一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素及其应用

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素及其应用。


背景技术：

2.畜禽生长过程中感染细菌已是屡见不鲜的事情。大肠杆菌作为一种消化道常在菌，容易造成动物的高发病率和高死亡率，增加动物的治疗成本，同时严重影响养殖行业的经济效益。饲料、饮水以及传播媒介等都可能成为大肠杆菌的感染来源，并且大肠杆菌在动物的羽毛、粪便、舍内空气等中广泛存在。由于大肠杆菌的血清型具有多样性，并且各个血清型之间的交叉免疫效果不高，采用疫苗无法防止和减少大肠杆菌的感染和携带。因此针对大肠杆菌病，常常使用抗生素来进行治疗并且都能有效地控制病情，然而长期大量地使用抗生素却导致如今大肠杆菌非常容易产生耐药性。抗生素对大肠杆菌无法起作用的情况并不罕见，甚至威胁食品卫生安全。
3.为避免滥用抗生素带来的不良影响，科学家们也在不断尝试开发新型的动物专用抗菌药物及其替代品，其中噬菌体疗法备受关注。噬菌体是一类以细菌、真菌等微生物为宿主的病毒，并且广泛分布于自然环境和人体。与抗生素疗法截然不同的是噬菌体疗法可以特异性地裂解宿主细菌，对特定的细菌进行防控，对其他正常菌群不造成影响。噬菌体独特的作用机制在避免细菌耐药性上具有极大优势。此外，与研发新的抗生素相比，从自然界中分离获得噬菌体在时间和经济成本上也占有优势。在临床实践上，我们已经能够通过噬菌体来清除病患或病畜体内的病原菌和改善相应的病症。
4.内溶素是由噬菌体编码的一种高度进化的肽聚糖水解酶，本质为一种蛋白分子，弥补了噬菌体本质为病毒的不足，较噬菌体直接治疗更易被临床所接受，是从噬菌体中提取的一类新型抗菌药物。内溶素在噬菌体复制过程中表达，它可以破坏细菌细胞壁肽聚糖的关键化学键，由于肽聚糖是细菌细胞壁的主要结构成分，细菌细胞壁肽聚糖层的破坏将导致细菌的溶解和细胞的死亡，使得子代噬菌体得以释放，以此来发挥抗菌活性。
5.内溶素成为抑制病原性菌株感染的新兴手段，其优势在于具有抗生素不具备的优点。噬菌体内溶素不易产生耐药性，来源广泛，在体内体外对革兰氏阳性菌具有良好的抗菌作用，具有良好的生物安全性和较高的种属特异性。将内溶素作为抗菌剂使用时，革兰氏阴性菌的外膜结构会阻碍裂解酶与细菌细胞壁进行结合，导致内溶素难以对革兰氏阴性菌进行有效杀灭。因此需要使用分子生物学的方法对天然内溶素进行设计改造，增强内溶素的裂解活性和宿主谱，使其成为优良的抗菌试剂。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素。
7.本发明的另一目的在于提供一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的制备方法。
8.本发明的再一目的在于提供所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的应用。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.编码所述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.一种重组表达载体，含有编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因，即通过将编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因克隆进入表达载体获得。
13.所述的表达载体为pet系列载体；优选为pet-9a、pet-28a(+)、pet-22b(+)、pet-26b(+)或pet-31b(+)载体；进一步优选为pet28a(+)载体。
14.所述的将编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因克隆进入表达载体优选通过酶切位点hindⅲ和sali插入pet28a(+)中。
15.一种重组表达菌株，含有上述重组表达载体，即通过将上述重组表达载体转入宿主菌株获得。
16.所述的宿主菌株为细菌、酵母或真菌；优选为细菌；进一步优选为大肠杆菌(escherichia coli)；最优选为大肠杆菌bl21(de3)。
17.一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素(蛋白)的制备方法，包括如下步骤：
18.(1)将编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因克隆进入表达载体，得到重组表达载体；
19.(2)将重组表达载体转入宿主菌株，得到重组表达菌株；
20.(3)将重组表达菌株先进行培养，再诱导表达，离心收集菌液，分离纯化，得到抗大肠杆菌的噬菌体内溶素。
21.步骤(1)中所述的表达载体为pet系列载体；优选为pet-3a、pet-9a、pet-28a(+)、pet-22b(+)、pet-26b(+)或pet-31b(+)载体；进一步优选为pet28a(+)载体。
22.步骤(2)中所述的宿主菌株为细菌、酵母或真菌；优选为细菌；进一步优选为大肠杆菌(escherichia coli)；最优选为大肠杆菌bl21(de3)。
23.步骤(3)中所述的培养的条件为：37℃、200rpm培养至菌液od600为0.6～0.8(优选为od600＝0.8)。
24.步骤(3)中所述的诱导表达的诱导剂优选为iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)。
25.所述的iptg的用量为按其在诱导体系的终浓度为0.1mmol/l添加计算。
26.步骤(3)中所述的诱导表达的条件优选为：37℃诱导4h以上。
27.步骤(3)中所述的离心的条件优选为：8000rpm离心10min。
28.步骤(3)中所述的分离纯化优选为采用镍柱亲和层析法进行分离纯化。
29.所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素在制备抑菌剂(抗菌剂)中的应用。
30.所述的抑菌剂中的菌为革兰氏阴性菌；优选为大肠杆菌；进一步优选为致病性大肠杆菌。
31.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
32.(1)鉴于大肠杆菌血清型的多样性及各个血清型之间的交叉免疫性差，疫苗难于发挥作用，另有抗生素的滥用导致细菌的耐药株的出现，可通过噬菌体疗法裂解宿主细菌，本发明通过基因工程的方法，将目的基因即编码抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白的基因构建到表达载体(优选pet-28a(+))上，对质粒进行信号肽的删除及其他修饰处理，确保转化和蛋白表达的顺利进行，然后将重组表达载体转入宿主菌株诱导表达获得噬菌体内溶素蛋
白，该噬菌体内溶素蛋白对大肠杆菌具有一定杀菌作用。
33.(2)本发明所构建的带有目的基因的质粒，通过原核表达获得大量目的蛋白，利于将该噬菌体内溶素应用于生产和实践当中，有效地控制大肠杆菌病，保障公共卫生的安全。
34.(3)本发明提供的可溶性抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白的生产方法操作简单、蛋白纯度较高，具有良好的稳定性和生物学活性，对大肠杆菌的监测具有重大意义。
35.(4)为全面、准确地掌握噬菌体内溶素对于大肠杆菌的杀菌程度，本发明在ph＝6的环境下对该噬菌体内溶素的杀菌效果进行监控，检测其杀菌性能，结果显示该噬菌体内溶素蛋白对大肠杆菌具有一定的抗菌活性。
附图说明
36.图1是抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白重组表达载体的图。
37.图2是将实施例2中保存的表达抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的质粒转化至受体大肠杆菌bl21(de3)内的pcr验证结果图(图中，泳道1为yeasen 2000marker；泳道2为目的基因扩增片段；泳道3为阴对照)。
38.图3是sds-page电泳检测蛋白纯化结果分析结果图(图中，泳道1为smobio pm2510 marker；泳道2为诱导剂iptg 0.1mmol/l、37℃诱导4h的蛋白纯化结果)。
39.图4是在ph＝6的条件下噬菌体内溶素蛋白活性的检测结果图(图中，纵坐标为第4孔液体滴板的活菌数，第一个柱状图表示滴加pbs的空白对照组(pbs)，第二个柱状图表示滴加抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白的实验组(cjlysin))。
具体实施方式
40.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
41.实施例1抗大肠杆菌噬菌体内溶素cjlysin in pet-28a(+)的构建
42.根据抗大肠杆菌噬菌体内溶素的基因序列(ncbi登录号：erj25909.1)，通过基因合成对融合基因(基因序列如seq id no.2所示，其编码蛋白如seq id no.1所示)两端分别加上hindⅲ和sali酶切位点，与进行hindⅲ和sali双酶切的pet-28a(+)载体相连，命名为cjlysin in pet-28a(+)，得到的连接片段核苷酸序列由上海通用生物公司合成，经测序正确后，获得大小为6041bp的融合基因。
43.噬菌体内溶素氨基酸序列(seq id no.1)：
44.mnnfinsfnesksitrvdkgmwvdgdkgvgvkadgdirilrirafmcaikygegtsgnngyeinvggklftkdygkdfsdhpryyvksldssaagayqiksstwdmilkkykktyditdfspanqdkaclvlikhirnaldlivdekideavrsrtdndkkrlhyewasmpdspygqrtitmekfmeyymhhleleeigisnlaisnkdikkflngshhhhhh*；
45.噬菌体内溶素基因序列(seq id no.2)：
46.atgaacaactttattaactcttttaacgaatccaaatctatcacacgggtggataaaggcatgtgggtcgatggtgacaaaggtgttggggtgaaggccgatggcgacatccgtattctgcgtattcgggcgttcatgtgcgca
atcaaatatggggagggcactagcggcaacaacggttacgaaatcaacgtgggcgggaaattatttaccaaagactatggtaaggatttttctgatcacccacggtattacgtcaaaagtctcgactcctcagcagctggtgcataccagattaaaagttccacatgggacatgattctgaagaagtataagaaaacttacgatattaccgatttctcaccagcaaaccaggataaggcttgccttgtgctgattaaacacattcgtaatgcacttgacctgatcgtggacgagaagattgatgaagccgtccggtctcgtaccgataatgataagaaacgcctgcactacgaatgggcgtcaatgccagactctccatatgggcaacgtactattactatggagaagtttatggaatactacatgcatcatttggagctcgaagagattggtatctcgaacctggccatctccaataaagacatcaaaaaattcctcaatggttctcatcatcatcaccatcattaa。
47.实施例2质粒抽提，双酶切确认质粒并送测序
48.将实施例1得到的抗大肠杆菌噬菌体内溶素cjlysin in pet-28a(+)的合成质粒(图1)转化至受体菌dh5α，菌液涂含卡那霉素的lb(含50mg/l的卡那霉素(kan))板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落重新转接涂板；将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100ml的液体lb培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌16h，先将部分菌液暂时分装放4℃保存；再取一部分菌液使用50ml离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清，进行质粒抽提，并对质粒做hindⅲ和sali双酶切，跑核酸电泳确认酶切片段大小，并将大小为650bp左右的目的条带的克隆质粒进一步测序，将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽取质粒保存至-20℃冰箱，将菌液用含有15％～20％(v/v)甘油的lb溶液放置-80℃进行保种。
49.实施例3抗大肠杆菌噬菌体内溶素蛋白的诱导表达
50.(1)将上述实施例2中保存的表达抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的质粒转化至受体大肠杆菌bl21(de3)上，冰上放置30min后，42℃水浴锅中热击90s后加入1ml lb肉汤培养基，在37℃，220rpm的摇床上复苏活化之后，6000rpm离心1min，弃去90％的上清后将菌液涂含卡那霉素的lb(含30mg/l的卡那霉素(kan))板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落利用t7引物(正向引物t7-f和反向引物t7-r)进行菌落pcr确认，如图2所示。将大小为650bp左右的目的条带的克隆菌落重新转接涂板，并保存；其中，t7引物序列如下所示：
51.正向引物(t7-f)：5
’‑
taatacgactcactatagg-3’；
52.反向引物(t7-r)：5
’‑
tgctagttattgctcagcgg-3’。
53.pcr反应体系和条件如下所示：
54.扩增体系：pcr master mix酶25μl，正向引物(10pmol/μl)1μl，反向引物(10pmol/μl)1μl，基因模板2μl，ddh2o补足至50μl。
55.扩增反应条件：98℃3min；98℃15s、58℃15s、72℃60s，40个循环；72℃5min。
56.pcr反应完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳显示大小为650bp左右的目的条带。
57.(2)将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100ml的液体lb培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌；待菌液od600值为0.6时，用iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)进行诱导，iptg的终浓度为0.1mmol/l；诱导4h后将菌液使用50ml离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清；
58.(3)用无咪唑的蛋白裂解液lysis buffer(nah2po4·
h2o(mw 137.99g/mol)6.9g，即0.05mol/l，nacl(mw 58.44g/mol)17.54g即0.3mol/l，加入约900ml去离子水，搅拌溶解后，加入naoh调节溶液ph值至8.0，加入去离子水定容至1000ml)，取约30ml将保存的菌液重悬，使用超声破碎仪进行破碎，超声程序为破碎3s，间隔5s，超声破碎30min；
59.(4)将超声破碎后的产物8000rpm离心15min，收集上清，取少量的上清加入4
×
sds上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，若加热后的样品有粘性产物，将样品进行瞬时离心后，取上清上样于购自金斯瑞的sds-page胶孔，同时加入等量的蛋白smobio pm2510 maker，以电泳电压调节至100v跑胶，跑胶100min。将凝胶块从玻璃板中取出，轻放于摇床上含有考马斯亮蓝溶液的染色槽30min；然后将染色槽的考马斯亮蓝溶液倒出，加入清水冲洗干净后，凝胶块放于摇床中的染色槽中，用清水对凝胶块进行脱色30min即可见清洗条带，抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白可溶性表达表达成功。
60.实施例4抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白的纯化
61.蛋白纯化：将表达的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白采用biosciences公司中镍柱亲和层析蛋白纯化原核表达的方法进行纯化目的蛋白，纯化步骤如下：
62.(1)平衡：取1ml镍填料加入纯化蛋白专用柱子中，加入10ml提前配好的lysis buffer(lysis buffer缓冲液的配方为：nah2po4·
h2o(mw 137.99g/mol)6.9g，nacl(mw 58.44g/mol)17.54g，0.68g咪唑(mw 68.08g/mol)加入约900ml去离子水，搅拌溶解后，加入naoh调节溶液ph值至8.0，加入去离子水定容至1000ml)进行平衡填料，重复3～5次。
63.(2)上样：在平衡过的柱子加入已超声破碎的裂解菌液，分批次加入，直至样品完全过柱。
64.(3)洗涤：往柱子中加入已配好的wash buffer(6.9g nah2po4·
h2o(mw 137.99g/mol)，nacl(mw 58.44g/mol)17.54g，1.36g咪唑(mw 68.08g/mol)加入约900ml去离子水，搅拌溶解后，加入naoh调节溶液ph值至8.0，加入去离子水定容至1000ml)清洗柱子，清洗两次，每次5ml。
65.(4)洗脱：在洗涤结束后，加入elution buffer(elution buffer缓冲液：nah2po4·
h2o(mw 137.99g/mol)6.9g，nacl(mw 58.44g/mol)17.54g，17.00g咪唑(mw 68.08g/mol)加入约900ml去离子水，搅拌溶解后，加入naoh调节溶液ph值至8.0，加入去离子水定容至1000ml)将蛋白洗脱下来，每次400μl，清洗6次。
66.(5)收集：每次洗脱均用不同的灭菌1.5ml的ep管进行标记、保存。
67.(6)样品处理：将洗脱下来的每管分别吸取10μl的样品进行sds-page鉴定(图3)。
68.(7)保存：根据sds-page结果，将目的蛋白纯度较高的样品，加入20％(v/v)的甘油进行保存。
69.(8)bca蛋白定量：将蛋白加入20％(v/v)的甘油进行保存，使用bca定量检测试剂盒检测其蛋白浓度(2.6695mg/ml)。将测过浓度的蛋白进行分装，置于-20℃保存。
70.实施例5抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白活性的检测
71.在ph＝6的条件下，对噬菌体内溶素蛋白的活性进行检测，具体步骤如下：
72.(1)将大肠杆菌株bl21(de3)转接到lb固体培养基上，37℃培养过夜。
73.(2)挑取步骤(1)中部分菌落到lb液体培养基，在37℃200rpm摇床上培养到od600＝1。
74.(3)取步骤(2)中的菌液10μl，用无菌pbs缓冲液(ph＝6)，在96孔板上倍比稀释104倍。即1-4孔加入90μl无菌pbs缓冲液(ph＝6)，取10μl步骤(2)中的菌液加入第1孔，反复吹打5次，再取10μl第1孔液体加入第2孔，反复吹打5次，依次这样直至加到第4孔。
75.(4)取95μl步骤(3)中的第4孔液体加到空白孔中，再加5μl实施例4中纯化并过滤
除菌后得到的蛋白(空白组加5μl ph＝6的无菌pbs缓冲液)，吹打混匀5次，盖上盖子，放于37℃培养箱孵育16h。
76.(5)孵育结束后，分别将空白组和实验组的液体全部取出，滴于lb培养基上，通过转动培养基，使液体均匀布满培养基，待液体晾干后，放于37℃培养箱倒置培养过夜，第二日通过计数菌落数，判断蛋白是否具有抗菌活性，三次重复，结果如图4所示。
77.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。