用于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌RPA-LFS检测法的引物探针组合及其应用的制作方法

用于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌rpa-lfs检测法的引物探针组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及鲍曼不动杆菌检测领域，具体为用于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌rpa-lfs检测法的引物探针组合及其应用。


背景技术：

2.鲍曼不动杆菌是一种常见的院内感染病原体。鲍曼不动杆菌被世界卫生组织归类为最危险的细菌之一。此外，鲍曼不动杆菌对多种抗生素具有抗药性，因此，引起了微生物学家和医生的广泛关注。耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(crab)继续在全球迅速蔓延。根据碳青酶(oxa)的产生情况，鲍曼不动杆菌被分为五个相关的亚群。oxa-51是内在的，而oxa-143、oxa-58、oxa-40和oxa-23是后天的。carb对各种抗菌剂具有抗性，主要是由于产生了oxa和金属β-内酰胺酶。最常见的carb分离物产生oxa-23碳青霉烯酶。blaoxa-51基因是检测鲍曼不动杆菌的既定标记，而blaoxa-23基因是检测crab的既定标记。
3.快速检测crab可以促进早期治疗，并将感染的严重程度降到最低。已经报道了几种检测鲍曼不动杆菌的诊断方法，包括环路介导的等温扩增法(lamp)、聚合酶链反应(pcr)、定量pcr(qpcr)和基于培养的方法。尽管这些方法有独特的优势，但都受到时间要求、低灵敏度、需要热循环设备和对训练有素人员的依赖等限制。这些缺点可能抑制了这些方法在床边的日常监测中的应用。为了应对crab的广泛传播，建立一种简单、快速、准确和廉价的现场诊断方法非常重要。重组酶聚合酶扩增(rpa)是一种等温的dna扩增技术，于2006年首次报道，近年来被广泛使用。
4.rpa系统依靠重组酶(uvsx和uvsy)、单链结合蛋白(gp32)和链式置换dna聚合酶(bsu)进行核酸扩增。rpa反应不需要严格的孵化温度，因为指数扩增是在25-42℃的恒温下进行的，通常在37℃，反应在大约30分钟内完成。rpa的扩增产物可以用凝胶电泳、荧光检测器和侧流条(lfs)进行检测。然而，在实验室外，凝胶电泳和荧光检测的灵敏度是有限的。相反，lfs适用于简单的检测，检测结果可以直观地分析，而不需要复杂的热循环设备和经过培训的人员。可视化取决于探针的5'和3'端分别有一个异硫氰酸荧光素(fitc)标签和一个c3阻滞位点。在探针的中间，一个碱基也被四氢呋喃(thf)取代。探针与扩增链的结合是通过内切酶iv(nfo)的裂解开始的，它释放出探针的3'端进行延伸。使用生物素标记的反向引物，扩增产物的5'和3'端分别用fitc和生物素标记。lfs的共轭垫上的金纳米粒子标记(aunp标记)的抗fitc抗体可以与扩增产物结合，随后被涂有链霉蛋白的检测线捕获并聚集，如红色阳性信号所示。rpa-lfs检测在作为各种传染病的诊断性试验时，可以达到快速反应时间和良好的准确性。


技术实现要素：

5.本发明针对目前的耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(crab)检测方法，包括pcr、qpcr和lamp等方法，需要使用特定的设备，而这些设备在小型医院中并不容易获得。此外，用这些
方法获得结果需要很长的时间的缺陷，提出了一种rpa-lfs检测法。
6.本发明通过设计检测blaoxa-51和blaoxa-23基因的特异性引物和探针，用于rpa-lfs检测的引物和探针被设计为针对blaoxa-51基因的序列(国家生物技术信息中心(ncbi参考序列，kj584925.1)和blaoxa-23基因(ncbi参考序列：nc_025109.1)。正向和反向引物是用primer-basic local alignment search tool(blast)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计的。关键参数设置如下：产品的最小和最大尺寸分别为50和250bp；引物的最小和最大尺寸分别为31和35nt；鸟嘌呤-胞嘧啶(gc)的最小和最大含量分别为20％和70％。其他参数按默认设置应用。探针是用primer premier 5软件(premier biosoft,palo alto,ca,usa)根据所选引物对定义的区域序列设计的。探针的最小和最大尺寸为45和50bp，最小和最大熔解温度(tm)为50℃和100℃，最小和最大gc含量分别为20％和80％。此外，如果探针和引物有三个连续匹配的碱基，则对探针进行突变以避免假阳性结果。
7.选择目标基因blaoxa-51和blaoxa-23来检测crab。通过ncbiprimer-blast搜索选择了四个不同的引物对来检测blaoxa-51(blaoxa-51-f1/r1和blaoxa-f2/r2)和blaoxa-23(blaoxa-23-f1/r1和blaoxa-23-f2/r2)。rpa扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行分析。结果显示，当排除dna模板时，这四对引物没有产生明显的引物二聚体；引物组blaoxa-51-f2/r2和blaoxa-23-f2/r2被用来设计探针。对探针和blaoxa-51的反向引物之间可能的配对进行了分析，以确定假阳性信号的原因。如果探针和反向引物有三个或五个连续匹配的碱基，就可能导致假阳性信号。为了破坏连续匹配，在探针上替换了两个碱基(c《g和t《g)。同样，如果blaoxa-23的探针和反向引物共享三个或四个连续的匹配碱基，也会导致假阳性信号，因此在探针上替换了五个碱基(a《t，a《c，t《c，a《t和a《g)。下表列出了引物和修改后的探针的序列，其中碱基的替换以下划线标出。在rpa-lfs检测中使用这两个改良的引物-探针组可以防止没有dna模板控制(ntc)的假阳性信号。由于结果表明扩增没有受到影响，因此在本研究中使用了修改后的引物探针组。
[0008][0009][0010]
本发明建立了检测crab的准确的rpa-lfs检测方法。反应在37℃下30分钟内等温完成，10分钟后可在lfs上观察到结果。本发明使用rpa-lfs检测痰液中鲍曼不动杆菌，并通过检测鲍曼不动杆菌(不含oxa-23的blaoxa-51)和鲍曼不动杆菌(blaoxa-51和oxa-23)来
区分crab。可以确认crab的感染，以促进早期治疗和预防严重的疾病。
[0011]
本研究结果表明，碱基修饰对lod没有明显的影响，rpa-lfs检测法能准确地检测出鲍曼不动杆菌和crab。rpa-lfs检测的lod对于鲍曼不动杆菌是100cfu，对于crab是101cfu。这一灵敏度与实时rpa方法的灵敏度相同，即每个反应100-101cfu。此外，rpa-lfs检测crab的方法简单而快速，因为检测可以在40分钟内完成(30分钟用于扩增，10分钟用于lfs分析)。这种方法需要37℃的等温温度，用手加热就可以实现。按照相对简单的说明，检测结果可以在没有仪器设备的情况下轻松读取。相反，pcr、qpcr和lamp方法需要温度控制设备和相对较长的反应时间。实时rpa方法需要的时间比pcr短，但需要使用荧光检测器。实时rpa的总成本高于rpa-lfs测定的成本。对临床样本的评估表明，rpa-lfs测定的准确性很好。对不同患者样本的检测显示，用rpa-lfs检测阳性样本与qpcr的检测结果相当，表明rpa-lfs检测提出了一种可供选择的检测方法。此外，用于检测鲍曼不动杆菌和crab的两种lfs将来可以合并为一种lfs，这将减少成本。
[0012]
有益效果：本发明的rpa-lfs引物探针组合用于检测时简单、快速、准确，不需要实验室设施，并可与简单快速的dna提取方法(热煮)相结合，用于crab的家庭检测。及时的诊断可以促进鼻腔内鲍曼不动杆菌感染的早期治疗。
附图说明
[0013]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0014]
图1为引物-探针组的筛选；
[0015]
图2为引物-探针组的适用性；
[0016]
图3为引物-探针组的特异性；
[0017]
图4为rpa-lfs检测的lod。
具体实施方式
[0018]
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019]
实施例
[0020]
鲍曼不动杆菌和白色念珠菌来自美国类型培养物库(manassas,va,usa)。此外，10株鲍曼不动杆菌(blaoxa-51不含oxa-23)、10株鲍曼不动杆菌(blaoxa-23和oxa-23)菌株、其他鲍曼不动杆菌的分离物以及常见感染性病原体的分离物均由连云港市第二人民医院(中国连云港)提供。所有菌株的信息列于表1。所有分离物的身份都通过16s rrna pcr和qpcr确认。所有的菌株都在37℃的luria-bertani肉汤中培养，同时以200rpm的速度摇动。将107个菌落形成单位(cfu)/μl的培养物在100℃下煮沸10分钟作为dna模板。如前所述，通过qpcr确认这些dna模板来自于相应的病原体。用16s rrna引物扩增的pcr产物由通用生物系统有限公司进行测序和确认(安徽，中国)。
[0021]
表1 菌株信息
[0022][0023][0024]
(atcc,american type culture collection,manassas,va,usa)
[0025]
引物和探针的设计
[0026]
rpa-lfs程序
[0027]
rpa反应是按照twistdna扩增nfo试剂盒(twistdx ltd.,maidenhead,uk)的制造商说明进行。每个25μl的反应混合物包含1.05μl的每个引物(10μm)，0.3μl的探针(10μm)，1.0μl的模板，以及其他标准反应成分。引物和探针是由安徽通用生物技术有限公司合成的。为了启动反应，加入1.25μl的醋酸镁(280mm)，反应混合物在37℃下孵育30分钟。然后，将5μl扩增产物点在lfs(优思达生物科技有限公司，中国杭州)上。lfs由样品垫、金标抗体垫(用小鼠源性aunp标记的抗fitc抗体浸泡)、测试线(涂有链霉亲和素)、对照线(涂有抗小鼠抗体)和吸收垫组成，通过溶剂迁移途径排列。将rpa扩增产物加入到lfs的样品垫中，并将lfs插入到100μl的溶剂中约2分钟，直到测试线和对照线被目测。
[0028]
qpcr程序
[0029]
检测鲍曼不动杆菌和crab的方法与以前的报道相同(mart
í
n et al.,2013)。引物blaoxa-51-qf(5'-gca acc acc aca gaa g-3')和blaoxa-51-qr(5'-tcc aat acg acg agc t-3')用于检测鲍曼不动杆菌，而引物blaoxa-23-qf(5'-atc gga ttg gag aac c-3')和blaoxa-23-qr(5'-cct gat aga ctg gga ct-3')用于检测crab。
[0030]
当排除dna模板时，这四对引物没有产生明显的引物二聚体(图1中a处)。引物组blaoxa-51-f2/r2和blaoxa-23-f2/r2被用来设计探针。对探针和blaoxa-51的反向引物之间可能的配对进行了分析，以确定假阳性信号的原因。如果探针和反向引物有三个或五个连续匹配的碱基，就可能导致假阳性信号(图1中b处)。为了破坏连续匹配，在探针上替换了两个碱基(c《g和t《g)。同样，如果blaoxa-23的探针和反向引物共享三个或四个连续的匹配碱基，也会导致假阳性信号(图1中c处)，因此在探针上替换了五个碱基(a《t，a《c，t《c，a《t和a《g)。表2列出了引物和修改后的探针的序列，其中碱基的替换以下划线标出。在rpa-lfs检测中使用这两个改良的引物-探针组可以防止没有dna模板控制(ntc)的假阳性信号。由于结果表明扩增没有受到影响(图1中d处)，因此在本研究中使用了修改后的引物探针组。
[0031]
图1.引物-探针组的筛选。a处为针对blaoxa-51和blaoxa-23的四个不同引物组的rpa结果。每套引物的名称显示在每个泳道的顶部。反应中使用了ntc。所有反应在37℃下进行30分钟。图片代表了三个独立实验的结果。b处和c处用primer premier 5软件对用于检测blaoxa-51和blaoxa-23的引物-探针组进行配对分析和序列修饰。探针和引物的相关dna碱基被排除。dna链显示为水平线，匹配的碱基用垂直线表示。分子标记列在c处下。d处为rpa-lfs检测的引物-探针组的有效性。每套引物的名称显示在每个泳道的顶部。反应中使用了ntc。测试线和对照线的位置在右边显示。所有反应在37℃下进行30分钟。图1代表了三个独立实验的结果。
[0032]
rpa-lfs检测对blaoxa-51和blaoxa-23的适用性
[0033]
为了确定rpa-lfs检测对特异性检测blaoxa-51和blaoxa-23的适用性，使用了20个来自痰液的鲍曼不动杆菌(blaoxa-51无oxa-23)和鲍曼不动杆菌(blaoxa-51无oxa-23)分离物作为模板(107cfu)。使用两套引物探针(blaoxa-51-f3/p/r2b和blaoxa-23-f3/p/r2b)检测鲍曼不动杆菌(不含oxa-23，只含blaoxa-51)表明，针对blaoxa-23基因的引物探针组没有产生阳性信号，而只有针对blaoxa-51基因的引物探针组获得阳性信号，ntc没有产生假阳性信号(图2中a处)。然后，引物探针组blaoxa-51-f3/p/r2b和blaoxa-23-f3/p/r2b被用来检测10例鲍曼不动杆菌(blaoxa-51和oxa-23)分离物。所有rpa-lfs反应都产生了阳性信号，没有ntc。这些结果表明，引物探针组blaoxa-51-f3/p/r2b和blaoxa-23-f3/p/
rb可以有效区分分别编码blaoxa-51和blaoxa-23基因的菌株(图2中b处)。本研究中使用的引物-探针组的适用性被认为是良好的。
[0034]
图2.引物-探针组的适用性。(a)图像显示了rpa-lfs检测对10个a.baumannii(blaoxa-51，不含oxa-23)分离物，使用引物探针组blaoxa-51-f3/r2b/p(#1-1,#2-1,#3-1,#4-1,#5-1,#6-1,#7-1,#8-1,#9-1,#10-1)和blaoxa-23-f3/r2b/p(#1-2,#2-2,#3-2,#4-2,#5-2,#6-2,#7-2,#8-2,#9-2,#10-2)。(b)图片显示了rpa-lfs检测对10个a.baumannii(blaoxa-51和oxa-23)分离物，使用引物探针组blaoxa-51-f3/r2b/p(#1-1,#2-1,#3-1,#4-1,#5-1,#6-1,#7-1,#8-1,#9-1,#10-1)和blaoxa-23-f3/r2b/p(#1-2,#2-2,#3-2,#4-2,#5-2,#6-2,#7-2,#8-2,#9-2,#10-2)。ntc-1，使用引物探针组blaoxa-51-f3/r2b/p，无模板控制。ntc-2，无模板控制，引物探针组blaoxa-23-f3/r2b/p。每条泳道的顶部显示了每组的名称。测试线和对照线的位置显示在右边。所有反应在37℃下进行30分钟。图片代表了三个独立实验的结果。
[0035]
rpa-lfs检测blaoxa-51的特异性
[0036]
用rpa-lfs检测法对引物探针组blaoxa-51-f3/p/r2b的特异性进行了测试，使用从痰中分离的微生物的不同样本模板。还测试了白色念珠菌和鲍曼不动杆菌的参考菌株(表1)。模板的数量被设定为107cfu。引物-探针组blaoxa-51-f3/p/r2b显示出良好的特异性(图3)。针对blaoxa-51基因的引物-探针组blaoxa-f3/p/r2b具有高度的特异性，因此，在研究的其余部分都使用了该引物-探针组。
[0037]
图3显示了使用引物探针组blaoxa-51-f3/r2b/p对不同细菌模板进行rpa-lfs检测的结果。每个反应中使用的细菌名称显示在每个泳道的顶部。ntc，无模板对照。测试线和对照线的位置在右边表示。所有的反应都在37℃下进行30分钟。图片代表了三个独立实验的结果。
[0038]
rpa-lfs检测blaoxa-51和blaoxa-23基因的检测限(lod)
[0039]
首先用纯的鲍曼不动杆菌(blaoxa-51不含oxa-23)确定检测限。模板的数量以10
7-100cfu/μl进行测试(每个反应为1μl)。rpa-lfs检测的结果显示，lod为每个反应100cfu(图4中a处)。为了模拟复杂的污染条件，将纯鲍曼不动杆菌(不含oxa-23的blaoxa-51)与107cfu/μl的鲍曼不动杆菌和大肠杆菌o157混匀。此外，用rpa-lfs检测法测试10
7-100cfu/μl污染的鲍曼尼不动杆菌(不含oxa-23的blaoxa-51)。结果表明，rpa-lfs检测可以容忍其他细菌的干扰，lod为100cfu/μl(图4中b处)。因此，blaoxa-51基因的rpa-lfs检测的lod是100cfu。然后，使用引物探针组blaoxa-23-f3/p/r2b对10
7-100cfu/μl的鲍曼不动杆菌(blaoxa-51和oxa-23)进行了rpa-lfs检测的lod(每个反应1μl)。结果显示，lod是每个反应的101cfu(图4中c处)。此外，加入107cfu/μl的鲍曼不动杆菌(blaoxa-51和oxa-23)和大肠杆菌o157的lod也是101cfu/μl(图4中d处)。
[0040]
图4中a处图片显示了使用引物-探针组blaoxa-51-f3/r2b/p对不同cfu的鲍曼不动杆菌(blaoxa-51)进行rpa-lfs检测的结果。b处图片显示了使用引物探针组blaoxa-51和107cfu的大肠杆菌o157的rpa-lfs检测的结果。c处图片显示了使用引物-探针组blaoxa-23-f3/r2b/p对不同cfu的鲍曼氏菌(blaoxa-23)进行rpa-lfs检测的结果。d处图片显示了使用引物探针组blaoxa-23-f3/r2b/p对不同cfu的鲍曼不动杆菌(blaoxa-23)和107cfu的大肠杆菌o157进行rpa-lfs检测的结果。ntc，无模板对照。所有反应在37℃下进行30分钟。
cfu在条形图的顶部表示。测试线和对照线的位置在右边表示。图片代表了三个独立实验的结果。
[0041]
应用rpa-lfs检测临床样品中的blaoxa-51和blaoxa-23基因
[0042]
为了模拟实际应用，用213个临床样品评估了rpa-lfs检测。所有样本都用rpa-lfs检测了blaoxa-51和blaoxa-23基因，并与qpcr进行比较。rpa-lfs的检测结果与qpcr的检测结果一致。此外，结果显示，blaoxa-23的检测率为44.6％，相对较高(表3)。
[0043]
表3 prevalence of carbapenemase genes in 213 clinical samples of a.baumannii using rpa-lfs and pcr(summarized).
[0044][0045]
(n:number)
[0046]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。