表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单链抗体的重组腺病毒及其构建和用途

表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组腺病毒及其构建和用途
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组腺病毒及其构建和用途。


背景技术：

2.猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)感染猪引起猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)，导致猪腹泻、脱水、食欲不振、甚至导致猪死亡。各年龄段的猪都会被感染，年龄越小的猪，临床表现越严重。疫苗接种是预防该病的方法之一，但是由于病毒毒株变异速度快，目前研制的疫苗的预防效果并不理想。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的上述不足，本发明提供一种表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组腺病毒及其构建和用途。
4.本发明提供的重组腺病毒表达的单链抗体zw4-36能够与猪流行性腹泻病毒n蛋白特异性结合，减弱猪流行性腹泻病毒对仔猪空肠组织的感染，显著降低仔猪粪便中的病毒粒子含量(p《0.05)，对猪流行性腹泻病毒感染仔猪具有有效的保护作用。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.本发明首先提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体，其具有如seq id no.1所示的猪源抗体的重链可变区vh的氨基酸序列、如seq id no.2所示的猪源抗体的轻链可变区vl的氨基酸序列和中间连接肽linker的氨基酸序列ggggsggggsggggs，组成顺序为vh-linker-vl的猪源单链抗体片段。
7.在本发明的一个实施方式中，猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体，记为单链抗体zw4-36，具有如seq id no.3所示的氨基酸序列。
8.本发明还提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的编码基因，具有如seq id no.4所示的核苷酸序列。
9.本发明还提供一种含有猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组质粒。
10.本发明还提供一种表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组腺病毒，其至少具有如seq id no.1所示的猪源抗体的重链可变区vh的氨基酸序列、如seq id no.2所示的猪源抗体的轻链可变区vl的氨基酸序列和中间连接肽linker的氨基酸序列ggggsggggsggggs，组成顺序为vh-linker-vl的猪源单链抗体片段。
11.本发明还提供一种表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)在单链抗体zw4-36的5’端添加sali酶切位点，3’端添加hindiii酶切位点，sali酶切位点序列为gtcgac，hindiii酶切位点序列为aagctt，单链抗体zw4-36具有如seq id no.3所示的氨基酸序列；
13.(2)将单链抗体zw4-36构建入穿梭质粒padtrack-cmv中，获得重组穿梭质粒padtrack-zw4-36；
14.(3)用pmei酶将重组穿梭质粒padtrack-zw4-36进行单酶切，回收线性化的质粒片段，转化含padeasy-1的bj5183感受态细胞，进行同源重组；
15.(4)37℃倒置培养24h，挑单菌落，提取质粒，进行pcr和dna测序鉴定，完全正确的重组质粒命名为padeasy-zw4-36；
16.(5)用paci酶将重组质粒padeasy-zw4-36进行单酶切，回收目的质粒片段，用lipofectamine 3000 transfection reagent转染293细胞，至细胞出现明显的病变效应和荧光团，收集病毒液，将其命名为radv-zw4-36。
17.在本发明的一个实施方式中，所述同源重组指：在bj5183感受态细胞中，线性化的padtrack-zw4-36和padeasy-1可以形成一个重组腺病毒质粒padeasy-zw4-36。
18.在本发明的一个实施方式中，所述细胞出现明显的病变效应是指病毒感染细胞以后导致细胞变圆、坏死和从培养瓶瓶壁脱落的现象。
19.在本发明的一个实施方式中，所述腺病毒为复制缺陷型腺病毒。
20.本发明还提供所述表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组腺病毒在制备防治猪流行性腹泻病的药物中的用途。
21.在本发明的一个实施方式中，所述防治猪流行性腹泻病的药物为口服制剂。
22.在本发明的一个实施方式中，所述防治猪流行性腹泻病的药物中，说明书记载说明书内容为：
23.以表达单链抗体zw4-36的重组腺病毒radv-zw4-36的用量计，仔猪隔两天口服2ml浓度为10
10
tcid50的表达单链抗体zw4-36的重组腺病毒radv-zw4-36。
24.本发明还提供所述表达猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体的重组腺病毒在防治猪流行性腹泻病中的用途。
25.本发明的技术原理是将猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体zw4-36构建到穿梭质粒padtrack-cmv中，获得重组穿梭质粒padtrack-zw4-36；将padtrack-zw4-36用pmei酶进行消化，转化含padeasy-1的bj5183感受态细胞；37℃倒置培养24h，挑单菌落，提取质粒，进行pcr和dna测序鉴定，完全正确的重组质粒命名为padeasy-zw4-36；然后将padeasy-zw4-36同paci酶进行消化，回收目的片段，用lipofectamine 3000transfection reagent转染293细胞，至细胞出现明显的病变效应和荧光团，收集病毒液，将其命名为radv-zw4-36。检测radv-zw4-36对猪流行性腹泻病毒感染仔猪的保护作用。
26.本发明的独特之处，首先是将猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体zw4-36以腺病毒为运载工具递送到猪小肠组织，解决了单链抗体如何进入小肠细胞的难题和快速排出的缺点；其次是由于腺病毒能转导多种细胞、且转导效率高、基因组不整合到宿主细胞中，可通过口服或肌肉注射等方式给到机体内，本发明让仔猪通过口服的方式摄入2ml浓度为10
10
tcid
50
的radv-zw4-36，然后给仔猪攻毒，每头猪5
×
105tcid
50
pedv，检测该单链抗体的分子量大小约为28kda；通过观察仔猪临床症状和检测粪便中病毒滴度评价radv-zw4-36的保护效果，重组腺病毒表达的猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白单链抗体zw4-36显著减少了病毒粒子含量，具有一定的抵抗猪流行性腹泻病毒感染的效果。
附图说明
27.图1为间接elisa筛选到的阳性克隆图；图中：nc为阴性对照；zw4-36为筛选获得的阳性克隆；
28.图2为重组穿梭质粒padtrack-zw4-36的质粒图谱；
29.图3为单链抗体zw4-36 pcr电泳图；图中：m为2000bp dna ladder marker；1、2和3均为zw4-36基因pcr产物；
30.图4为western blot分析radv-zw4-36的表达图；图中：m为蛋白质预染marker；1为感染radv-zw4-36的ipec-j2细胞裂解液；2为口服radv-zw4-36的猪小肠组织裂解液；
31.图5为仔猪空肠组织病理学观察图；图中：pedv对照组为感染pedv的仔猪空肠组织；radv-zw4-36处理组为提前两天口服radv-zw4-36然后感染pedv的仔猪空肠组织；pbs对照组为口服等量pbs的仔猪空肠组织；标尺＝200μm；
32.图6为仔猪攻毒后第3天收集粪便中的病毒粒子含量；图中：pedv对照组为感染pedv的仔猪粪便；radv-zw4-36处理组为提前两天口服radv-zw4-36然后感染pedv的仔猪粪便；pbs对照组为口服等量pbs的仔猪粪便；图中数据均以平均值
±
标准误表示(n＝3)；*p《0.05。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
34.实施例1
35.间接elisa检测猪源性抗猪流行性腹泻病毒n蛋白的单链抗体zw4-36与n蛋白的结合反应，具体为：将纯化的重组表达的猪流行性腹泻病毒n蛋白在96孔板中4℃包被过夜；次日每孔用200μl含4％bsa的封闭液37℃封闭1h；pbst洗3次，向96孔板的每孔加入提取的周质空间蛋白，37℃孵育2h；pbst洗3次，加100μl的anti-myc tag鼠源单克隆抗体(1:4000稀释)，37℃孵育2h；pbst洗3次，加100μl的hrp标记的山羊抗小鼠igg(h+l)(1:5000稀释)，37℃孵育1h；pbst洗3次，每孔加100μl的tmb显色液，避光15min；每孔加50μl的2mol/l硫酸终止反应，酶标仪读取od
450
值。以空质粒提取的周质空间蛋白为阴性对照组。以p/n(p为阳性孔的od
450
值，n为阴性孔的od
450
值)表示，p/n≥2.1为阳性；1.5≤p/n＜2.1为可疑；p/n＜1.5为阴性，zw4-36与n蛋白的结合反应检测结果如图1所示。根据(姚火春主编《兽医微生物学实验指导》)。
36.实施例2
37.zw4-36序列分析，具体为：对获得的阳性克隆的单链抗体编码基因zw4-36进行dna测序，证明其由750个核苷酸及据此推测的250个氨基酸组成，所述核苷酸序列如seq id no.4所示，所述氨基酸序列如seq id no.3所示。
38.实施例3
39.重组穿梭质粒padtrack-zw4-36的构建和重组腺病毒radv-zw4-36的包装，具体为：
40.1.重组穿梭质粒padtrack-zw4-36的构建：以trackzw4-36-bsali和trackzw4-36-fhindiii为引物，引物序列见表1，为了方便western blotting检测zw4-36的表达，所以在该基因的n端添加了ha标签，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通过pcr扩增
zw4-36，经过琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带单一，电泳结果如图3所示，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒将其进行回收。然后将zw4-36基因回收产物和穿梭质粒padtrack-cmv分别用sali和hindiii限制性内切酶进行酶切消化，将消化后的zw4-36片段和padtrack-cmv质粒片段用t4连接酶连接，然后转化dh5α，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落，经过菌液pcr鉴定阳性克隆，提取质粒；将获得的重组穿梭质粒padtrack-zw4-36进行dna测序验证，测序结果表明zw4-36的序列与seq id no.4所示序列一致，证明重组穿梭质粒padtrack-zw4-36构建成功，质粒图谱如图2所示。dna测序公司为铂尚生物技术(上海)有限公司。
41.表1扩增单链抗体zw4-36的引物及其扩增片段大小
[0042][0043]
注：带下划线的碱基序列表示酶切位点
[0044]
2.重组腺病毒radv-zw4-36的包装：首先制备含质粒padeasy-1的bj5183化学感受态细胞，将质粒padeasy-1转化至bj5183化学感受态细胞，涂布平板，37℃倒置培养24h，挑取单菌落，将阳性菌扩大培养，制备感受态细胞。然后用pmei酶将重组穿梭质粒padtrack-zw4-36进行酶切，回收线性化的质粒片段，转化含padeasy-1的bj5183感受态细胞，37℃倒置培养24h，挑单菌落，提取质粒，进行pcr和dna测序鉴定，重组质粒为padeasy-zw4-36；用paci酶将padeasy-zw4-36进行酶切，回收目的质粒片段，用lipofectamine 3000transfection reagent转染293细胞，转染试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。具体操作步骤为：将293细胞培养至80％-90％融合度，按照1:3的比例接种至6孔板中，待孔中细胞生长至80％融合度，进行质粒转染，试剂为lipofectamine 3000transfection reagent，具体操作步骤为：取两个离心管，各加入125μl opti-mem i培养基；吸取5μl lipofectamine 3000试剂加到一份125μl opti-mem i培养基中，温和混匀，将5μl p3000试剂和2.5μg无内毒素的padeasy-zw4-36加到另一份125μl opti-mem i培养基中，温和混匀；静置5min；将质粒和p3000试剂全部加到lipofectamine 3000试剂中，温和混匀；室温静置孵育20min；将6孔板中的培养液吸出，pbs清洗1次，然后每孔加2.25ml的opti-mem i培养基；将静置后的混合液轻轻滴入孔内，将6孔板放于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。直到细胞出现明显的病变效应和荧光团，收集病毒液，重组腺病毒为radv-zw4-36。
[0045]
实施例4
[0046]
通过western blotting检测重组腺病毒radv-zw4-36在ipec-j2细胞中和仔猪空肠组织中的表达：
[0047]
1.将ipec-j2细胞培养至80％-90％融合度，按照1:3的比例接种至6孔板中，待细胞生长至80％融合度左右，进行感染radv-zw4-36，48h后裂解细胞，收集裂解液，加蛋白上样buffer，沸水煮10min，于-20℃保存。
[0048]
2.购买3头仔猪，让仔猪通过口服的方式摄入2ml浓度为10
10
tcid
50
的radv-zw4-36，48h后采其空肠组织，加ripa裂解液进行裂解，加蛋白上样buffer，沸水煮10min，于-20
℃保存。
[0049]
通过western blotting检测单链抗体zw4-36在ipec-j2细胞和仔猪空肠组织中的表达，具体包括：
[0050]
(1)制作分离胶和浓缩胶；
[0051]
(2)每孔点样10μl；
[0052]
(3)电泳：样品在浓缩胶中电泳时，电压为80v，进入分离胶中后，电压为120v；
[0053]
(4)转膜：剪和胶相同大小的nc膜，放入转膜仪中恒流转膜；
[0054]
(5)封闭：5％脱脂奶粉封闭液室温封闭1h，tbst缓冲液洗3次，5min/次；
[0055]
(6)一抗孵育：将nc膜用anti-ha tag鼠源单克隆抗体(用5％脱脂奶粉按1:4000稀释)孵育，4℃过夜，tbst缓冲液洗3次，5min/次；
[0056]
(7)二抗孵育：将nc膜用hrp标记的山羊抗小鼠igg(h+l)(用5％脱脂奶粉按1:5000稀释)孵育，室温1h，tbst缓冲液洗3次，5min/次；
[0057]
(8)显影：用化学发光试剂盒检测目的蛋白，将膜放于tanon 5200全自动化学发光系统的平板上，采集图像。结果显示重组腺病毒radv-zw4-36在ipec-j2细胞中和仔猪空肠组织中成功表达，结果如图4所示。
[0058]
实施例5
[0059]
仔猪空肠组织的病理观察，具体为：购买9头仔猪，随机分为3组，每组3头，3组分别为radv-zw4-36处理组，pedv对照组和pbs对照组。radv-zw4-36处理组的每头仔猪通过口服的方式摄入2ml浓度为10
10
tcid
50
的radv-zw4-36，2天以后给仔猪攻毒，每头猪5
×
105tcid
50
pedv。pedv对照组的每头仔猪口服2ml的pbs，2天以后给仔猪攻毒，每头猪5
×
105tcid
50
pedv。pbs对照组的每头仔猪口服2ml的pbs，2天以后给仔猪口服与pedv等体积的pbs。
[0060]
攻毒后第7天处死仔猪，采空肠组织，进行甲醛固定，通过he染色检测空肠组织的病理变化，结果显示pedv对照组仔猪的空肠绒毛结构被严重破坏，绒毛萎缩、大量脱落；radv-zw4-36处理组和pbs对照组仔猪的空肠绒毛结构完整，绒毛完整、排列整齐，表明radv-zw4-36对pedv感染仔猪具有有效地保护作用，如图5所示。
[0061]
实施例6
[0062]
通过rt-qpcr检测仔猪粪便中的病毒粒子含量，具体为：
[0063]
仔猪的实验方案同实施例5，于攻毒后第3天采集所有仔猪的粪便，提取粪便中的rna，具体操作步骤为：
[0064]
(1)称100mg粪便和200mg珠子，放于离心管中；
[0065]
(2)加500μl的rpl，混匀；
[0066]
(3)加500μl的水饱和酚，混匀，65℃静置10min；
[0067]
(4)加500μl的氯仿，振荡混匀；
[0068]
(5)冰上5min；
[0069]
(6)12,000
×
g离心5min；
[0070]
(7)小心将上清转移到一个新的离心管中；
[0071]
(8)加500μl的rb和500μl的无水乙醇，混匀；
[0072]
(9)将吸附柱置于收集管中，转移(8)的混合液于吸附柱中，12,000
×
g离心30s，弃
滤液，重复此步骤，直到把(8)的混合液转移完；
[0073]
(10)将吸附柱置于新的收集管中，加500μl的rwc清洗液，12,000
×
g离心30s，弃滤液；
[0074]
(11)向吸附柱中加500μl的rwb清洗液，12,000
×
g离心30s，弃滤液；
[0075]
(12)重复上一步；
[0076]
(13)12,000
×
g离心2min；
[0077]
(14)向吸附柱膜中央加30μl rnase-free h2o，静置2min，10,000
×
g离心1min，收集rna，-80℃保存。
[0078]
根据反转录试剂盒(反转录cdna合成试剂盒购自takara公司)的产品说明操作步骤，合成cdna，以合成的cdna为模板，pedv-m-b和pedv-m-f为引物扩增猪流行性腹泻病毒m基因片段，引物序列见表2，检测猪流行性腹泻病毒的拷贝数，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0079]
表2扩增猪流行性腹泻病毒m基因部分片段的引物及其扩增片段大小
[0080][0081]
结果显示，pbs对照组仔猪粪便中没有pedv病毒；pedv对照组仔猪每克粪便中的病毒拷贝数几乎达到1
×
10
11
；radv-zw4-36处理组仔猪每克粪便中的病毒拷贝数仅为2.7
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106左右，相比于pedv对照组，radv-zw4-36处理组病毒拷贝数显著降低(p《0.05)；结果如图6所示。表明重组腺病毒radv-zw4-36表达的单链抗体zw4-36通过特异性结合猪流行性腹泻病毒n蛋白，显著抑制病毒在仔猪体内的复制，有效地抵抗了猪流行性腹泻病毒感染。
[0082]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。