一种体液免疫系统再生的方法及其应用

1.本发明属于医药生物工程技术领域，涉及多能干细胞的定向分化，尤其涉及一种体液免疫系统再生，即多能干细胞定向分化b细胞的方法及其应用。


背景技术：

2.b细胞是体液免疫系统的核心细胞成分，b细胞功能缺陷会导致病人体液免疫下降，甚至出现严重的细菌、病毒或其他病原微生物的感染。所以，通过再生手段恢复甚至增强体液免疫系统，有望造福众多体液免疫系统异常的患者。
3.多能干细胞(pluripotent stem cells，pscs)是一类具有无限增殖潜能、能分化产生不同谱系细胞潜力、方便进行基因编辑修饰的细胞，是细胞疗法再生医学研究的热点。诱导患者自体体细胞重编程衍生的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ipsc)分化形成不同的谱系细胞，不但可以规避使用胚胎干细胞的伦理争议，而且降低了异基因免疫排斥的风险，成为再生医学领域的理想细胞开发材料。
4.如何诱导多能干细胞分化产生b谱系种子，移植后重建体液免疫系统，是全世界研究的热点和难点，迄今没有实质性突破，更没有临床转化的案例。
5.研究表明，人胚胎多能干细胞(embryonic stem cells，escs)在体外与基质细胞共培养后更容易诱导产生nk细胞而不是b细胞(参见martin,colin h et al.differences in lymphocyte developmental potential between human embryonic stem cell and umbilical cord blood-derived hematopoietic progenitor cells.blood vol.112,7(2008):2730-7)。
6.小鼠诱导多能干细胞在体外与基质细胞共培养可以诱导出t细胞，却很难诱导出b细胞(参见wada,haruka et al.successful differentiation to t cells,but unsuccessful b-cell generation,from b-cell-derived induced pluripotent stem cells.international immunology vol.23,1(2011):65-74)。
7.同时，关于体内b细胞重建的研究方法也很少，其中有研究表明体外esc诱导的pro/pre-b祖细胞移植入免疫缺陷鼠后可以产生b1和b2细胞，但是上述研究产生的b细胞在体内存在的时间很短暂，同时在移植后6-8周就检测不到分泌的抗体(参见potocnik,a j et al.reconstitution of b cell subsets in rag deficient mice by transplantation of in vitro differentiated embryonic stem cells.immunology letters vol.57,1-3(1997):131-7)。还有研究报道esc在体外可以诱导出b1细胞的祖细胞，移植入免疫缺陷小鼠的体内可以长期重建b1细胞(参见lin,yang et al.long-term engraftment of esc-derived b-1progenitor cells supports hsc-independent lymphopoiesis.stem cell reports vol.12,3(2019):572-583)，但是此方法却不能获得对适应性体液免疫应答更重要的b2细胞。
8.此外，还有研究通过在多能干细胞中表达特定的转录因子获得具有多谱系造血重建能力的造血干组细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，hspcs)，移植后可
以产生包括b细胞在内的多个造血谱系细胞(参见lu,yi-fen et al.engineered murine hscs reconstitute multi-lineage hematopoiesis and adaptive immunity.cell reports vol.17,12(2016):3178-3192；和sugimura,ryohichi et al.haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.nature vol.545,7655(2017):432-438)，但上述研究体系存在稳定性差、效率较低的问题。
9.因此，本领域亟需一种高效的诱导多能干细胞获得单一b谱系种子细胞的方法。


技术实现要素：

10.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种多能干细胞定向分化b细胞的方法及其应用，采用基因修饰的多能干细胞，在体外诱导分化高效获得b细胞种子，移植后可以在体液免疫系统缺失的动物体内再生完备的体液免疫系统，是一种高效的体液免疫系统再生的方法，能够实现抗原特异性抗体免疫应答，针对抗原产生特异性高亲和力抗体，并产生免疫记忆，该方法重建的免疫系统安全，未见致瘤性风险。
11.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
12.第一方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有编码runx1，hoxa9和lhx2基因的核苷酸序列，用于实现runx1，hoxa9以及lhx2三个基因的串联共表达。
13.本发明中，将runx1、hoxa9和lhx2的cdna序列串联表达于同一载体，并整合入哺乳动物多能干细胞基因组中，可以得到稳定表达runx1，hoxa9和lhx2的宿主细胞，操作简便、效率较高，得到的宿主细胞具有分化为b细胞的能力。
14.其中，runx1基因又称为aml1，是runx转录因子蛋白家族中的成员之一，是白血病染色体易位最常见的靶位点。runx1是十分关键的造血调控转录因子，其在内皮生血转化、原始造血、永久造血以及淋巴细胞生成中起着重要的作用；
15.所述runx1基因可以为多种来源，如人源或鼠源，其中，小鼠来源的runx1基因可以是ensmusg00000022952，人源来源的runx1基因可以是ensg00000159216。
16.hoxa9基因是hox基因家族的一员，是编码序列特异性转录调控因子，在胚胎发育以及造血调控方面起着重要作用。hoxa9可以在hsc的增强与维持、内皮生血转化以及促进淋系生成方面起着重要作用；
17.所述hoxa9基因可以为多种来源，如人源或鼠源，其中小鼠来源的hoxa9基因可以是ensmusg00000038227，人源来源的hoxa9基因可以是ensg00000078399。
18.lhx2基因(lim homeobox 2)又称为lh-2，作为转录因子家族成员之一，在多种器官的发育过程中都起着较为重要的作用，尤其在神经系统中高水平表达；同时lhx2在胚胎造血、红系生成中起着重要作用，此外可以促进造血干祖细胞的永生，且lhx2被发现在pre-b细胞系中表达。
19.所述lhx2基因可以为多种来源，如人源或鼠源，其中小鼠来源的lhx2基因可以是ensmusg00000000247，人源来源的lhx2基因可以是ensg00000106689。
20.三个基因的联用主要是runx1可以促进多能干细胞分化形成生血内皮细胞，同时runx1以及hoxa9可以促进淋系的生成，而lhx2进一步促进了向b谱系的分化；相比于其他分化相关的基因，如runx1、lmo2和meis1同时使用，该组合在后期诱导生血内皮与op9-dl1共培养的过程中无法正常产生造血克隆。
21.第二方面，本发明提供了一种基因编辑的多能干细胞宿主细胞，所述宿主细胞包含如第一方面所述的表达载体。
22.优选地，所述宿主细胞为多能干细胞，包括诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系。
23.优选地，所述多能干细胞包括基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系。
24.第三方面，本发明提供了一种体液免疫系统再生，即多能干细胞定向分化b细胞的方法，包括以下步骤：
25.(1)将如第一方面所述的表达载体，即runx1，hoxa9和lhx2三个基因串联的表达载体整合到多能干细胞中，并进行抗性克隆化筛选；
26.(2)将步骤(1)所得的多能干细胞定向分化为诱导生血内皮(ihec)；
27.(3)将步骤(2)所述诱导生血内皮与骨髓基质细胞共培养，得到具备b谱系分化潜能的造血祖细胞，也就是b谱系种子细胞。
28.(4)将步骤(3)所述b谱系种子细胞移植，体内分化产生b细胞。
29.本发明中，通过对runx1，hoxa9和lhx2共表达的多能干细胞系进行定向分化，获得的诱导生血内皮与骨髓基质细胞共培养获得b谱系种子细胞，分化后得到功能正常的b细胞，包括所有成熟细胞类型，且无致瘤风险。
30.优选地，步骤(1)所述runx1，hoxa9和lhx2串联的表达载体可整合到任意安全位点，插入位点能够使得插入的基因稳定表达即可，本发明中优选地将串联表达的基因整合到多能干细胞的rosa26位点、aavs1位点、ccr5位点、h11位点、col1a1位点或tigre位点。
31.优选地，步骤(1)所述多能干细胞为基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系。
32.优选地，步骤(1)所述整合的方法包括同源重组、crispr/cas9、talen、转染或病毒感染中的任意一种或至少两种的组合，优选为同源重组。
33.优选地，步骤(1)所述抗性筛选采用潮霉素b，获得主克隆干细胞系；也可以采用其他抗性筛选策略诸如氯霉素、遗传霉素(g-418)、杀稻瘟菌素、霉酚酸等获得主克隆干细胞系。
34.优选地，步骤(2)所述定向分化的方法为依次采用d0培养基、d2.5培养基、d6培养基培养多能干细胞得到所述诱导生血内皮。
35.优选地，所述d0培养基为含有3～8ng/ml骨形态发生蛋白4(bmp4)的基础分化培养基；所述骨形态发生蛋白4的浓度例如可以是3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml或8ng/ml，优选为5ng/ml。
36.优选地，所述d2.5培养基为含有3～8ng/ml(例如可以是3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml或8ng/ml，优选为5ng/ml)bmp4和3～8ng/ml(例如可以是3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml或8ng/ml，优选为5ng/ml)血管内皮生长因子(vegf)的基础分化培养基。
37.优选地，所述d6培养基为含有10～30ng/ml白介素3(il3)、10～30ng/ml白介素6(il6)、10～30ng/ml干细胞因子(scf)、10～30ng/ml fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)和1～2μg/ml强力霉素(dox)的基础分化培养基。
38.其中，所述il3的浓度例如可以是10ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、22ng/ml、25ng/ml或30ng/ml，优选为20ng/ml；所述il6的浓度例如可以是10ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、22ng/ml、25ng/ml或30ng/ml，优选为20ng/ml；所述scf的浓度例如可以是10ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、22ng/ml、25ng/ml或30ng/ml，优选为20ng/ml；所述flt3l的浓度例如可以是10ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、22ng/ml、25ng/ml或30ng/ml，优选为20ng/ml；所述强力霉素的浓度例如可以是1μg/ml、1.2μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.8μg/ml或2μg/ml，优选为1μg/ml。
39.所述d0培养基、所述d2.5培养基和d6培养基的组分如下表1所示：
40.表1
[0041][0042][0043]
优选地，所述基础分化培养基为包含10～20％胎牛血清(％表示体积分数)、180～220μg/ml铁饱和转铁蛋白(iron-saturated transferrin)、4
×
10-4
～5
×
10-4
m硫代甘油、1～3mmglutamax
tm-i添加剂和30～70μg/ml抗坏血酸的imdm培养基；
[0044]
其中，所述胎牛血清的浓度例如可以是10％、12％、14％、16％、18％或20％，优选为15％；所述铁饱和转铁蛋白的浓度例如可以是180μg/ml、190μg/ml、210μg/ml或220μg/ml，优选为200μg/ml；所述硫代甘油的浓度例如可以是4
×
10-4
m、4.2
×
10-4
m、4.4
×
10-4
m、4.8
×
10-4
m或5
×
10-4
m，优选为4.5
×
10-4
m；所述glutamax
tm-i添加剂的浓度例如可以是1mm、1.4mm、1.8mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3mm，优选为2mm；所述抗坏血酸的浓度例如可以是30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml或70μg/ml，优选为50μg/ml。
[0045]
本发明中，发明人通过改变培养基中的添加物质，设计优化了定向造血分化体系，诱导多能干细胞造血分化为诱导生血内皮，所述诱导生血内皮通过进一步与小鼠骨髓基质细胞共培养，得到b谱系种子细胞。
[0046]
优选地，步骤(3)所述骨髓基质细胞包括op9-dl1细胞、op9-dl4细胞、op9细胞、ms5细胞、ms5-dl1细胞、ms5-dl4细胞、hs-5细胞、hs-5-dl1细胞、hs-5-dl4细胞、msc细胞、msc-dl1细胞、msc-dl4细胞中的任意一种或至少两种的组合；也可选择其他骨髓、胸腺、淋巴结、肝脏、脾脏组织等来源的基质细胞以及修饰表达dl1或dl4的骨髓基质细胞中的任意一种或至少两种的组合。
[0047]
上述细胞系带有dl1的时候也有别名dll1，带有dl4的时候也有别名dll4，均是相同的对应细胞系。
[0048]
优选地，步骤(3)所述共培养过程中采用强力霉素(dox)进行诱导；也可以采用其他诱导原理设计的表达元件进行相应药物诱导，例如他莫昔芬(tamoxifen、4-oht)。
[0049]
优选地，步骤(3)所述共培养的方法为将诱导生血内皮与op9-dl1细胞采用d11培养基进行共培养，得到所述b谱系种子细胞。
[0050]
优选地，所述d11培养基的组分如下表2所示：
[0051]
表2
[0052][0053][0054]
其中，所述il3的浓度例如可以是10ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、22ng/ml、25ng/ml或30ng/ml，优选为20ng/ml；所述scf的浓度例如可以是10ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、22ng/ml、25ng/ml或30ng/ml，优选为20ng/ml；所述flt3l的浓度例如可以是10ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、22ng/ml、25ng/ml或30ng/ml，优选为20ng/ml；所述强力霉素的浓度例如可以是1μg/ml、1.2μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.8μg/ml或2μg/ml，优选为1μg/ml；所述胎牛血
清的浓度例如可以是10％、12％、14％、16％、18％或20％，优选为15％；所述铁饱和转铁蛋白的浓度例如可以是180μg/ml、190μg/ml、210μg/ml或220μg/ml，优选为200μg/ml；所述硫代甘油的浓度例如可以是4
×
10-4
m、4.2
×
10-4
m、4.4
×
10-4
m、4.8
×
10-4
m或5
×
10-4
m，优选为4.5
×
10-4
m；所述glutamax
tm-i添加剂的浓度例如可以是1mm、1.4mm、1.8mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3mm，优选为2mm；所述抗坏血酸的浓度例如可以是30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml或70μg/ml，优选为50μg/ml。
[0055]
需要说明的是，所述d11培养基的主体培养基可以是α-mem培养基或imdm培养基；由于本发明在实验过程中所用的骨髓基质细胞为op9-dl1，所以培养基优选为α-mem培养基。
[0056]
优选地，步骤(4)所述分化产生的b细胞包括b220
+
b细胞和/或cd19
+
b细胞。
[0057]
优选地，所述分化产生的b细胞包括pro-b细胞、pre-b细胞、b1细胞、b2细胞或浆细胞(plasma cell)中的任意一种或至少两种的组合。
[0058]
优选地，所述b1细胞包括b1a细胞和/或b1b细胞。
[0059]
优选地，所述b2细胞为滤泡b细胞(follicular b，fo b)和/或边缘区b细胞(marginal zone，mz b)。
[0060]
作为本发明优选的技术方案，本发明提供了一种多能干细胞定向分化b细胞的方法，包括以下步骤：
[0061]
(1)将runx1、hoxa9和lhx2串联的表达载体通过基因重组整合到多能干细胞的rosa26位点，并采用潮霉素b进行抗性筛选；
[0062]
(2)将步骤(1)所述多能干细胞依次采用d0培养基、d2.5培养基、d6培养基进行培养，在第8-12天定向分化为诱导生血内皮；
[0063]
(3)将步骤(2)所述诱导生血内皮与op9-dl1细胞采用d11培养基进行共培养8-21天，并采用强力霉素进行诱导，得到b谱系种子细胞；
[0064]
(4)将步骤(3)所述b谱系种子细胞转至动物模型中，分化产生b细胞，所述b细胞包括pro-b细胞、pre-b细胞、b1细胞、b2细胞或浆细胞中的任意一种或至少两种的组合。
[0065]
优选地，步骤(2)在第11天定向分化为诱导生血内皮。
[0066]
优选地，步骤(3)所述共培养的时间为10天。
[0067]
第四方面，本发明提供一种如第四方面所述的方法制备得到的b谱系种子细胞或b细胞。
[0068]
第五方面，本发明提供了一种药物组合物，包括如第一方面所述的表达载体、如第二方面所述的宿主细胞、如第四方面所述的b谱系种子细胞或b细胞中的任意一种或至少两种的组合。
[0069]
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；所述药学上可接受的辅料包括载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0070]
第六方面，本发明还提供了一种如第五方面所述的药物组合物在制备增强免疫响应的药物、预防和/或治疗疾病的药物、b细胞免疫疗法治疗肿瘤的药物、b细胞疫苗或b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法的药物中的应用。
[0071]
优选地，所述增强免疫响应的药物包括增强b细胞免疫响应和/或t细胞免疫响应的药物。
[0072]
优选地，所述预防和/或治疗疾病的药物包括预防和/或治疗b细胞免疫缺陷、感染性疾病、肿瘤的药物。
[0073]
优选地，所述b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法的药物包括预防和/或治疗自身免疫病、基因遗传性疾病的药物。
[0074]
优选地，所述b细胞分泌治疗性蛋白包括抗体。
[0075]
优选地，所述基因遗传性疾病包括血友病、溶酶体贮积症、低磷酸酯酶症或苯丙酮尿症中的任意一种或至少两种的组合。
[0076]
本发明中，所述药物组合物可以用于：(1)增强免疫响应，特别是增强b细胞免疫响应和/或t细胞免疫响应；(2)预防和/或治疗疾病，优选为用于制备预防和/或治疗b细胞免疫缺陷、感染性疾病、肿瘤等；(3)b细胞疫苗研发及制备；(4)b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法，优选为用于预防和/或治疗自身免疫病、基因遗传性疾病等。
[0077]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0078]
(1)本发明将外源runx1，hoxa9和lhx2共表达载体引入多能干细胞中，成功构建了诱导性共表达外源runx1，hoxa9和lhx2的多能干细胞，所述多能干细胞具有分化为b细胞的能力，并能够用于制备增强免疫效应、预防和/或治疗免疫缺陷、预防和/或治疗感染性疾病、预防和/或治疗肿瘤、制备b细胞疫苗以及制备b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法的药物；
[0079]
(2)本发明采用定向分化体系和共培养方法，将所述多能干细胞定向分化为b谱系种子细胞，所述b谱系种子细胞移植后，可以在体内分化产生b细胞，并能够用于制备增强免疫效应、预防和/或治疗免疫缺陷、预防和/或治疗感染性疾病、预防和/或治疗肿瘤、制备b细胞疫苗以及制备b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法的药物；
[0080]
(3)采用本发明的方法获得的多能干细胞来源的b细胞，功能正常，没有致瘤风险，可以用于制备多种药物，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0081]
图1(a)为定点敲入多能干细胞rosa26位点的可诱导表达系统示意图。
[0082]
图1(b)为通过潮霉素b抗性筛选获得的irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞明场图(左)以及荧光图(右)(标尺200μm)。
[0083]
图1(c)为使用强力霉素处理24小时后runx1(左)，hoxa9(中)以及lhx2(右)的相对表达水平。
[0084]
图2(a)为诱导irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞定向分化为诱导生血内皮(ihec)的拟胚体定向诱导分化体系示意图。
[0085]
图2(b)为诱导irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞定向分化至第11天的eb拟胚体细胞分化形态图(左)以及由eb拟胚体分化而来的造血相关细胞集落图(右)(标尺400μm)。
[0086]
图2(c)为采用流式分选策略(cd31
+
、cd41
+
、cd45-、c-kit
+
、cd201
+
)分选诱导生血内皮的流式结果图。
[0087]
图3(a)为分选的诱导生血内皮与op9-dl1细胞共培养的示意图。
[0088]
图3(b)为诱导生血内皮与op9-dl1细胞共培养10天后显微镜下观察的造血细胞鹅
卵石样形成区域的光场图(标尺400μm)。
[0089]
图3(c)为诱导生血内皮与op9-dl1细胞共培养10天后造血祖细胞免疫表型的流式检测结果图。
[0090]
图4(a)为利用体内微环境获得b细胞的共培养后移植策略示意图。
[0091]
图4(b)为移植6周后，受体小鼠外周血、骨髓、脾脏和淋巴结中血液细胞的流式检测结果图。
[0092]
图4(c)为多能干细胞来源的血液细胞基因组的pcr扩增位置示意图。
[0093]
图4(d)为多能干细胞来源的血液细胞基因组的pcr扩增电泳检测图；其中，泳道m表示dna marker，泳道1表示质粒，泳道2表示小鼠淋巴结(lymph node,ln)细胞，泳道3表示小鼠脾脏(spleen,sp)细胞，泳道4表示小鼠骨髓(bone marrow,bm)细胞，泳道5表示空白对照。
[0094]
图4(e)为多能干细胞来源的血液细胞基因组的测序鉴定结果图。
[0095]
图4(f)为移植后elisa检测未免疫受体鼠(ib小鼠)血清中免疫球蛋白的含量。
[0096]
图5(a)为受体鼠移植后2周，骨髓中多能干细胞来源的b祖细胞(pro/pre-b)，非成熟b(immature b)细胞以及成熟b(mature b)细胞的流式分析结果图。
[0097]
图5(b)为受体鼠移植后4周，脾脏、淋巴结以及腹膜腔中多能干细胞来源的b1(包括b1a和b1b)以及b2(包括fo b和mz b)细胞群体的流式分析结果图。
[0098]
图5(c)为受体鼠(ib小鼠)移植后4周，脾脏中多能干细胞来源的初始滤泡b细胞(naive fo b)的b细胞受体(bcr)的重链和轻链多样性分析。
[0099]
图6(a)为非t细胞依赖性ⅰ型抗原(np-lps)免疫受体鼠(ib小鼠)后血清中的抗原特异性(anti-np)igm(左)以及igg3(右)的elisa法检测结果图。
[0100]
图6(b)为非t细胞依赖性ⅱ型抗原(np-aecm-ficoll)免疫受体鼠(ib小鼠)后血清中的抗原特异性(anti-np)igm(左)以及igg3(右)的elisa法检测结果图。
[0101]
图6(c)为t细胞依赖性抗原(np-cgg)初次免疫受体鼠(ib小鼠)血清中的抗原特异性(anti-np)igm(i图)以及igg1(ii图和iii图)的elisa法检测结果图，以及再次免疫(在初次免疫后第111天进行再次抗原刺激)后受体鼠血清(ib小鼠)中的抗原特异性(anti-np)igg1(iv图和v图)的elisa法检测结果图。
[0102]
图7(a)为t细胞依赖性抗原(np-cgg)免疫受体鼠(ib小鼠)后第14天，脾脏中多能干细胞来源的浆细胞(plasma cell)以及抗原特异性的生发中心b细胞(np-specific gc b)的流式检测结果图。
[0103]
图7(b)为t细胞依赖性抗原(np-cgg)免疫受体鼠(ib小鼠)后第14天，流式检测脾脏中igm
+
记忆b细胞(igm
+
memory b)以及igg1
+
记忆b细胞(igg1
+
memory b)的流式检测结果图。
[0104]
图7(c)为在初次抗原刺激后第21天、在再次抗原刺激(初次抗原刺激后第111天进行再次抗原刺激)后第17天受体鼠(ib小鼠)骨髓中长寿浆细胞(long lived plasma cell)的流式检测结果图。
具体实施方式
[0105]
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实
例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
[0106]
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
[0107]
实施例1制备表达runx1，hoxa9和lhx2基因的载体和多能干细胞
[0108]
本实施例通过电转化法结合基因重组在多能干细胞的rosa26位点定点敲入可诱导表达序列，所述表达系统采用p2a以及t2a序列将runx1(ccds28339.1)、hoxa9(ccds20146.1)和lhx2(ccds16008.1)的cdna序列串联，采用强力霉素(dox)诱导基因表达。
[0109]
如图1(a)所示，敲入序列包含irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2串联序列和用于抗性筛选的潮霉素b抗性基因(hygror)序列。
[0110]
为了成功获得同源重组的多能干细胞，电转化20小时后加入含有潮霉素b(150μg/ml)的多能干细胞培养基，每天换液。采用潮霉素b筛选10天后，在显微镜下挑取单个克隆至提前铺好小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,mef)的12孔板中，每孔放入一个多能干细胞克隆，采用无潮霉素的培养基进行培养。
[0111]
待克隆团粘附在mef细胞层中，每天换液，3天后采用0.25％胰酶消化克隆团，传代至12孔板中，细胞形态如图1(b)所示，克隆团处于对数生长期，边缘整齐透亮与mef细胞层有明显分界，无分化发生。根据细胞状态和生长密度，进行传代、扩增和冻存。
[0112]
提取dox处理24小时后的irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞总mrna(未加dox组作为对照组)，利用q-pcr检测runx1，hoxa9和lhx2的mrna的表达水平，图1(c)表明，加入dox可以诱导runx1，hoxa9和lhx2的表达。
[0113]
实施例2诱导多能干细胞向诱导生血内皮分化
[0114]
为了诱导多能干细胞向诱导生血内皮分化，采用如图2(a)所示的拟胚体定向诱导分化体系。
[0115]
定向诱导分化体系中各培养基的配方为：
[0116]
基础分化培养基：含有15％胎牛血清、200μg/ml铁饱和转铁蛋白、4.5
×
10-4
m硫代甘油、2mm glutamax
tm-i添加剂和50μg/ml抗坏血酸的imdm培养基；
[0117]
d0培养基：含有5ng/ml骨形态发生蛋白4的基础分化培养基；
[0118]
d2.5培养基：含有5ng/ml骨形态发生蛋白4和5ng/ml血管内皮生长因子的基础分化培养基；
[0119]
d6培养基：含有20ng/ml重组小鼠白介素3、20ng/ml重组小鼠白介素6、20ng/ml重组小鼠干细胞因子、20ng/ml人fms样酪氨酸激酶3配体和1μg/ml强力霉素的基础分化培养基。
[0120]
具体步骤为：
[0121]
(1)提前40min在6孔板中铺1ml浓度为0.1％的明胶(gelatin)，待用。使用0.05％胰酶将多能干细胞消化为单细胞，离心后重悬多能干细胞。吸去多余的明胶，将多能干细胞悬液转移到包被有明胶的孔中，培养箱中放置40min，以除去mef细胞。收集悬浮细胞，250g下离心5min，使用dpbs清洗一次。
[0122]
(2)使用d0培养基重悬细胞并计数，调整细胞浓度至1
×
105个/ml。将5～10ml细胞悬液加入到倾斜的10cm盘中，吸取20μl细胞悬液，加入到15cm培养皿中悬浮拟胚体(eb)，单
个eb为20μl(约2000个细胞)。随后将培养皿倒置，并在培养皿底部放置一个10cm培养皿盖子，盖子中加入5～6ml细胞培养用水。在37℃培养箱中培养2.5天。
[0123]
(3)提前40min在6孔板中铺1ml浓度为0.1％的明胶(gelatin)，待用。用巴氏吸管将eb收集到离心管中，用dpbs清洗培养皿底，待eb自然沉降后小心吸去上清，亦可在90g低速离心5min去上清。用d2.5培养基重悬eb后，吸去多余的明胶，将eb转移至包被有明胶的6孔板中，培养12小时观察eb是否有污染。
[0124]
(4)随后在d4进行换液继续培养两天，采用的培养基为d2.5培养基。
[0125]
(5)更换d6培养基进行培养一天。随后隔天换液，采用的培养基为d6培养基。
[0126]
拟胚体在培养过程中逐渐向外围扩散迁移形成中胚层细胞，如图2(b)所示，在第11天，irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2拟胚体中心的外围可见明显的一圈分化细胞(左)，并且在拟胚体周围可见明显的造血簇(右)。
[0127]
在拟胚体诱导分化培养的第11天，采用如图2(c)的分选策略(cd31
+
、cd41
+
、cd45-、c-kit
+
以及cd201
+
)进行流式细胞仪分选诱导生血内皮。
[0128]
实施例3共培养诱导生血内皮与op9-dl1基质细胞
[0129]
为了进一步从诱导生血内皮诱导分化得到b谱系种子细胞，如图3(a)所示，本实施例中将分选获得的诱导生血内皮与op9-dl1基质细胞进行共培养。
[0130]
具体步骤如下：
[0131]
(1)提前4天复苏op9-dl1细胞，根据细胞生长状态及时传代，避免细胞由于过度生长而老化；
[0132]
(2)使用前一天传代，每孔重铺2万细胞(12孔板)，第二天使用；
[0133]
共培养培养基为d11培养基，是含有20ng/ml重组小鼠白介素3、20ng/ml重组小鼠干细胞因子、20ng/ml人fms样酪氨酸激酶3配体、1μg/ml dox、15％胎牛血清、200μg/ml铁饱和转铁蛋白、4.5
×
10-4
m硫代甘油、2mm glutamax
tm-i添加剂和50μg/ml抗坏血酸的α-mem培养基；
[0134]
图3(b)显示irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞来源的诱导生血内皮与基质细胞op9-dl1共培养10天后，在基质细胞op9-dl1上形成高度均一的小、圆、亮的造血细胞。
[0135]
图3(c)显示irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞来源的诱导生血内皮与基质细胞op9-dl1共培养10天后，生成的造血细胞呈现出造血祖细胞的免疫表型：lsk(lin-c-kit
+
sca1
+
)。
[0136]
实施例4共培养后移植进行体内b谱系再生
[0137]
为了利用体内微环境获得b细胞，本实施例中进一步设计了共培养后移植策略。
[0138]
所述共培养后移植策略如图4(a)所示，将诱导生血内皮在op9-dl1基质细胞上添加dox诱导10天后获得b谱系种子细胞；随后，将多能干细胞来源的b谱系种子细胞通过眼静脉移植到8～12周龄的b细胞缺陷小鼠(μmt小鼠)中，进行体内b谱系再生。
[0139]
图4(b)表明irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞来源的诱导生血内皮经过共培养后获得的b谱系种子细胞，可以在受体μmt小鼠各种造血组织以及器官中形成造血嵌合。
[0140]
流式分析移植后6周的受体鼠，结果显示在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结中，多能干细胞来源的血液细胞以cd19
+
b细胞为主，实现了有效重建b淋系的效果。
[0141]
本实施例中，为了从基因组水平上确认受体小鼠中gfp
+
造血细胞(主要是b细胞)来源于irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞，设计引物进行pcr扩增及测序鉴定。
[0142]
首先，通过流式分选骨髓、淋巴结和脾脏来源的gfp
+
细胞，提取基因组，利用敲入基因序列的特异性引物进行pcr鉴定(如图4(c)所示)。
[0143]
图4(d)显示，这些细胞基因组内有irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2质粒来源序列，证实gfp
+
血液细胞(主要是b细胞)来自于irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞，同时测序结果(如图4(e)显示)也证明了这一结果。
[0144]
同时，为了验证多能干细胞来源的b细胞是否具备抗体分泌的功能，移植后4～6周后，进行elisa检测未免疫受体鼠血清中免疫球蛋白的含量。
[0145]
如图4(f)显示，相比于阴性对照μmt小鼠，b谱系种子细胞移植后的μmt受体鼠(ib小鼠)血清中可以检测到各种免疫球蛋白类型包括igm、igg1、igg2b、igg2c、igg3以及iga，实现了重建功能性b淋系的效果。
[0146]
实施例5再生b谱系的发生过程
[0147]
为了进一步明确irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞来源的b谱系发生过程，流式细胞术发现，如图5(a)所示，b谱系种子细胞在骨髓中可以再生出pro/pre-b祖细胞，进一步发育为非成熟b细胞和成熟b细胞；
[0148]
图5(b)显示，在脾脏、淋巴结以及腹膜腔中均存在有多能干细胞来源的成熟b1细胞(包括b1a以及b1b)和成熟b2细胞(包括fo b和mz b)；
[0149]
分选受体鼠(ib小鼠)脾脏中的初始滤泡b细胞(naive fo b)进行b细胞受体(bcr)测序，如图5(c)显示，多能干细胞来源的初始滤泡b细胞(naive fo b)具备重链以及轻链的多样性重排，多能干细胞来源的naive fo b的bcr多样性类似于阳性对照组c57bl/6小鼠的naive fo b的bcr多样性；本实施例证实了受体鼠体内多能干细胞来源b谱系的正常发育。
[0150]
实施例6b细胞免疫功能验证
[0151]
本实施例进一步验证irunx1-p2a-hoxa9-t2a-lhx2多能干细胞来源的b细胞是否能够产生抗原特异性的抗体。
[0152]
如图6(a)显示，用非t细胞依赖性ⅰ型抗原(np-lps)免疫受体鼠(ib小鼠)后，多能干细胞来源的b细胞可以分泌抗原特异性(anti-np)igm以及igg3。
[0153]
图6(b)显示非t细胞依赖性ⅱ型抗原(np-aecm-ficoll)免疫受体鼠(ib小鼠)后，多能干细胞来源的b细胞可以分泌抗原特异性(anti-np)igm以及igg3。
[0154]
图6(c)显示t细胞依赖性抗原(np-cgg)初次免疫(i图、ii图和iii图)以及再次免疫(iv图和v图)受体鼠(ib小鼠)后，多能干细胞来源的b细胞可以分泌抗原特异性抗原特异性(anti-np)igm以及igg1；
[0155]
因此，本实施例证实了多能干细胞来源的b细胞可以针对特定抗原产生特异性的抗体。
[0156]
实施例7适应性免疫应答
[0157]
t细胞依赖性抗原(np-cgg)免疫受体鼠(ib小鼠)后，如图7(a)所示，在免疫后第14天，流式检测结果显示脾脏中多能干细胞来源的b细胞可以形成浆细胞(plasma cell)以及产生抗原特异性的生发中心b细胞(np-specific gc b)；
[0158]
图7(b)显示，在免疫后第14天，受体鼠脾脏中可以检测到igm
+
记忆b细胞，同时多
能干细胞来源的b细胞可以进行类别转换，产生igg1
+
记忆b细胞；
[0159]
图7(c)显示，受体鼠骨髓中在初次抗原刺激后第21天以及在再次抗原刺激(初次抗原刺激后第111天进行再次抗原刺激)后第17天通过流式均可检测到长寿浆细胞(long lived plasma cell)；
[0160]
因此，本实施例证实了受体鼠多能干细胞来源的b细胞经过抗原刺激后可以正常的形成生发中心b细胞(germinal center b,gc b)，记忆b细胞(memory b)以及长寿浆细胞，可有效地参与适应性免疫应答。
[0161]
综上所述，本发明将外源runx1、hoxa9和lhx2共表达载体引入多能干细胞中，成功构建了诱导性共表达外源runx1、hoxa9和lhx2的多能干细胞，所述多能干细胞定向分化为b谱系种子细胞，并将发育为b细胞。使用本发明的方法获得的多能干细胞来源的b细胞，不仅功能正常，而且没有致瘤风险，可以用于制备增强免疫效应、预防和/或治疗免疫缺陷、预防和/或治疗感染性疾病、以及预防和/或治疗肿瘤、制备b细胞疫苗以及制备b细胞分泌治疗性蛋白的细胞疗法的药物。
[0162]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。