又一个方面，本发明提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、本文所述的药物组合物或本文所述的药物组合，其用于治疗和/或预防sars-cov-2或其变体感染的疾病；优选地，所述sars-cov-2变体包括阿尔法突变株(alpha突变株)、贝塔突变株(beta突变株)、伽马突变株(gamma突变株)、德尔塔突变株(delta突变株)、epsilon突变株、zeta突变株、eta突变株、theta突变株、iota突变株、卡帕突变株(kappa突变株)、缪突变株(mu突变株)和奥密克戎突
变株(omicron突变株)中的至少一种；优选为奥密克戎突变株。
125.在又一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所述的抗体或其抗原结合片段、所述多核苷酸分子、所述表达载体、所述宿主细胞和/或所述药物组合物。
126.在一些实施方式中，本发明提供了所述的试剂盒在制备诊断sars-cov-2或其变体感染的药物中的用途。
127.在又一个方面，本发明提供了一种使用本文所述的抗体或其抗原结合片段或所述多肽检测sars-cov-2或其变体在样品中的存在的方法，所述方法包括使本文所述的抗体或其抗原结合片段与所述样品接触，并检测是否存在所述抗体或其抗原结合片段与sars-cov-2或其变体cbd结合产生的结合物或结合信号。
附图说明
128.图1：js016轻重链cdr序列。
129.图2：突变文库构建流程。
130.图3a-3d：结合elisa检测js016亲和力成熟抗体的结合作用。
131.图4a-4d：阻断elisa检测js016亲和力成熟抗体的阻断作用。
132.图5：js016-38和js016-40两株抗体体外对sars-cov-2活病毒中和活性。
133.图6a：js016与rbd和rbd突变蛋白结合elisa图谱。
134.图6b：js016-38与rbd和rbd突变蛋白结合elisa图谱。
135.图6c：js016-40与rbd和rbd突变蛋白结合elisa图谱。
136.图7a：js016抑制rbd和rbd突变蛋白与ace2结合。
137.图7b：js016-38抑制rbd和rbd突变蛋白与ace2结合。
138.图7c：js016-40抑制rbd和rbd突变蛋白与ace2结合。
139.图8a：cb6和rbd-his、rbd-omicron-his结合的动力学参数。
140.图8b：js016-40和rbd-his、rbd-omicron-his结合的动力学参数。
141.图8c：js016-41-yte和rbd-his、rbd-omicron-his结合的动力学参数。
142.图8d：js016-77-yte和rbd-his、rbd-omicron-his结合的动力学参数。
143.图9：抗体与sars-cov-2的omicron突变株s蛋白体外结合活性。
144.图10a：cb6和js016-40的假病毒中和活性。
145.图10b：js016-41-yte的假病毒中和活性。
146.图10c：js016-77-yte的假病毒中和活性。
具体实施方式
147.定义
148.除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
149.为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考current protocols in molecular biology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标
准3字母和/或1字母代码。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。
150.术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，包括但不限于
±
5％、
±
2％、
±
1％和
±
0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法。
151.术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
152.如本文所用，术语“或”应被理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包容性的，即，包括数量或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，额外的未列出的项目。只有明确指出相反的术语下，例如“只有一个”或“的确一个”或者在权利要求中使用“由...组成”时，将指的是仅列出的一个数字或列表的一个元素。
153.术语“百分比(％)氨基酸序列同一性”或简称“同一性”定义为在将氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选氨基酸序列中的氨基酸残基与参比氨基酸序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
154.术语“免疫应答”是指由例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用导致从人体选择性损害、破坏或清除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或者在自体免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
155.术语“信号转导途径”或“信号转导活性”是指通常由蛋白质间相互作用诸如生长因子对受体的结合启动的生化因果关系，所述关系导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。一般地，传递包括引起信号转导的系列反应中的一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。倒数第二过程通常包括细胞核事件，从而导致基因表达的变化。
156.术语“活性”或“生物活性”，或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用，包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗sars-cov-2活性的能力、ic50、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性(即通常与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性)，和保持哺乳动物细胞中蛋白质高表达水平的能力。使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于elisa、facs或biacore等离子体共振分析、不受限制的体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源(包括人类、灵长类或任何其它来源)的组织切片的免疫组织化学。
157.术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特
异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。
158.术语“分离的抗体”是指结合化合物的纯化状态，且在这种情况下意指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。
159.术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
160.术语抗体(“亲代抗体”)的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于fab，fab'，f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段两者。
[0161]“fab片段”由一条轻链和一条重链的ch1及可变区组成。
[0162]“fab
′
片段”含有一条轻链和一条包含vh结构域、ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，两个fab
′
片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab
′
)2分子。
[0163]“f(ab
′
)2片段”含有两条轻链和两条包含vh结构域、ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab
′
)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab
′
片段组成。
[0164]“fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
[0165]“单链fv抗体(scfv抗体)”是指包含抗体的vh和vl结构域的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。一般而言，scfv多肽在vh和vl结构域之间包含多肽接头，该接头使得scfv能形成用于抗原结合的所需结构。
[0166]“fc区”用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的c端区域。该术语包括天然序列fc区和变异fc区。在一些实施方式中，人igg重链fc区从cys226或pro230延伸至重链的羧基末端。但是，fc区的c端赖氨酸(lys447)可能存在或不存在(此段中的编号是根据eu编号系统，也称为eu索引，如rabat等人，sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md,1991)。
[0167]
术语“结构域抗体”是只含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个vh区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个vh区可靶向相同或不同的抗原。
[0168]
术语“二价抗体”包含2个抗原结合部位。在某些情况下，2个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的。
[0169]
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(vh-vl或vl-vh)中与轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)。通过使用短得不允许在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。
[0170]
术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含基本所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(fr)区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(fc)。
[0171]
术语“全人抗体”是指只包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则全人抗体可含有鼠糖链。同样，“小鼠抗体”是指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。或者，如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在来源于大鼠细胞的杂交瘤中产生，则全人抗体可含有大鼠糖链。同样，“大鼠抗体”是指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
[0172]
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的抗体与2019-ncov rbd蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
[0173]“同种型”抗体是指由重链恒定区基因提供的抗体种类(例如，igm、ige、igg诸如iggl、igg2或igg4)。同种型还包括这些种类之一的修饰形式，其中修饰已被产生来改变fc功能，例如以增强或减弱效应子功能或对fc受体的结合。
[0174]
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由各种化学活性表面分子诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于在变性溶剂存在下，与前者而非与后者的结合丧失。
[0175]
本文中所描述的术语“交叉反应”指的是对人类、猴、和/或鼠源(小鼠或大鼠)相同靶分子的抗原片段的结合。因此，“交叉反应”应被理解为与在不同物种中表达的相同分子x的种属间反应。
[0176]“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子x对其配偶物y的亲和力可以通常由平衡解离常数(kd)代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的fortebio动力学结合测定法。
[0177]
术语“不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的kd为1.0
×
10-6
m或更高，更优选1.0
×
10-5
m或更高，更优选1.0
×
10-4
m或更高、1.0
×
10-3
m或更高，更优选1.0
×
10-2
m或更高。
[0178]
术语“高亲和性”对于igg抗体而言，是指对于抗原的kd为1.0
×
10-6
m或更低，优选5.0
×
10-8
m或更低，更优选1.0
×
10-8
m或更低、5.0
×
10-9
m或更低，更优选1.0
×
10-9
m或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，igm亚型的“高亲和性”结合是指kd
为10-6
m或更低，优选10-7
m或更低，更优选10-8
m或更低。
[0179]
术语“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”以及“多核苷酸分子”是指脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语包括具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢的含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸(参见，属于kariko等人的美国专利no.8,278,036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mrna分子，合成所述mrna分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(batzer等人，nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等人，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini等人，mol.cell.probes 8:91-98(1994))。
[0180]“构建体”是指任何重组多核苷酸分子(诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链dna或rna多核苷酸分子)，衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，构成如下多核苷酸分子，其中已经以功能操作的方式连接(即，可操作地连接)一或多个多核苷酸分子。重组构建体通常会包含可操作地连接至转录起始调节序列的本发明的多核苷酸，这些序列会导引多核苷酸在宿主细胞中的转录。可使用异源及非异源(即，内源)启动子两者导引本发明的核酸的表达。
[0181]“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源dna引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链dna环，可将额外dna区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其中可将额外dna区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。在引入到宿主细胞中后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，且因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够导引被操作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。
[0182]
本文所用术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点，以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。
[0183]
用于细胞或受体的“活化”、“刺激”和“处理”可具有相同含义，例如细胞或受体用配体活化、刺激或处理，除非上下文另外或明确规定。“配体”包括天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合化合物。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指通过内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。“应答/反应”，例如细胞、组织、器官或生物体的应答，包括生化或生理行为(例如生物区室内的浓度、密度、粘附或迁移、基因表达速率或分化状态)的改变，其中改变与活化、刺激或处理有关，或者与例如遗传编程等内部机制有关。
[0184]
如本文中所用，术语任何疾病或病症的“治疗”或“医治”在一个实施方式中是指改善疾病或病症(即，减缓或阻止或减少疾病的进展或其临床症状的至少一个)。在另一个实施方式中，“治疗”或“医治”是指缓解或改善至少一个身体参数，包括可能不能被患者辨别出的那些物理参数。在另一个实施方式中，“治疗”或“医治”是指在身体上(例如，可辨别的
症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或在这两方面调节疾病或病症。除非在本文中明确描述，否则用于评估疾病的治疗和/或预防的方法在本领域中通常是已知的。
[0185]“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。如本文中所用，术语“cyno”或“食蟹猴”是指食蟹猴。
[0186]“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的连续施用。
[0187]“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指本发明的新型冠状病毒抗体或其抗原结合片段当单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的抗体或其抗原结合片段的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。当对个体施用单独给予的活性成分时，治疗有效剂量仅是指该成分。当组合施用时，治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的综合量，不论是组合、依次给予还是同时给予。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10％，通常至少20％，优选至少约30％，更优选至少40％，最优选至少50％。
[0188]“药学上可接受的载体”是指药物制剂或组合物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
[0189]
术语“癌症”在本文中用于指表现出异常高水平的增殖和生长的一组细胞。癌症可能是良性的(也称为良性肿瘤)，恶性前或恶性。癌细胞可以是实体癌细胞或白血病癌细胞。本文使用的术语“肿瘤”是指包含癌症的一个或多个细胞。术语“肿瘤生长”在本文中用于指代包含癌症的一种或多种细胞的增殖或生长，其导致癌症的大小或程度的相应增加。
[0190]
抗体或其抗原结合片段
[0191]
在一个方面，本发明提供了特异性结合sars-cov-2或其变体的rbd的抗体或其抗原结合片段。
[0192]
本文中，sars-cov-2的变体包括但不限于阿尔法突变株(alpha突变株)、贝塔突变株(beta突变株)、伽马突变株(gamma突变株)、德尔塔突变株(delta突变株)、epsilon突变株、zeta突变株、eta突变株、theta突变株、iota突变株、卡帕突变株(kappa突变株)、缪突变株(mu突变株)和奥密克戎突变株(omicron突变株)中的至少一种。在一些实施方案中，sars-cov-2的变体为奥密克戎突变株。
[0193]
在一些实施方式中，sars-cov-2变体为具有选自k417n、e484k和n501y中的任意一个、任意两个或全部三个的突变体。在一些实施方式中，sars-cov-2变体为sars-cov-2南非突变株501y.v2，其包含三个主要的特征性突变位点：k417n、e484k和n501y。南非突变株501y.v2除了与英国突变株b.1.1.7亚型有相同的n501y突变外，不同之处在于还包含了对病毒感染能力有潜在重要影响的s蛋白e484k和k417n两个关键位点的突变。这两个位点可能会提高s蛋白与人表皮细胞受体的结合能力。
[0194]
在一些实施方式中，本发明提供了结合sars-cov-2或其变体rbd的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本发明提供了阻断sars-cov-2或其变体rbd与ace2结合的抗体。
[0195]
在一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合
sars-cov-2或其变体的受体结合结构域(rbd)，其中所述抗体或其抗原结合片段包含的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3分别为：
[0196]
hcdr1：gfx1vx2x3ny，其中，x1选自l、t、e、r、q、v、w、i或s，优选地，x1选自l、t、e、r、q、v或i；x2选自q、g、d、r、p、m、k、v、a、n或y，优选地，x2选自q、g、d、r、p、n或y；x3选自r、w、y、a、f、v或h，优选地，x3选自w、r、a、f或v；
[0197]
hcdr2：iypggx4t，其中，x4为t或s；
[0198]
hcdr3：arvlpmygdyldy；
[0199]
lcdr1：qx5ix6x7y，其中，x5选自v、d、q、a、w、r、n、s、d、m、k或p，优选地，x5选自q、a、r、n、s、d或m；x6选自n、h、l、g、p、s、m、e、v、r、d、a或i，优选地，x6选自e、l、v、r、d、e或a；x7选自h、v、f、p、n、s、r、q、g、y或t，优选地，x7选自q、p、s、g、p、r或y；
[0200]
lcdr2：aas；
[0201]
lcdr3：qqsx8sx9x
10
peyt，其中，x8选自g、y、t、s、k、a、n、e或p，优选地，x8选自a、n、s或p；x9选自p、s、i、n、a、w或f，优选地，x9选自s、p或a；x
10
选自t、v、l、i、r、k、s、m或f，优选地，x
10
选自s、r、t、k、v、l或f。
[0202]
上述取代中，n、t和s等均为极性不带电荷的脂肪族氨基酸，s、r、n和d等为极性的脂肪族氨基酸，d、g、v和i等均为脂肪族氨基酸，l和p等均为非极性氨基酸，y和f等均为芳香族氨基酸，y和s等均为极性不带电荷的氨基酸，n、q和h等均为极性氨基酸，h和r等均为极性带电荷的氨基酸。因此，可用这些氨基酸相互替换，所得cdr在用于构建结合sars-cov-2或其变体rbd的抗体或其抗原结合片段时仍保留本文所述的结合活性。
[0203]
在本发明所述cb6抗体，描述于pct/cn2021/077392及其同族专利申请中。上述专利申请/专利以引用的方式并入本文中，用于所有目的。
[0204]
抗体cb6的重链可变区(cb6-vh)的氨基酸序列(seq id no:7)：
[0205]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvssnymswvrqapgkglewvsviysggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0206]
抗体cb6的轻链可变区(cb6-vl)的氨基酸序列(seq id no:8)：
[0207]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystppeytfgqgtkleik
[0208]
cb6的重链(cb6-hc)的氨基酸序列(seq id no:9)：
[0209]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvssnymswvrqapgkglewvsviysggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk*
[0210]
cb6的轻链/vl-cκ(cb6-lc)的氨基酸序列(seq id no:10)：
[0211]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystppeytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec*
[0212]
cb6的vh-ch1的氨基酸序列(seq id no:11)：
[0213]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvssnymswvrqapgkglewvsviysggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepksc
[0214]
本发明在上述cb6抗体的基础上，通过噬菌体展示技术，获得如下43个克隆：
[0215]
重链突变库克隆氨基酸序列：
[0216]
cb6-1-vh seq id no:58
[0217]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgflvqrnymswvrqapgkglewvsviypggttfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0218]
cb6-2-vh seq id no:59
[0219]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvgwnymswvrqapgkglewvsviypggttfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0220]
cb6-3-vh seq id no:60
[0221]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfevdwnymswvrqapgkglewvsviypggttfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0222]
cb6-4-vh seq id no:61
[0223]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfrvrrnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0224]
cb6-5-vh seq id no:62
[0225]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfqvgynymswvrqapgkglewvsviypggttfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0226]
cb6-6-vh seq id no:63
[0227]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfvvqanymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0228]
cb6-7-vh seq id no:64
[0229]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvpfnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0230]
cb6-8-vh seq id no:65
[0231]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfwvpfnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0232]
cb6-9-vh seq id no:66
[0233]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfqvmwnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0234]
cb6-10-vh seq id no:67
[0235]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfqvkwnymswvrqapgkglewvsviypggttfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0236]
cb6-11-vh seq id no:68
[0237]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgflvpvnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0238]
cb6-12-vh seq id no:69
[0239]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfivvhnymswvrqapgkglewvsviypggttfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0240]
cb6-13-vh seq id no:70
[0241]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgflvaanymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0242]
cb6-14-vh seq id no:71
[0243]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfsvdrnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0244]
cb6-15-vh seq id no:72
[0245]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfqvnrnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0246]
cb6-16-vh seq id no:73
[0247]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfivyrnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvss
[0248]
各重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列及其序列编号如下表a所示：
[0249]
表a
[0250][0251][0252]
轻链突变库克隆氨基酸序列
[0253]
cb6-17-vl seq id no:74
[0254]
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[0255]
cb6-18-vl seq id no:75
[0256]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdihvylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsgspvpeytfgqgtkleik
[0257]
cb6-19-vl seq id no:76
[0258]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqqinfylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsgsslpeytfgqgtkleik
[0259]
cb6-20-vl seq id no:77
[0260]
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[0261]
cb6-21-vl seq id no:78
[0262]
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[0263]
cb6-22-vl seq id no:79
[0264]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrilpylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsssatpeytfgqgtkleik
[0265]
cb6-23-vl seq id no:80
[0266]
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[0267]
cb6-24-vl seq id no:81
[0268]
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[0269]
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[0270]
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[0271]
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[0272]
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[0273]
cb6-27-vl seq id no:84
[0274]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsilpylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsnsprpeytfgqgtkleik
[0275]
cb6-28-vl seq id no:85
[0276]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdivsylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsasptpeytfgqgtkleik
[0277]
cb6-29-vl seq id no:86
[0278]
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[0279]
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[0280]
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[0281]
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[0282]
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[0283]
cb6-32-vl seq id no:89
[0284]
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[0285]
cb6-33-vl seq id no:90
[0286]
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[0287]
cb6-34-vl seq id no:91
[0288]
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[0289]
cb6-35-vl seq id no:92
[0290]
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[0291]
cb6-36-vl seq id no:93
[0292]
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[0293]
cb6-37-vl seq id no:94
[0294]
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[0295]
cb6-38-vl seq id no:95
[0296]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnierylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsasstpeytfgqgtkleik
[0297]
cb6-39-vl seq id no:96
[0298]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqpinqylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsksslpeytfgqgtkleik
[0299]
cb6-40-vl seq id no:97
[0300]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqkisqylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqstsfmpeytfgqgtkleik
[0301]
cb6-41-vl seq id no:98
[0302]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqaiayylnwyqqkpgkapkleiyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqspsafpeytfgqgtkleik
[0303]
cb6-42-vl seq id no:99
[0304]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsiiqylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsasarpeytfgqgtkleik
[0305]
cb6-43-vl seq id no:100
[0306]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnihtylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsgssipeytfgqgtkleik
[0307]
各轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列和相应的序列编号如下表b所示：
[0308]
表b
[0309][0310]
js016-38-hc seq id no:101
[0311]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfrvrrnymswvrqapgkglewvsviypggstfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk*
[0312]
js016-38-lc/js016-40-lc seq id no:102
[0313]
divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnierylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsasstpeytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec*
[0314]
js016-40-hc seq id no:103
[0315]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvgwnymswvrqapgkglewvsviypggttfyadsvkgrftisrdnsmntlflqmnslraedtavyycarvlpmygdyldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk*
[0316]
本发明的所述抗体的可变区cdr的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任何方案来确定，包括基于抗体的三维结构和cdr环的拓扑学的chothia(chothia等人.(1989)nature 342:877-883；al-lazikani等人,“standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,journal of molecular biology,273,927-948(1997))、基于抗体序列可变性的kabat(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest，第4版，u.s.department of health and human services,national institutes of health(1987))，abm(university of bath)，contact(university college london)，国际immunogenetics database(imgt)(1999nucleic acids research,27,209-212)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的north cdr定义。
[0317]
除非另有说明，否则本发明抗体的cdr可以由本领域的技术人员根据本领域的任何方案(例如不同的指派系统或组合)确定边界。
[0318]
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的cdr的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的cdr序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体cdr序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体cdr序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统或组合)而导致其所声称的cdr边界与本发明所定义的具体cdr边界不同。
[0319]
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的cdr。然而，尽管cdr在抗体与抗体之间是不同的，但是cdr内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用kabat,chothia、abm、contact和north方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是cdr的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定cdr序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何cdr的变体。例如，在一个cdr的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据kabat或chothia定义的其余cdr残基可以被保守氨基酸残基替代。
[0320]
在一些实施方式中，本发明抗体或抗原结合片段的cdr的边界采用imgt方案界定。
[0321]
在一些实施方式中，氨基酸变化包括氨基酸缺失、插入或置换。在一些实施方式
中，本发明的抗新型冠状病毒抗体或其抗原结合片段包括具有已通过氨基酸缺失、插入或置换突变的(特别地在上述序列中描绘的cdr区中)但仍与上述抗体有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的那些抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体与具体序列中描绘的cdr区相比较时，在cdr区中已通过氨基酸缺失、插入或置换的氨基酸突变不超过1、2、3、4或5个。在一些实施方式中，本发明的抗体与具体序列中框架区相比较时，在框架区中已通过氨基酸缺失、插入或置换的氨基酸突变不超过1、2、3、4或5个。
[0322]
在一些实施方式中，编码本发明抗体的多核苷酸分子包括已通过核苷酸缺失、插入或置换突变的，但仍然与上文中所述的序列中描绘的cdr对应编码区具有至少约60、70、80、90、95或100％同一性的多核苷酸分子。
[0323]
在一些实施方式中，可在本文中所提供抗体的fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生fc区变体。fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人fc区序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区)。
[0324]
在一些实施方式中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代mab”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。
[0325]
在一些实施方式中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
[0326]
抗体表达
[0327]
在又一个方面，本发明提供了一种多核苷酸分子，其编码本文所述的抗体或其抗原结合片段。所述多核苷酸分子可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的多核苷酸分子，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的多核苷酸分子。
[0328]
在又一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如本文所述的多核苷酸分子，优选地，所述载体为真核表达载体。在一些实施方式中，如本文所述的多核苷酸分子包含在一个或多个表达载体中。
[0329]
在又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如本文所述的多核苷酸分子或如本文所述的表达载体或表达本文所述的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述宿主细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
[0330]
在又一个方面，本发明提供了一种用于制备如本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，使其表达所述抗体或其抗原结合片段，并回收所表达的抗体或其抗原结合片段。
[0331]
本发明提供用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括可获自美国典型培养物保藏中心(atcc)的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0、sp2/0细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞、a549细胞、293t细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、
牛、马和仓鼠细胞。通过测定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。
[0332]
在一个实施方式中，本发明提供制备本文所述的抗体的方法，其中所述方法包括，将表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够的一段时间，以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中，来产生抗体。可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
[0333]
很可能由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体彼此具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的组成部分，而不论抗体的糖基化如何。同样，在某些实施方式中，非岩藻糖基化抗体是有利的，因为它们通常在体外和体内具有比其岩藻糖基化对应物更强力的功效，并且不可能是免疫原性的，因为它们的糖结构是天然人血清igg的正常组分。
[0334]
药物组合物和药物制剂
[0335]
在又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表达载体或本文所述的宿主细胞，和药学上可接受的载体或赋形剂。应理解，本发明提供的抗体或其药物组合物可以整合制剂中合适的运载体、赋形剂和其他试剂以联合给药，从而提供改善的转移、递送、耐受等。
[0336]
术语“药物组合物”指这样的制剂，其允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0337]
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料(remington's pharmaceutical sciences，第16版，osol,a.编辑(1980))混合来制备包含本文所述的抗体的药物制剂，优选地以水溶液或冻干制剂的形式。
[0338]
本发明的药物组合物或制剂还可以包含一种或多种其它活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。在一些实施方式中，其它的活性成分为化疗剂、免疫检查点抑制剂、生长抑制剂、抗生素或已知的各种抗肿瘤或抗癌剂，所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。在一些实施方式中，本发明的药物组合物还包含编码本文所述的抗体的多核苷酸分子的组合物。
[0339]
在又一个方面，本发明提供了一种药物组合，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、或本文所述的药物组合物，以及一种或多种另外的治疗剂。
[0340]
在又一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、或本文所述的药物组合物。
[0341]
医药用途及治疗方法
[0342]
本文提供的任何抗体均可用于治疗方法。还应当理解，在讨论“抗体”时，也包括包含抗体的组合物。本发明的抗体可以治疗有效量或预防有效量用于本发明任一实施方式所述的治疗或预防方法中。
[0343]
在又一个方面，本发明提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞、或本文所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防sars-cov-2或其变体感染的药物中的用途；优选地，所述sars-cov-2变
cov-2或其变体感染。该药盒可含有本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物。
[0353]
在一些实施方案中，本文还提供以下用途：本文任一实施方案所述的试剂盒在制备诊断sars-cov-2或其变体感染的药物中的用途；或本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体或宿主细胞在制备用于检测样品中是否存在sars-cov-2或其变体的检测试剂、检测试纸或检测芯片中的应用；或本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞、检测试剂和/或检测试纸或检测芯片在制备用于检测样品中是否存在sars-cov-2或其变体的试剂盒中的应用。
[0354]
本发明包括所述特定实施方式的所有组合。本发明的进一步实施方式及可应用性的完整范畴将自下文所提供的详细描述变得显而易见。然而，应理解，尽管详细描述及特定实施例指示本发明的优选实施方式，但仅以说明的方式提供这些描述及实施例，因为本发明的精神及范畴内的各种改变及修改将自此详细描述对熟悉此项技术者变得显而易见。出于所有目的，包括引文在内的本文所引用的所有公开物、专利及专利申请将以引用的方式全部并入本文。
[0355]
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
[0356]
本发明采用下述缩略词：
[0357]
od代表光密度；
[0358]
hrp代表辣根过氧化物酶；
[0359]
iptg代表异丙基-β-d-硫代半乳糖苷；
[0360]
tmb代表3,3',5,5'-四甲基联苯胺；
[0361]
pbs代表磷酸缓冲盐溶液；
[0362]
pbst代表pbs+0.05％tween 20。
[0363]
实施例
[0364]
通过以下实施例对本发明进行说明，但并不旨在对本发明作出任何限制。本文已经详细描述了本发明，其中也公开了其具体实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
[0365]
实施例1：噬菌体展示技术
[0366]
1.1 fab构建
[0367]
以cb6-hc的质粒(君实生物自制)为模板通过pcr获得抗体可变区vh片段，以cb6-lc的质粒(君实生物自制)模板通过pcr获得抗体可变区vl片段，然后分别通过与ch1,cκ重叠pcr获得vh-ch1(氨基酸序列如seq id no：11所示)和vl-cκ(氨基酸序列如seq id no：10所示)。vh-ch1和vl-cκ通过重叠pcr组装成fab片段。将fab片段分别和pcos载体(君实生物自制)用sfii(购自neb公司)酶切并用试剂盒回收。上述酶切片段和载体用t4连接酶(购自neb公司)连接，得到含有fab序列的pcos-cb6质粒，转化至大肠杆菌top10，铺板第二天送测序，经序列比对分析得到正确的fab克隆。
[0368]
1.2 cdr关键位点突变文库的构建及文库的淘选
no:24)
[0388]
dp-ex:gag gag gag gag gag gag agaagc gta gtc cgg aac gtc(seq id no:25)
[0389]
1.3 elisa筛选
[0390]
从平板上挑取单克隆于含有250ul体积的0.05％葡萄糖、2
×
yt培养基(1l含16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠)的96孔板中37度培养4小时。待od
600
值≥0.6时，加入1m iptg至终浓度1mm，摇匀，30度培养过夜。将链霉亲和素稀释至5μg/ml包被，每孔加入50ul并4度过夜。洗板并用2％脱脂牛奶封闭。用pbst洗涤液洗板4次，将生物素化的sars-cov-2rbd(君实自制)抗原稀释至3ug/ml包被，每孔50ul，室温孵育0.5小时，洗板后备用。将过夜培养好的96孔板以4000rpm/分钟离心10分钟，收集上清。将上清40ul和10ul 10％脱脂牛奶加入包被抗原的板中，室温孵育1小时。洗板后再与1:3000稀释的山羊抗人igg(fab特异性)过氧化物酶抗体37℃孵育1小时，然后与0.1mg/ml的hrp底物tmb 37℃孵育15分钟显色，检测od
450
信号。共获得43个od
450
读值较高的克隆，并送测序分析。
[0391]
1.4克隆与sars-cov-2rbd的结合
[0392]
从43个克隆保存的菌液中挑取2ul至含有250ul体积的0.05％葡萄糖、2yt培养基的96孔板中37度培养4小时。待od
600
值≥6时，加入1m iptg至终浓度1mm，30度培养过夜。4000rpm/分钟离心10分钟后弃上清。加入100ul预冷的1
×
tes缓冲液重悬，然后加入150ul预冷的0.2
×
tes缓冲液，冰上静置0.5小时，4000rpm/分钟离心10分钟，收集上清，获得周质腔提取液。
[0393]
将链霉亲和素稀释至5μg/ml包被，每孔加入50ul并4度过夜。洗板并用2％脱脂牛奶封闭。用pbst洗涤液洗板4次，将生物素化的sars-cov-2rbd(君实自制)抗原稀释至3ug/ml包被，每孔50ul，室温孵育0.5小时，洗板后备用。将初步定量的周质腔提取液按3倍梯度稀释加入包被抗原的板中，室温孵育1小时。洗板后再与1:3000稀释的山羊抗人igg(fab特异性)过氧化物酶抗体37℃孵育1小时，然后与0.1mg/ml的hrp底物tmb 37℃孵育15分钟显色，检测od
450
信号，使用软件graphpad prism四参数拟合ec
50
。
[0394]
如表1所示，43个克隆中大部分克隆ec
50
都有5到10倍的提升，根据ec
50
的排序，挑选亲和力较高的8个重链和11个轻链序列进行排列组合，并构建成igg形式的分子用于进一步验证。表1中，cb6-hc的氨基酸序列如seq id no：9所示，重链cb6-1-hc到cb6-16-hc的vh序列分别如seq id no：58-73所示、其余部分为seq id no：9中的相应部分；cb6-lc的氨基酸序列如seq id no：10所示，轻链cb6-17-lc到cb6-43-lc的vl部分分别如seq id no：74-100所示、其余部分为seq id no：10中的相应部分。
[0395]
表1：43个克隆及ec
50
值
[0396]
[0397][0398]
实施例2：候选抗体的构建与筛选
[0399]
2.1候选抗体的构建
[0400]
从实施例1的表1中挑选亲和力较高的8个重链和11个轻链序列进行排列组合，并构建成igg形式的分子用于进一步测试亲和力，抗体编号如表2所示。
[0401]
表2：cb6突变轻重链库组合
[0402][0403]
[0404]
2.2候选抗体的筛选
[0405]
将重组sars-cov-2rbd-his(君实生物自制)稀释至3.0μg/ml包被，37℃孵育90分钟，洗板并用2％脱脂牛奶封闭。加入不同浓度的cb6(js016)和表2所示组合库抗体(从2μg/ml到2ng/ml，10倍梯度稀释，共4个浓度梯度)，37℃孵育1小时并洗板。再与1:5000稀释的山羊抗人igg(fc特异性)过氧化物酶抗体37℃孵育1小时，然后与0.1mg/ml的hrp底物tmb 37℃孵育15分钟显色，检测结合信号。将js016-1到js016-107号抗体浓度在20ng/ml时的od
450
读数与cb6抗体浓度在20ng/ml时的od
450
读数的比值作为相对活性，比值越高，表明结合活性越强。将js016-1到js016-107号抗体蛋白表达水平(单位mg/l)与cb6蛋白表达水平的比值作为相对表达水平，比值越高，表明表达越好。如表3所示，cb6突变轻重链库组合产生的抗体相对活性绝大多数都优于对照抗体cb6，提示亲和力获得提高。选择相对结合活性和相对表达水平均较高的js016-38、39、40、73、83、84、88、106和107号分子进一步开展验证。
[0406]
表3：cb6突变轻重链库组合产生抗体的相对活性
[0407]
[0408][0409]
实施例3：本发明抗体体外结合活性
[0410]
将重组sars-cov-2-rbd-his(君实生物自制)稀释至3.0μg/ml包被，37℃孵育90分钟，洗板并用2％脱脂牛奶封闭。加入不同浓度的js016抗体(阳性对照cb6(js016)从40μg/ml到0.009537ng/ml，候选抗体从8μg/ml到0.001907ng/ml，4倍梯度稀释)，37℃孵育1小时并洗板。再与1:5000稀释的山羊抗人igg(fc特异性)过氧化物酶抗体37℃孵育1小时，然后与0.1mg/ml的hrp底物tmb 37℃孵育15分钟显色，检测抗体的结合信号。使用软件graphpad prism四参数拟合ec
50
。
[0411]
结果如表4和图3a-3d所示，通过结合elisa测定，本发明抗体与重组sars-cov-2-rbd的结合能力均强于cb6抗体，结合能力提高约3-6倍，其中js016-38及js016-40两个抗体结合能力最强。
[0412]
实施例4：本发明抗体体外阻断活性
[0413]
将重组sars-cov-2-rbd-his稀释至5.0μg/ml包板，37℃温育90分钟。洗板并用2％脱脂牛奶封闭。用2％脱脂牛奶将重组人ace2，c端鼠fc标签稀释至5.0μg/ml，再用其稀释js016抗体(阳性对照cb6(js016)从400μg/ml到2.26ng/ml，候选抗体从80μg/ml到0.452ng/ml，3倍梯度稀释)。将混合物加入板中37℃孵育1小时并洗板。通过与1:5000稀释的过氧化物酶标记羊抗鼠fc片段二抗37℃孵育1小时，再加入0.1mg/ml的tmb并37℃孵育20分钟。使用软件graphpad prism四参数拟合ic
50
。
[0414]
结果如表5和图4a-4d所示，通过阻断elisa测定，本发明抗体均能更有效的阻断sars-cov-2病毒s蛋白的rbd与其受体ace2结合，阻断能力高约2.5-4.5倍，其中js016-38/40/83/106阻断能力略高于其余抗体。
[0415]
表4：elisa结合与阻断活性
[0416][0417]
实施例5：octet red 96e测定本发明抗体对sars-cov-2rbd的亲和力
[0418]
使用protein a捕获法测定js016-38和抗原rbd-his(sars-cov-2rbd)结合的动力学参数。将浓度为5μg/ml的js016-38结合在protein a探针上(cat no:18-5010；lot：2001131)，将抗原rbd-his用1x fortebio工作液(1x pbs+0.05％吐温20)从120nm往下2倍稀释设5个浓度梯度与抗体结合，于1x fortebio工作液中解离。
[0419]
使用protein a捕获法测定js016-40和抗原rbd-his结合的动力学参数。将浓度为5μg/ml的js016-40结合在protein a探针上(cat no:18-5010；lot：2001131)，将抗原rbd-his用1x fortebio工作液(1x pbs+0.05％p20)从120nm往下2倍稀释设5个浓度梯度与抗体结合，于1x fortebio工作液中解离。
[0420]
使用protein a捕获法测定cb6和抗原rbd-his结合的动力学参数。将浓度为5μg/ml的cb6结合在protein a探针上(cat no:18-5010；lot：2001131)，将抗原rbd-his用1x fortebio工作液(1x pbs+0.05％p20)从120nm往下2倍稀释设5个浓度梯度与抗体结合，于1x fortebio工作液中解离。
[0421]
抗体js016-38、抗体js016-40和抗体cb6与rbd-his结合的动力学参数见表5。
[0422]
js016-38和js016-40的结合速率与cb6相当，解离速率比cb6慢约100倍，亲和力常数比cb6提高约100倍。js016-38和js016-40的结合能力提高主要是解离变慢贡献的。
[0423]
表5：本发明抗体的动力学参数
[0424]
抗体kon(1/ms)kdis(1/s)kd(m)cb61.89e+054.97e-032.63e-08js016-381.35e+05《1.00e-05《7.41e-11js016-401.71e+052.03e-051.19e-10
[0425]
注：kd为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；kd＝kdis/kon。
[0426]
实施例6：本发明抗体活病毒中和活性
[0427]
准备1个96孔平底细胞培养板，在第一列8个孔中加入90μl抗体稀释液(dmem完全培养基，gibco)，其余孔中加入50μl抗体稀释液。取40μg/ml的js016-38抗体向第一列的8个孔中各加入10μl，使抗体终浓度为4μg/ml。用8道移液器将第一列中液体混匀后，吸取50μl加入到第二列中混匀，再吸取50μl加入到下一列中混匀，依次操作，进行2倍的系列稀释，共稀释10次，总计11个不同浓度抗体，最后一列不加抗体的对照。js016-40和cb6抗体(js016)稀释方法相同。cb6抗体最高浓度5μg/ml，共稀释10次，总计11个不同浓度抗体。
[0428]
取出培养箱中事先准备好的vero e6细胞(汇合率达80％～90％)，以t75培养瓶为例，吸去瓶中的培养基，加入5ml pbs缓冲液清洗细胞，倾去pbs后，加入3ml 0.25％胰酶-edta，使其浸没细胞消化1分钟，倾去胰酶，置于细胞培养箱中消化5分钟，轻轻拍打培养瓶侧壁使细胞脱落，加入10ml培养基中和胰酶，吹打几次后转移至离心管中，210g离心5分钟，倾去上清，用10ml dmem完全培养基(gibco)重悬细胞，细胞计数，用dmem完全培养基将细胞稀释至1.5
×
105个/ml。
[0429]
在p3实验室生物安全柜中，用抗体稀释液将sars-cov-2稀释至2
×
103tcid
50
/ml(依据提供的病毒原液滴度计算稀释倍数进行稀释)；在有抗体的96孔板中，每孔加入50μl病毒，使每孔含病毒的量为100tcid
50
/孔；每个抗体浓度做8个复孔，设置不加抗体孔，不加病毒孔(额外的96板)作为对照。将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％co2)孵育1小时。
[0430]
孵育1小时后，向96孔板中每孔加100μl之前稀释好的vero e6细胞，使每孔细胞为1.5
×
104个。将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％co2培养72小时。72小时后从细胞培养箱中取出96孔板，置于光学显微镜下观察并统计细胞病变效应(cpe)的情况。中和抑制率＝100-病变孔数/8。根据中和抑制率结果，利用生物统计学软件graphpad拟合计算nd
50
。
[0431]
由图5可以看出两株单克隆抗体均能够抑制sars-cov-2对vero e6细胞的侵染，具有浓度梯度依赖效应，js016-38和js016-40的nd
50
分别为0.47
±
0.16μg/ml和0.09
±
0.02μg/ml。经过亲和力成熟突变后，js016-40的中和活性与cb6相比提高了4倍，而js016-38的中和活性与cb6相当。
[0432]
实施例7：本发明抗体与sars-cov-2-rbd突变体结合活性
[0433]
使用3.0μg/ml的重组sars-cov-2-rbd及其突变体(君实自制)蛋白包板，37℃温育90分钟；用2％脱脂牛奶封闭；使用梯度稀释的候选抗体(从40μg/ml至0.009537ng/ml，按4
倍梯度稀释)与其结合，37℃温育1小时。用1:5000稀释的山羊抗人igg(fc特异性)过氧化物酶抗体进行检测，37℃温育1小时，最后用0.1mg/ml tmb 37℃温育显色15分钟后终止，使用软件graphpad prism四参数拟合ec
50
。
[0434]
其中，重组sars-cov-2-rbd突变体分别为：k417n、e484k和n501y突变。
[0435]
如表6所示，与最初报道的sars-cov-2-rbd野生型(抗原名称rbd-his)相比，抗体cb6与突变型rbd-k417n-his不结合，与rbd-n501y-his及rbd-e484k-his的结合很弱(图6a)。本发明抗体js016-38及js016-40与rbd-his、突变型rbd-n501y-his、rbd-k417n-his及rbd-e484k-his均具有较强的结合能力(图6b和6c)，且ec
50
显著优于对照抗体cb6。
[0436]
表6：本发明抗体与sars-cov-2rbd及其突变体蛋白结合
[0437][0438]
注：”na”表示不结合。
[0439]
实施例8：本发明抗体阻断sars-cov-2突变体与ace2结合
[0440]
使用5.0μg/ml的重组sars-cov-2-rbd及其突变体蛋白包板，37℃温育90分钟，用2％脱脂牛奶封闭。用2％脱脂牛奶将重组人ace2-mfc稀释至5.0μg/ml，再用其稀释js016抗体(从400μg/ml到2.26ng/ml，按3倍梯度稀释)，将混合物加到封闭后的板上37℃温育，孵育1小时。用1:5000稀释的过氧化物酶标记羊抗鼠fc片段二抗进行检测，37℃温育，孵育1小时。最后用0.1mg/ml tmb显色15分钟后终止，使用软件graphpad prism四参数拟合ic
50
。
[0441]
其中，重组sars-cov-2-rbd突变体分别为：k417n、e484k和n501y突变。
[0442]
如表7所示，与最初报道的sars-cov-2-rbd野生型(抗原名称rbd-his)相比，cb6抗体需要很高浓度才能阻断rbd-n501y-his及rbd-e484k-his与ace2的结合，不能阻断rbd-k417n-his与ace2的结合(图7a)。本发明抗体js016-38及js016-40均能分别阻断rbd-his、
rbd-n501y-his、rbd-k417n-his及rbd-e484k-his突变体与ace2的结合，且ic
50
显著优于对照抗体cb6(图7b，7c)。
[0443]
表7：本发明抗体阻断sars-cov-2rbd及其突变体与ace2结合
[0444][0445]
注：”na”表示不结合。
[0446]
实施例9：biacore
tm 8k测定抗体对抗原的亲和力
[0447]
使用proteina捕获法分别测定抗体cb6、js016-40、js016-41-yte和js016-77-yte和抗原rbd-his(君实自制)或rbd-omicron-his(购自义翘神州，货号40592-v08h121)结合的动力学参数。本文所述的js016-41-yte、js016-77-yte分别由js016-41、js016-77替换重链恒定区得到，抗体js016-41-yte的重链氨基酸序列如seq id no:148所示，轻链氨基酸序列如seq id no:149所示；js016-77-yte的重链氨基酸序列如seq id no:148所示，轻链氨基酸序列如seq id no:150所示。
[0448]
具体而言，将浓度为1μg/ml的抗体结合在protein a芯片上(label no:29139131-aa；lot：10261132)，将抗原用1x hbs-ep工作液(购自life science，br-1006-69)从72nm或36nm往下2倍稀释设6个浓度梯度与抗体结合，于hbs-ep工作液中解离。
[0449]
各抗体和rbd-his、rbd-omicron-his结合的动力学参数见表8，动力学特征参数检测结果分别如图8a、8b、8c和8d所示。结果显示，cb6对omicron无结合，js016-40、js016-41-yte和js016-77-yte对omicron有较好的结合；js016-41-yte和js016-77-yte与rbd-his的结合速率与cb6相当，解离速率比cb6慢约100倍，与rbd-his的亲和力常数比cb6提高约100倍。
[0450]
表8：抗体和rbd-his、rbd-omicron-his结合的动力学参数
[0451][0452]
实施例10：抗体与sars-cov-2的omicron突变株s蛋白体外结合活性(elisa)
[0453]
将重组sars-cov-2的omicron突变株s蛋白(购自acro，货号：spn-c52hz)稀释至3.0μg/ml，置于包被板中，37℃孵育90分钟，洗板并用含有2％脱脂牛奶的pbs溶液封闭。加入不同浓度的抗体(从10μg/ml到0.61ng/ml，4倍梯度稀释，共8个浓度)，37℃孵育1小时并洗板。再与1:5000(v/v)稀释的山羊抗人igg(fc特异性)过氧化物酶抗体(购自sigma，货号a0170，作为检测抗体)37℃孵育1小时，然后与0.1mg/ml的hrp底物tmb 37℃孵育15分钟显色，最后用2m hcl溶液终止反应，在450nm/620nm下读板，检测得到结合信号。使用软件graphpad prism进行四参数对数回归(4pl)模型拟合，得到ec50。
[0454]
测试结果如表9和图9所示。cb6对omicron突变株s蛋白无结合活性，js016-40、js016-41-yte、js016-77-yte均优于cb6。
[0455]
表9：抗体与sars-cov-2的omicron突变株s蛋白体外结合活性
[0456][0457][0458]
实施例11：假病毒中和活性
[0459]
利用荧光素酶报告基因系统，检测待测抗体对sars-cov-2omicron突变株(购自vazyme，货号：dd1568-03)假病毒感染293-ace2细胞(诺唯赞，产品编号：dd1401-01)的阻断作用。
[0460]
将sars-cov-2omicron突变株突变株(1μl病毒/孔)假病毒分别与待测抗体(从100μg/ml到0.1pg/ml，10倍梯度稀释)在37℃预孵育1h。然后用实验缓冲液(dmem培养基(1x)+10v/v％fbs)重悬293-ace2细胞，并按每孔20000个细胞加入到假病毒与抗体混合液中，放于37℃培养箱孵育24h。孵育结束后，向每孔加入50μl荧光素酶报告基因检测试剂(bright-lite luciferase assay system，购自vazyme，货号：dd1204)，并用酶标仪检测荧光信号，之后用graphpad prism软件进行四参数对数回归(4pl)模型拟合曲线，得出ic50值。
[0461]
测试结果如表10和图10a、10b、10c所示。cb6对omicron突变株无中和活性，js016-40、js016-41-yte、js016-77-yte的ic50分别为24.57ng/ml、17.62ng/ml、776.4ng/ml，均优于cb6。
[0462]
表10：抗体的假病毒中和活性
[0463]
样品名称ic50(ng/ml)cb6无活性js016-4024.57js016-41-yte17.62js016-71-yte776.4