一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的乳腺癌细胞和T细胞共培养方法

一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的乳腺癌细胞和t细胞共培养方法
技术领域
1.本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的乳腺癌细胞和t细胞共培养方法。


背景技术：

2.乳腺癌被认为是免疫“冷”肿瘤，仅有小部分患者对现有免疫检查点抑制剂治疗有效，治疗反应率不佳，因此急需要探索新的有效的免疫治疗方案。
3.在本研究团队的在先申请cn202210012502.0中，提出了伽马干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶gilt在提高t细胞介导的抗肿瘤免疫反应中的新用途。结果表明，gilt的高表达能够显著增加肿瘤组织中杀伤性t细胞的水平。
4.但上述技术方案中并未涉及共培养的具体方法和所述使用的设备，因此，本技术提出了一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的乳腺癌细胞和t细胞共培养方法。
5.就目前培养箱而言，现有的培养箱在进行培养工作时在将箱门进行开启后培养盘多为直接暴露在外部的空气之中，使得其在进行取出或放入工作时会对培养箱内部整体的环境造成影响，进而会影响其对细胞的培养效率，以及在进行培养工作时，缺乏有效的减少接触状态下的取出及放置工作，进而存在着局限性。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的乳腺癌细胞和t细胞共培养方法，所述共培养方法通过使用医用co2培养箱来实现；所述医用co2培养箱包括：箱体，所述箱体的主体为内部中空结构，且箱体的前端通过插柱插接有箱门，箱门的左端面四角位置均固定连接有插柱，箱门与插柱共同组成了支撑结构，在箱门的内部呈直线阵列开设有两处通槽，且箱门中所开设的通槽内部均铰接有盖板，在箱门的顶端面上固定连接有导杆，导杆共设有两处，且两处导杆呈直线阵列固定连接在箱门的顶端面位置，并且两处导杆中远离箱门的一侧还固定连接有接触块，接触块为金属材质，且接触块的底端面上开设有接触槽，接触块底端面所开设的接触槽与接近开关相匹配。
7.可选地，所述导轴的底端固定连接有隔板，隔板的底端面上固定连接有培养盘，培养盘的左右两侧均开设有通槽，且培养盘的顶端面前后两侧均开设有横向槽，并且培养盘顶端所开设的横向槽与导块相匹配，在隔板的左右两侧面均固定连接有顶板。
8.可选地，所述顶板中远离隔板的一侧均与分区控制罩相插接，分区控制罩的内部含有温控器，在分区控制罩的底端面固定连接有导块，分区控制罩通过导块滑动连接在培养盘之上，在分区控制罩的前后两侧面均固定连接有折叠板，且分区控制罩与顶板及折叠板组成了封闭结构。
9.可选地，所述风箱的一侧固定连接有风机，风机用于向风箱内出风，在箱体和箱门的内侧呈对向铰接有支架a，在支架a的另一端还插接有支架b，在支架b中远离支架a的一端
还与安装座相连接，在两处安装座的内侧固定连接有托盘，托盘的内部呈矩形阵列开设有通槽，且托盘与培养盘的底端开口相匹配。
10.可选地，所述接近开关共设有两处，且两处接近开关分别固定连接在箱体顶端面上的左右两侧位置，并且接近开关与接触块相接触状态下，风机处于通电状态，在箱体的顶端面上固定连接有磁块a，磁块a共设有两处，且两处磁块a呈直线阵列固定连接在箱体的顶端面位置。
11.可选地，所述分区控制罩为磁性材质，在箱体的外侧固定连接有磁块b，当磁块b与分区控制罩位置重合时，分区控制罩为与隔板相接触状态，在箱体的内部固定连接有底板，底板用于封闭培养盘的底端开口，且培养盘与底板共同组成了承载结构。
12.可选地，所述磁块a与接触块相匹配，在箱体的内部转动连接有导轴，导轴的顶端面上呈环形阵列开设有插孔，在导轴的顶端通过弹簧安装有调节盘，调节盘的底端面上呈环形阵列设置有导柱，且调节盘底端面上所固定连接的导柱与导轴顶端所开设的插孔相匹配。
13.可选地，所述底板的一侧固定连接有风箱，风箱位于培养盘的正下方位置，且风箱的内部开设有通槽，并且风箱中所开设的通槽与培养盘的底端开槽相匹配，在风箱的左右两侧均开设有贯通的纵向槽，且风箱中左右两侧所开设的纵向槽与支架a和支架b相匹配。
14.有益效果
15.在培养盘的底侧设置有底板和风箱，底板可以作为对培养盘的承载与封闭结构进行使用，而风箱的设置不但可以作为对托盘经过时的半密闭通道，并且在当箱门进行开启后，通过接触块与接近开关的脱离还可以对安装在风箱外侧的风机进行开启，并通过风机向着风箱的内部进行出风后可以更加全面的对风箱内部的托盘及其内部所承载的物品进行更加彻底且高效的风淋除尘操作，进而达到保护箱体内部所容纳的物品不受外部环境所影响的设计，避免了因箱体内部的环境遭受到外部的环境干涉容易对培养物的正常培养造成影响的问题。
16.在当接触块位于磁块a的正上方位置时，会同步的位于调节盘的正下方位置，并通过接触块的凸起将安装在导轴顶侧的调节盘向上顶起，使得调节盘与导轴处于脱离不可传动状态，此时无法再通过手动转动调节盘而对箱体内部所安装的培养盘的位置进行调整，可以使得装置在使用时放入或取出物品都更加平稳，且有效的防止了误触而产生的不便，该设计即可自动化的有效避免了装置处于箱门开启状态下若不慎对培养盘的位置进行调整容易导致损坏装置或需要存入或取出的物品而产生的不必要损失出现。
17.通过导块滑动连接在培养盘之上的分区控制罩会因为失去了磁块b的限位通过折叠板的弹出对培养盘进行封闭操作，使得箱门在处于开启状态时，可以通过分区控制罩对培养盘的封闭来确保箱门处于开启状态时培养盘内部的培养物品不会因为外部环境的干涉而造成影响，进而达到更加实用的目的，并且在当培养盘通过调节盘的转动与箱体外侧所固定连接的磁块b的位置进行匹配时，通过导块滑动连接在培养盘之上的分区控制罩会在磁块b的排斥作用下解除对培养盘的封闭，该设计可以实现在非电控驱动的前提下自动化的完成对培养盘在箱门开启和非开启状态下的自动化启闭封闭的结构，进而达到保护箱体内部培养物的目的。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明的实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。
19.下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
20.在附图中：
21.图1示出了根据本发明实施例的培养箱的部分结构半剖且拆分状态下的前侧视结构的示意图；
22.图2示出了根据本发明实施例的培养箱的部分结构半剖且拆分状态下的仰侧视结构的示意图；
23.图3示出了根据本发明实施例的培养箱的装配结构的示意图；
24.图4示出了根据本发明实施例的培养箱的箱体至磁块b展示结构的示意图；
25.图5示出了根据本发明实施例的培养箱的导轴至导块展示结构的示意图；
26.图6示出了根据本发明实施例的培养箱的底板至安装座展示结构的示意图；
27.图7示出了根据本发明实施例的培养箱的图2中a处放大结构的示意图；
28.图8示出了根据本发明实施例的培养箱的图2中b处放大结构的示意图；
29.附图标记列表
30.1、箱体；2、箱门；3、盖板；4、插柱；5、导杆；6、接触块；7、接近开关；8、磁块a；9、导轴；10、调节盘；11、导柱；12、培养盘；13、隔板；14、分区控制罩；15、顶板；16、折叠板；17、导块；18、底板；19、风箱；20、风机；21、支架a；22、支架b；23、托盘；24、安装座；25、磁块b。
具体实施方式
31.为了使得本发明的技术方案的目的、方案和优点更加清楚，下文中将结合本发明的具体实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。除非另有说明，否则本文所使用的术语具有本领域通常的含义。附图中相同的附图标记代表相同的部件。
32.实施例：请参考图1至图8：
33.本发明提出了一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的乳腺癌细胞和t细胞共培养方法，所述共培养方法通过使用医用co2培养箱来实现；所述医用co2培养箱包括：箱体1，箱体1的主体为内部中空结构，且箱体1的前端通过插柱4插接有箱门2，箱门2的左端面四角位置均固定连接有插柱4，箱门2与插柱4共同组成了支撑结构，在箱门2的内部呈直线阵列开设有两处通槽，且箱门2中所开设的通槽内部均铰接有盖板3，在箱门2的顶端面上固定连接有导杆5，导杆5共设有两处，且两处导杆5呈直线阵列固定连接在箱门2的顶端面位置，并且两处导杆5中远离箱门2的一侧还固定连接有接触块6，接触块6为金属材质，且接触块6的底端面上开设有接触槽，接触块6底端面所开设的接触槽与接近开关7相匹配，风箱19的一侧固定连接有风机20，风机20用于向风箱19内出风，在箱体1和箱门2的内侧呈对向铰接有支架a21，在支架a21的另一端还插接有支架b22，在支架b22中远离支架a21的一端还与安装座24相连接，在两处安装座24的内侧固定连接有托盘23，托盘23的内部呈矩形阵列开设有通槽，且托盘23与培养盘12的底端开口相匹配，在当接触块6位于磁块a8的正上方位置时，会同步的位于调节盘10的正下方位置，并通过接触块6的凸起将安装在导轴9顶侧的调节盘10向上顶起，使得调节盘10与导轴9处于脱离不可传动状态，此时无法再通过手动转动调节盘10而
对箱体1内部所安装的培养盘12的位置进行调整，可以使得装置在使用时放入或取出物品都更加平稳，且有效的防止了误触而产生的不便。
34.此外，根据本发明的实施例，如图1-图3所示，接近开关7共设有两处，且两处接近开关7分别固定连接在箱体1顶端面上的左右两侧位置，并且接近开关7与接触块6相接触状态下，风机20处于通电状态，在箱体1的顶端面上固定连接有磁块a8，磁块a8共设有两处，且两处磁块a8呈直线阵列固定连接在箱体1的顶端面位置，磁块a8与接触块6相匹配，在箱体1的内部转动连接有导轴9，导轴9的顶端面上呈环形阵列开设有插孔，在导轴9的顶端通过弹簧安装有调节盘10，调节盘10的底端面上呈环形阵列设置有导柱11，且调节盘10底端面上所固定连接的导柱11与导轴9顶端所开设的插孔相匹配，通过手动将箱门2向外侧进行拉动，首先安装在导杆5一侧的接触块6会与固定连接在箱体1之上的接近开关7进行脱离，此时安装在风箱19外侧的风机20处于开启状态，然后通过箱门2继续向外侧进行开启，使得安装在导杆5一侧的接触块6位于箱体1顶端所固定连接的磁块a8的正上方位置，并通过磁块a8对接触块6的吸附使得箱门2在进行开启后可以有效的对其进行限位。
35.此外，根据本发明的实施例，如图1-图6所示，导轴9的底端固定连接有隔板13，隔板13的底端面上固定连接有培养盘12，培养盘12的左右两侧均开设有通槽，且培养盘12的顶端面前后两侧均开设有横向槽，并且培养盘12顶端所开设的横向槽与导块17相匹配，在隔板13的左右两侧面均固定连接有顶板15，顶板15中远离隔板13的一侧均与分区控制罩14相插接，分区控制罩14的内部含有温控器，在分区控制罩14的底端面固定连接有导块17，分区控制罩14通过导块17滑动连接在培养盘12之上，在分区控制罩14的前后两侧面均固定连接有折叠板16，且分区控制罩14与顶板15及折叠板16组成了封闭结构，在当培养盘12通过调节盘10的转动与箱体1外侧所固定连接的磁块b25的位置进行匹配时，通过导块17滑动连接在培养盘12之上的分区控制罩14会在磁块b25的排斥作用下解除对培养盘12的封闭，进而达到自动化调节的目的。
36.此外，根据本发明的实施例，如图1-图8所示，分区控制罩14为磁性材质，在箱体1的外侧固定连接有磁块b25，当磁块b25与分区控制罩14位置重合时，分区控制罩14为与隔板13相接触状态，在箱体1的内部固定连接有底板18，底板18用于封闭培养盘12的底端开口，且培养盘12与底板18共同组成了承载结构，底板18的一侧固定连接有风箱19，风箱19位于培养盘12的正下方位置，且风箱19的内部开设有通槽，并且风箱19中所开设的通槽与培养盘12的底端开槽相匹配，在风箱19的左右两侧均开设有贯通的纵向槽，且风箱19中左右两侧所开设的纵向槽与支架a21和支架b22相匹配。
37.所述共培养方法包括如下步骤：
38.将安装在导轴9底侧空余的培养盘12进行存放物品时，可以在当箱门2安装到箱体1的前侧位置并将箱体1处于封闭状态时，可以通过将安装在导轴9顶侧的调节盘10向下压动，使得调节盘10底侧所固定连接的导柱11与导轴9顶端所开设的插孔进行插接后，手动转动调节盘10，并通过导轴9带动着安装在隔板13底侧的培养盘12进行转动，使得培养盘12中开设有通槽的一侧朝向箱门2的一侧即可；
39.然后通过手动将箱门2向外侧进行拉动，首先安装在导杆5一侧的接触块6会与固定连接在箱体1之上的接近开关7进行脱离，此时安装在风箱19外侧的风机20处于开启状态，然后通过箱门2继续向外侧进行开启，使得安装在导杆5一侧的接触块6位于箱体1顶端
所固定连接的磁块a8的正上方位置，并通过磁块a8对接触块6的吸附使得箱门2在进行开启后可以有效的对其进行限位；
40.而在当接触块6位于磁块a8的正上方位置时，会同步的位于调节盘10的正下方位置，并通过接触块6的凸起将安装在导轴9顶侧的调节盘10向上顶起，使得调节盘10与导轴9处于脱离不可传动状态，此时无法再通过手动转动调节盘10而对箱体1内部所安装的培养盘12的位置进行调整，可以使得装置在使用时放入或取出物品都更加平稳，且有效的防止了误触而产生的不便；
41.此时滑动连接在风箱19内侧的托盘23会在支架a21和支架b22的牵引作用下沿着风箱19向下移动，当托盘23向下运动到与风箱19完全脱离后即可将物品放置到托盘23之上进行承载，然后再通过手动将箱门2与箱体1进行合拢关闭后即可自动化的利用托盘23的承载将物品导入到培养盘12的内部位置进行容纳，并且在当托盘23沿着风箱19进行上升或下降的过程中，安装在风箱19外侧的风机20都会通过向风箱19的内部吹风来将托盘23及其上方所放置的物品进行风淋除尘操作，进而达到尽量减少外部环境对箱体1内部的环境造成影响的目的；
42.而在当培养盘12的较窄一侧朝向箱门2的方向时，通过导块17滑动连接在培养盘12之上的分区控制罩14会因为失去了磁块b25的限位通过折叠板16的弹出对培养盘12进行封闭操作，使得箱门2在处于开启状态时，可以通过分区控制罩14对培养盘12的封闭来确保箱门2处于开启状态时培养盘12内部的培养物品不会因为外部环境的干涉而造成影响，进而达到更加实用的目的；
43.并且在当培养盘12通过调节盘10的转动与箱体1外侧所固定连接的磁块b25的位置进行匹配时，通过导块17滑动连接在培养盘12之上的分区控制罩14会在磁块b25的排斥作用下解除对培养盘12的封闭，进而达到自动化调节的目的。
44.除了具体的使用医用co2培养箱步骤之外，所述共培养方法的完整过程可以参照cn202210012502.0进行，即包括如下步骤：
45.实验材料：
46.细胞株：激活t细胞，人乳腺癌细胞株mda-mb-231、bt-549
47.试剂耗材：细胞毒性乳酸脱氢酶(ldh)测定试剂盒、t细胞培养基，细胞固定液、结晶紫溶液、细胞培养板
48.仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪
49.实验方法：
50.ldh实验：
51.(1)吸取100μl乳腺癌细胞(细胞数：5000)接种至96孔板，在37℃，5％co2培养箱内过夜预培养；
52.(2)向乳腺癌细胞中加入100μl含有20万t细胞的培养基，继续在37℃，co2培养箱内培养。
53.(3)在共培养后的乳腺癌细胞中加入10μl lysis buffer，在37℃,5％co2培养箱内孵育30min；
54.(4)在每个孔中加入100μl working solution，在避光、室温的条件下孵育10min；
55.(5)在每个孔中加入50μl stop solution，立刻使用酶标仪测定490nm波长时的吸
光度值。
56.(6)计算方法：
57.计算「样品孔-样品blank孔」「高对照孔-高对照blank孔」「低对照孔-背景blank孔」的吸光度后，算出n＝3的平均值。
58.细胞损伤率根据如下公式算出：
59.细胞损伤率(％)＝[(a-c)/(b-c)]
×
100
[0060]
a:样品的吸光度(样品孔-样品blank孔)
[0061]
b:高对照的吸光度(高对照孔-高对照blank孔)
[0062]
c:低对照的吸光度(低对照孔-背景blank孔)。
[0063]
结果：在乳腺癌细胞和t细胞共培养后，t细胞对gilt过表达的乳腺癌细胞的杀伤率明显高于对照组。
[0064]
结晶紫染色实验：
[0065]
(1)吸取500μl乳腺癌细胞(细胞数：1万)接种至24孔板，在37℃，5％co2培养箱内过夜预培养；
[0066]
(2)向乳腺癌细胞中加入2ml含有40万t细胞的培养基,继续在37℃,5％co2培养箱内培养5天；
[0067]
(3)吸弃培养基，使用pbs清洗3遍，使用细胞固定液固定细胞30min；
[0068]
(4)使用结晶紫溶液对固定后的细胞进行染色30min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥后拍照记录。
[0069]
实验结果：
[0070]
如图3和图4所示，在共培养后，与对照组相比，t细胞对gilt高表达的乳腺癌细胞的杀伤作用明显增加。
[0071]
除了具体的共培养以外，伽马干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶gilt在增强t细胞介导的抗肿瘤免疫反应中的应用的全部过程可以参照cn202210012502.0进行，包括模型的构建、t细胞分选与激活、gilt增强t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力、高表达gilt明显提高乳腺癌组织中浸润性t细胞的水平等。
[0072]
最后，需要说明的是，本发明在描述各个构件的位置及其之间的配合关系等时，通常会以一个/一对构件举例而言，然而本领域技术人员应该理解的是，这样的位置、配合关系等，同样适用于其他构件/其他成对的构件。
[0073]
以上所述仅是本发明的示范性实施方式，而非用于限制本发明的保护范围，本发明的保护范围由所附的权利要求确定。