猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用

猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)感染猪引起的猪的临床表现为腹泻、呕吐、食欲不振甚至导致猪死亡的一种传染性肠道疾病。不同年龄的猪感染pedv以后，临床表现严重程度不同，感染后的7日龄以内的新生仔猪的死亡率高达100％。ped在全球多个国家均有爆发，给全世界养猪产业造成严重的经济损失。疫苗接种通常被认为是一种预防病毒性疾病的有效方法，但是由于pedv的变异速度快，商业化疫苗在临床中的预防效果并不理想。直接给机体输入特异靶向致病原或致病原组成蛋白的抗体的被动免疫是一种有效方法。n蛋白是pedv的结构蛋白之一，它除了参与病毒粒子的构成，还能够调控病毒的复制和翻译等，受到越来越多的关注。
3.单链抗体是基因工程抗体中的一种，通过一段柔性短肽linker将抗体的重链可变区vh和轻链可变区vl连接而成，分子量小，免疫原性低，组织渗透性好，在疾病的检测和治疗中，显示了巨大的应用潜力，已有越来越多的单链抗体被应用到临床中。


技术实现要素：

4.本发明提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用。
5.本发明提供的真核表达单链抗体能够与猪流行性腹泻病毒n蛋白特异性结合，可降低猪流行性腹泻病毒在猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell line j2，ipec-j2)内的滴度，能够用于抑制猪流行性腹泻感染的研究。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.本发明首先提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体，其具有如seq id no.1所示的猪源抗体的重链可变区vh的氨基酸序列、如seq id no.2所示的猪源抗体的轻链可变区vl的氨基酸序列和中间连接肽linker的氨基酸序列ggggsggggsggggs，组成顺序为vh-linker-vl的猪源单链抗体片段。
8.在本发明的一个实施方式中，猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体，记为zw1-7，具有如seq id no.3所示的氨基酸序列。
9.本发明还提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体的编码基因，具有如seq id no.4所示的核苷酸序列。
10.在本发明的一个实施方式中，编码基因的核苷酸序列中进一步包含限制性内切酶位点xhoi和noti，其中酶切位点xhoi的核苷酸序列如seq id no.5所示，酶切位点noti的核
苷酸序列如seq id no.6所示。
11.本发明还提供一种含有猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体的载体。
12.在本发明的一个实施方式中，所述载体为真核表达质粒。
13.在本发明的一个实施方式中，所述载体为pcmv-ha-zw1-7真核表达质粒。
14.本发明还提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)从重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白免疫猪脾脏组织中提取rna，通过反转录获得cdna，采用rt-pcr法扩增出抗体编码基因的重链可变区vh基因片段和轻链可变区vl基因片段；
16.(2)利用soe-pcr法将步骤(1)得到的vh基因片段、中间连接肽linker和步骤(1)得到的vl基因片段相连构建猪源性单链抗体基因scfv；
17.(3)将步骤(2)获得的猪源性单链抗体基因scfv克隆到原核表达载体pope101-xp中，构建重组原核表达质粒pope101-xp-scfv；
18.(4)将步骤(3)的重组原核表达质粒pope101-xp-scfv转化入e.coli jm109化学感受态细胞，经过多次转化，获得猪源性单链抗体库；
19.(5)从步骤(4)获得的猪源性单链抗体库中随机挑取单克隆，制备周质空间蛋白，以重组的猪流行性腹泻病毒n蛋白作为抗原进行elisa筛选，有阳性反应的阳性克隆即含有抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体。
20.本发明还提供所述猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体在制备防治猪流行性腹泻病的药物中的用途。所述猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体具有抑制猪流行性腹泻病毒感染的作用。
21.在本发明的一个实施方式中，所述防治猪流行性腹泻病的药物为口服制剂。
22.本发明还提供所述猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体在防治猪流行性腹泻病中的用途。
23.本发明的技术原理是采用rt-pcr直接从重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白免疫的猪脾脏组织rna中扩增出抗体编码基因的重链可变区vh基因和轻链可变区vl基因。利用soe-pcr法将获得的vh基因片段、中间连接肽linker和vl基因片段拼接构建猪源性单链抗体编码基因scfv，拼接顺序为vh-linker-vl，将获得的猪源性单链抗体编码基因克隆到原核表达载体pope101-xp中，构建重组质粒pope101-xp-scfv，多次转化e.coli jm109化学感受态细胞构建猪源性单链抗体库。以重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白为抗原，经间接elisa筛选阳性克隆，证明该单链抗体具有特异结合猪流行性腹泻病毒n蛋白的能力，并经过dna测序证明该单链抗体编码基因的序列正确。
24.本发明的独特之处，首先是以重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白免疫的猪脾脏组织的cdna为模板扩增抗体编码基因，一般的文献报道都是以重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白免疫的小鼠的cdna为模板，鼠源性的抗体用于猪时具有较强的免疫原性，而猪源性的单链抗体避免了这个问题；其次本发明将筛选到的阳性克隆的单链抗体zw1-7的编码基因重组到真核表达质粒pcmv-ha中，构建重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7；将该重组真核表达质粒转染ipec-j2细胞，该单链抗体在ipec-j2细胞内成功表达，分子量大小约为
28kda；在猪流行性腹泻病毒感染的细胞中，该单链抗体显著降低猪流行性腹泻病毒的滴度(p《0.05)；具有一定的抵抗猪流行性腹泻病毒感染的作用，能够用于猪流性腹泻病的预防和治疗。
25.本发明的有益效果是：猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体zw1-7的编码基因可与猪流行性腹泻病毒n蛋白特异性结合，将重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7通过转染进入ipec-j2细胞，zw1-7在ipec-j2细胞内成功表达，显著降低猪流行性腹泻病毒的滴度，能够用于猪流性腹泻病的预防和治疗。
附图说明
26.图1为单链抗体zw1-7基因pcr电泳图；m为2000bp dnaladder marker；1为zw1-7基因pcr产物；
27.图2为间接elisa筛选到的zw1-7与重组的猪流行性腹泻病毒n蛋白反应结果图示，注：nc为阴性对照，zw1-7为筛选获得的阳性克隆；
28.图3为重组真核表达载体pcmv-ha-zw1-7的质粒图谱；
29.图4为pcmv-ha质粒的电泳图；图中：m为5000bp dna ladder marker；1为pcmv-ha质粒；
30.图5为western blotting分析pcmv-ha-zw1-7在ipec-j2细胞中的表达图示；注：m为蛋白质预染marker；1为转染pcmv-ha-zw1-7的细胞裂解液。
31.图6为分析单链抗体zw1-7对猪流行性腹泻病毒滴度的抑制效果图；图中：zw1-7+pedv为转染pcmv-ha-zw1-7以后24h，感染pedv病毒组；vector+pedv为转染pcmv-ha以后24h，感染pedv病毒组；pedv为只感染病毒组；分别于感染病毒后24h、48h或72h收集病毒液，检测病毒滴度；图中数据均以平均值
±
标准误表示(n＝3)；*p《0.05，**p《0.01。
具体实施方式
32.实施例中使用的实验试剂和材料均为正规公司的标准实验试剂和材料，所用方法均按照标准试剂盒说明书实施，获得的产品均经过多次试验证明可以重复获得，生物学性质稳定。说明本发明各试验步骤所获得的产品均可按照本发明所陈述的方法获得。
33.实施例1猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单链抗体库的构建
34.1、用重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白免疫猪，通过间接elisa法检测血清抗体效价达到1:64000时，采取免疫猪的脾脏组织，用trizol(trizol试剂购自invitrogen公司)提取组织中的总rna。以总rna为模版，采用oligo primer，根据反转录试剂盒(反转录cdna合成试剂盒购自takara公司)的说明操作步骤，合成cdna。
35.2、分析已发表文献中的猪抗体编码基因的可变区序列，根据序列设计扩增抗体重链可变区和轻链可变区的引物(见表1)，其中vh-b和vh-f用于扩增vh区；vlκ-b1、vlκ-b2、vlκ-b3和vlκ-f用于扩增vlκ区；vlλ-b和vlλ-f用于扩增vlλ区；overlap-b1和overlap-f1、overlap-b2和overlap-f2、overlap-b3和overlap-f3、overlap-λ-b和overlap-λ-f用于合成延伸中间连接肽linker序列，该序列的n端和c端分别与vh和vl有20bp左右的重叠；vh-b-ncoi在vh的基础上加入酶切位点ncoi，vlκ-f-noti和vlλ-f-noti分别在vlκ-f和vlλ-f的基础上加入酶切位点noti(酶切位点和linker序列在表1中分别用下划线和加粗字体标示
出)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
36.表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
[0037][0038][0039]
注：下划线代表nco i或not i酶切位点，加粗代表中间连接肽序列。
[0040]
3、vh和vl基因的扩增以cdna为模版，vh-b和vh-f用于扩增vh基因；vlκ-b1、vlκ-b2、vlκ-b3和vlκ-f用于扩增vlκ基因；vlλ-b和vlλ-f用于扩增vlλ基因。pcr反应体系为25μl：2
×
pcr mix 12.5μl，模版cdna 2μl，上下游引物(25μm)各1μl，ddh2o 8.5μl。扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸
10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据thermo公司提供的胶回收说明书操作)。
[0041]
4、scfv基因的获得：overlap-b1和overlap-f1、overlap-b2和overlap-f2、overlap-b3和overlap-f3、overlap-λ-b和overlap-λ-f用于合成n端和c端分别与vh和vl有20bp左右重叠的延伸中间连接肽linker序列；然后以vlκ基因和延伸linker片段为模板，overlap-bprimer和vlκ-f为引物扩增linker-vlκ目的片段；以vlλ基因和延伸linker片段为模板，overlap-bprimer和vlλ-f为引物扩增linker-vlλ目的片段。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的片段。以vh基因和linker-vlκ片段或vh基因和linker-vlλ片段为模板，vh-b-ncoi和vlκ-f-noti或vlλ-f-noti为引物通过重组链延伸反应(soe-pcr)将vh和vl基因通过linker序列连接为scfv基因，并加入ncoi和noti酶切位点。
[0042]
5、猪源性scfv单链抗体原始文库的构建根据常规分子克隆方法(参照j.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，scfv基因和pope101-xp载体分别经ncoi和noti双酶切后，琼脂糖凝胶电泳并用凝胶回收试剂盒回收酶切产物。将scfv基因插入pope101-xp载体，构建重组表达质粒，并将其转化e.coli jm109化学感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，经过多次转化，构建猪源性单链抗体原始库。从库中取一定量的菌液进行10倍梯度稀释后涂布2yt-a固体培养平板，计算库容量；随机挑取单克隆，通过菌落pcr计算其阳性率，菌落pcr验证正确的克隆进行bstni单酶切和dna测序分析来确定文库的多样性。
[0043]
实施例2猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单链抗体的间接elisa筛选
[0044]
将纯化的重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白在96孔板中4℃包被过夜；96孔板中用含4％bsa的封闭液37℃封闭2h；pbst缓冲液洗3次，向96孔板的每孔加入提取的菌落的周质腔蛋白，37℃反应2h；pbst缓冲液洗3次，加anti-myctag鼠源单克隆抗体100μl(1:3000稀释)，37℃反应2h；pbst缓冲液洗3次，加hrp标记的羊抗鼠igg(h+l)100μl(1:6000稀释)，37℃反应1h；pbst缓冲液洗3次，加tmb显色液，避光15min；加2mol/l硫酸终止反应，酶标仪读取od450值。设空质粒提取的周质腔蛋白为阴性对照组。以p/n(p为阳性孔的od450值，n为阴性孔的od450值)表示，p/n≥2.1为阳性；1.5≤p/n＜2.1为可疑；p/n＜1.5为阴性，如图2所示。(参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》)。
[0045]
实施例3重组scfv序列分析
[0046]
对获得的阳性克隆的单链抗体zw1-7编码基因进行dna测序，证明其由735个核苷酸及据此推测的245个氨基酸组成，所述核苷酸序列如seq id no.4所示，所述氨基酸序列如seq id no.3所示，pcr扩增结果如图1所示。
[0047]
实施例4重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7的转染
[0048]
1、无内毒素质粒的提取
[0049]
采用omega bio-tek公司的无内毒素质粒小量提取试剂盒，详细操作步骤为：将含有目的质粒的克隆接种于含有相应抗生素的液体培养基中，37℃培养过夜；5,000
×
g离心8min，弃掉上清；加500μl solution i/rnase a重悬菌体转移至离心管中；向离心管中加500μl solution ii，温和颠倒离心管，室温放置3min；加250μl预冷的n3 buffer，温和颠倒离心管，至有白色絮状物形成；13,000
×
g离心10min，将上清转移到新的离心管中；向离心管中加入0.1倍体积的etr solution，温和颠倒混匀，冰上静置10min；42℃孵育5min，混合液又变浑浊；12,000
×
g离心3min，混合液分层，将上层转移到新的离心管中，向离心管中加
0.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀，静置2min；将dna结合柱放于收集管上，转移混合液至结合柱中，10,000
×
g离心1min，弃掉废液，直到所有混合液都滤过结合柱；向柱中加500μl的hbc buffer，13,000
×
g离心1min，弃掉废液；向柱中加700μl的dna wash buffer，13,000
×
g离心1min，弃掉废液，用dna wash buffer再洗一遍；空柱子13,000
×
g离心2min；把结合柱放于新的离心管上，向柱基质上加60-100μl灭菌去离子水，静置1-2min，13,000
×
g离心1min；将离心得到的dna溶液重新加到柱子上，静置1-2min，13,000
×
g离心1min，收集管中的dna溶液，即为质粒；放于-20℃保存备用。
[0050]
2、重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7的构建和测序验证
[0051]
重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7的质粒图谱如图3所示，将zw1-7和pcmv-ha用xhoi和noti双酶切，线性化的pcmv-ha电泳结果如图4所示，将回收后的片段用t4连接酶进行连接，转化dh5α，挑取单菌落，经过菌液pcr鉴定阳性克隆，提取质粒；将获得的pcmv-ha-zw1-7进行dna测序验证，测序结果表明zw1-7序列与seq id no.4所示序列一致，证明重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7构建成功。dna测序公司为铂尚生物技术(上海)有限公司。
[0052]
3、重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7转染细胞
[0053]
将ipec-j2细胞培养至80％-90％融合度，按照1:3的比例接种至6孔板中，待孔中细胞生长至80％融合度，进行质粒转染，试剂为lipofectamine 3000 transfection reagent，具体操作步骤为：取两个离心管，各加入125μl opti-mem i培养基；吸取5μl lipofectamine 3000试剂加到一份125μl opti-mem i培养基中，温和混匀，将5μl p3000试剂和2.5μg无内毒素的重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7加到另一份125μl opti-mem i培养基中，温和混匀；静置5min；将质粒和p3000试剂全部加到lipofectamine 3000试剂中，温和混匀；静置孵育20min；将6孔板中的培养液吸出，pbs清洗1次，然后每孔加2.25ml的opti-mem i培养基；将静置后的混合液轻轻滴入孔内，将6孔板放于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。
[0054]
实施例5western blotting检测重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7的转染效果
[0055]
重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7转染细胞48h后，pbs清洗1次，加250μl的ripa裂解液(含1mm pmsf)裂解细胞，收集裂解液；4℃，13,000rpm离心5min，将上清转移至离心管中，放于-20℃保存。通过western blotting检测单链抗体在细胞内的表达。详细操作步骤为：
[0056]
(1)制作分离胶和浓缩胶；
[0057]
(2)每孔上样10μl；
[0058]
(3)电泳：样品在浓缩胶中电泳时，电压为80v，进入分离胶中电泳后，电压为120v；
[0059]
(4)转膜：取出胶板，切掉浓缩胶，量剩余胶块的尺寸，剪相同大小的nc膜，将胶和膜放入转膜液中浸湿，从下到上的摆放顺序为：黑色夹板、滤纸、胶、nc膜、滤纸、白色夹板，将夹板放入电泳槽中，恒流转膜；
[0060]
(5)封闭：将nc膜放入5％脱脂奶粉封闭液中，室温封闭1h；
[0061]
(6)tbst缓冲液洗3次，5min/次；
[0062]
(7)一抗孵育：将nc膜用anti-ha鼠源单克隆抗体(用5％脱脂奶粉按1:4000稀释)孵育，4℃过夜；
[0063]
(8)tbst缓冲液洗3次，5min/次；
[0064]
(9)二抗孵育：将nc膜用hrp标记的山羊抗小鼠igg(h+l)(用5％脱脂奶粉按1:5000稀释)孵育，室温1h；
[0065]
(10)tbst缓冲液洗3次，5min/次；
[0066]
(11)显影：将化学发光试剂盒中的a液和b液等体积混匀，均匀滴在nc膜上，避光2min，然后将膜放于tanon 5200全自动化学发光系统的平板上，采集图像。结果显示重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7转染成功，单链抗体在ipec-j2细胞中成功表达，如图5所示。
[0067]
实施例6抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体zw1-7对猪流行性腹泻病毒滴度的影响
[0068]
将ipec-j2细胞按照1:3的比例接种至24孔板，重组真核表达质粒pcmv-ha-zw1-7或空质粒pcmv-ha转染细胞24h后，感染猪流行性腹泻病毒(moi＝0.01)，分别于感染24h、48h和72h后，检测猪流行性腹泻病毒的滴度。转染空质粒pcmv-ha的组为阴性对照组，不转染质粒的组为空白对照组。详细操作步骤为：将处理后的24孔板置于-80℃；反复冻融3次，收集病毒上清液。将待测病毒进行10倍梯度稀释，每个稀释度做8个重复孔，每孔100μl，将稀释后的病毒液依次接种到提前一天培养的96孔细胞培养板的第1到10列中，最后两列为阴性对照；将细胞培养板置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养1h-1.5h，添加100μl dmem培养基；将细胞培养板置于37℃、5％co2的细胞培养箱中继续培养，每天观察细胞状态，查看细胞病变效应并记录出现细胞病变效应的孔数，直到出现细胞病变效应的孔数不再增加，根据reed-muench法计算病毒滴度。结果显示在感染48h和72h后，抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的真核表达单链抗体zw1-7显著降低猪流行性腹泻病毒的滴度(p《0.05)，如图6所示。
[0069]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。