快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法与流程

1.本发明属于噬菌体检测技术领域，尤其涉及一种快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法。


背景技术：

2.大肠杆菌属于条件致病菌，致病力的强弱与大肠杆菌的血清型有关，不同动物之间也存在差异性。其中，猪大肠杆菌病和鸡大肠杆菌病是在养殖环境中广泛存在的，一旦染病会引起腹泻、明显影响动物机体的增重，使动物群体的死亡率急剧上升，发病动物还可以通过粪便等途径传染给其它健康的养殖动物造成大面积感染，而且养殖环境中的猪源和鸡源大肠杆菌会造成动物群体的持续感染，给养殖户造成很大的经济损失。
3.噬菌体是一种细菌依赖性病毒，能够特异性的裂解宿主细菌，且与抗生素杀菌的作用机制不同，噬菌体裂解细菌不受细菌耐药性的影响，且无残留，具有研发时间短、成本低、特异性强、给药量少、不破坏正常菌群构成等优点，在耐药菌的防治工作中已取得一系列可喜成果。同时，噬菌体在有肠道病毒污染的水体中普遍存在，且数量甚多，对水体净化和消毒处理的抵抗力至少与肠道病毒相当；同时其不会在水中繁殖，不具有致病性，可以通过简单、快速、低廉的方法检测。
4.随着分子生物学技术的迅速发展，以聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction，pcr)为基础的各种分子生物学诊断技术已经成为生物医学领域内最有价值的研究手段。但是，现有分子生物学检测方法存在样品杂质去除不干净，引物、探针设计不合理，仪器控温程序不正确，或不能精确控温等问题。因此，亟需设计一种新的能够快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法，以弥补现有技术的缺陷。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：常规检测噬菌体的方法是将噬菌体点滴到含有大肠杆菌的固体培养基上，培养12～24h后观察有无噬菌斑，缺点是检测成本高，且每个细菌必须做一个平板，若要检测某一份样品中是否含有大量不同株细菌的噬菌体，则需要制作大批量的固体平板后点滴，每个平板仅点滴一个，耗时耗力又浪费培养基。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：目前除常用的平板点滴噬菌体的方法，未见有其他方法的广泛应用，即使尝试使用目前发展较快的pcr技术检测噬菌体存在仍有较大问题未解决，首先需要提取噬菌体基因组，但由于噬菌体侵染细菌的特殊性，所提取出的基因组常带部分有宿主基因组，造成模板不纯；另外国内外对于噬菌体的保守区段研究较少，设计针对噬菌体的引物难度较大，目前暂时无法通过分子手段检测噬菌体存在。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：缩减检测时间，提高效率；减少检测试剂与培养基使用，节约资源。


技术实现要素：

8.为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法。所述技术方案如下：
9.一种快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法，所述快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法包括：
10.将待测样品与待分离噬菌体的宿主菌共培养2h后离心过滤，取无菌96孔板，加入lb液体培养基后，将目的菌液与样品过滤液加入样品孔后共培养，并设目的菌液对照孔、空白对照孔，37℃恒温培养箱培养4h，计算样品孔od620与各自菌液对照孔od620的比值，小于临界值的样品孔视为本次样品中含有目的菌的噬菌体，大于等于临界值的样品孔视为本次样品中不含目的菌的噬菌体。
11.在一个实施例中，所述快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法包括以下步骤：
12.步骤一，将样品加入10ml离心管中，加入lb液体培养基，再加入待分离噬菌体的宿主菌，摇床培养，离心，取上清液，用滤膜过滤，得到样品过滤液；
13.步骤二，在无菌96孔板各孔中加入灭菌lb液体培养基，每孔加入目的菌液、样品过滤液，菌液对照孔每孔加入对应菌液；
14.步骤三，将96孔板转移至37℃恒温培养箱，培养4h后，在空白对照孔未变浑浊的前提下计算样品孔判定值；
15.步骤四，计算样品判定值：样品判定值＝每个样品孔od620值/该样品孔的菌液对照孔od620值。
16.在一个实施例中，所述步骤一中的样品包括粪便、污水、垫料和土壤。
17.在一个实施例中，所述步骤一中的样品为1g，所述lb液体培养基为5ml，所述待分离噬菌体的宿主菌为200μl。
18.在一个实施例中，所述步骤一中的摇床培养条件为：37℃，180rpm摇床培养2h。
19.在一个实施例中，所述步骤一中的离心条件为：12000rpm/min离心10min；所述滤膜为0.22μm。
20.在一个实施例中，所述步骤二中的灭菌lb液体培养基为200μl，所述目的菌液为2μl，所述样品过滤液为2μl，所述菌液对照孔每孔加入对应菌液22μl。
21.在一个实施例中，所述步骤二中，空白对照孔仅加入200μl的lb液体培养基。
22.在一个实施例中，所述步骤四中，当样品判定值小于等于0.5时，表示该样品中含可应用于生产的特定菌的噬菌体；当样品判定值大于0.5时，则表示不含可应用于生产的特定菌的噬菌体。
23.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法，能够快速简便的检测样品中是否含有特定大肠杆菌噬菌体，采用约登指数(敏感度+特异性-1)评价临界值可靠程度，约登指数越大，可靠性越好。结果发现，约登指数最大为0.864，所对应临界值为0.5055，因此最佳判定值为0.5。
附图说明
24.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
25.图1是本发明实施例提供的快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方
法流程图；
26.图2是本发明实施例提供的临界值确定试验p286点滴结果示意图；
27.图3是本发明实施例提供的临界值确定试验混合p点滴结果示意图；
28.图4是本发明实施例提供的敏感性试验点滴结果示意图；
29.图5是本发明实施例提供的敏感性试验点滴结果示意图。
具体实施方式
30.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
31.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
32.如图1所示，本发明实施例提供的快速简便检测污水等样品中特定大肠杆菌噬菌体的方法包括以下步骤：
33.s101，将样品加入10ml离心管中，加入lb液体培养基，再加入待分离噬菌体的宿主菌，摇床培养，离心，取上清液，用滤膜过滤，得到样品过滤液；
34.s102，在无菌96孔板各孔中加入灭菌lb液体培养基，每孔加入目的菌液、样品过滤液，菌液对照孔每孔加入对应菌液；
35.s103，将96孔板转移至37℃恒温培养箱，培养4h后，在空白对照孔未变浑浊的前提下计算样品孔判定值；
36.s104，计算样品判定值：样品判定值＝每个样品孔od620值/该样品孔的菌液对照孔od620值。
37.本发明所用菌种为本实验室在聊城地区某养殖场采集的病料所分离纯化得到，保存在实验室-80℃冰箱；噬菌体为养殖场粪便与垫料中分离纯化鉴定得到。
38.大肠杆菌噬菌体的请求保藏人为：聊城大学李玉保，保藏地址：中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学；保藏名称：大肠杆菌噬菌体sdlc-p286，分类命名：escherichia coli phage sdlc-p286，保藏中心保藏编号cctcc no：m 2022033，保藏日期：2022年01月07日，检测结果为：存活。
39.大肠杆菌的请求保藏人为：聊城大学李玉保，保藏地址：中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学；保藏名称：大肠杆菌sdlc-e324，分类命名：escherichia coli sdlc-e324，保藏中心保藏编号cctcc no：m 2022034，保藏日期：2022年01月07日，检测结果为：存活。
40.本发明涉及噬菌体检测方法领域，提供了一种样品中大肠杆菌噬菌体的检测方法并进行应用。首先将待测样品离心过滤，取无菌96孔板，加入lb液体培养基，随后将目的菌液与样品过滤液加入样品孔后共培养，并设目的菌液对照孔、空白对照孔，37℃恒温培养箱培养4h，计算样品孔od620与各自菌液对照孔od620的比值，小于临界值的样品孔视为本次样品中含有目的菌的噬菌体，大于等于临界值的样品孔视为本次样品中不含目的菌的噬菌体。
41.本发明实施例提供的具体技术方案如下：
42.1.样品(粪便、污水、垫料、土壤等)1g加入10ml离心管中，加入5ml lb液体培养基，再加入待分离噬菌体的宿主菌200微升，37℃，180rpm摇床培养2h，12000rpm/min离心10分钟，取上清液，用0.22微米滤膜过滤，得到样品过滤液。
43.2.在无菌96孔板各孔中加入200微升灭菌lb液体培养基，每孔加入目的菌液2微升、样品过滤液2微升，菌液对照孔每孔加入对应菌液2微升，空白对照孔仅加入200微升lb液体培养基。
44.3.将96孔板转移至37℃恒温培养箱，培养4h后，在空白对照孔未变浑浊的前提下计算样品孔判定值。
45.4.计算方法：
46.样品判定值＝每个样品孔od620值/该样品孔的菌液对照孔od620值；
47.样品判定值小于等于0.5时表示该样品中含可应用于生产的特定菌的噬菌体，大于0.5则表示不含可应用于生产的特定菌的噬菌体。
48.下面结合证明支持材料部分对本发明的技术方案作进一步描述。
49.1.样品判定值确定
50.取灭菌96孔板，取50株大肠杆菌，每孔加入菌液2微升，lb液体200微升，噬菌体混合物2微升，37℃培养4h后，使用酶标仪检测od620值，同时使用相同菌液与噬菌体液进行噬菌体点滴实验，取若干lb固体平板，将菌液200微升与融化并冷却至50℃左右的lb半固体混合后倒入下层lb固体，待冷却凝固后，滴加2微升噬菌体液，超净台吹干后，37℃培养12h后观察并记录点滴结果。
51.使用spss 25.0对统计的od620值与点滴结果进行roc曲线分析，确定样品临界值，以样品孔od620值为检验变量，点滴有噬菌斑赋值为1，无噬菌斑赋值为0，作为状态变量，以0为状态变量值，采用约登指数(敏感度+特异性-1)评价临界值可靠程度，约登指数越大，可靠性越好。
52.结果发现，约登指数最大为0.864，所对应临界值为0.5055，因此最佳判定值为0.5(见表1)。
53.表1样品判定值确定结果
54.55.[0056][0057]
2.样品敏感性测试
[0058]
2.1将单噬菌体(p286)及噬菌体混合物10倍梯度稀释，稀释至10～104倍，设五次重复，每孔加入宿主菌e3242微升，单噬菌体或混合物2微升，200微升lb液体，37℃培养4h，同时在e324的双层平板上点滴单噬菌体(p286)与混合噬菌体各2微升，37℃培养12h，统计od620值与点滴结果进行分析(见表2和表3)。
[0059]
表2 p286不同稀释度od620值
[0060][0061]
表3混合p不同稀释度od620值
[0062]
[0063][0064]
结果表明：该方法对对富集后的单噬菌体的敏感性良好，判定结果与点滴结果一致，可检测到1000倍稀释的噬菌体。但对噬菌体混合物，虽与点滴结果一致，但敏感性差，仅可检测到原倍噬菌体，因此在应用此方法时应对噬菌体进行简短富集(见图2和图3)。
[0065]
2.2将单噬菌体p286与噬菌体混合物10倍梯度稀释至10-10
，将稀释后的噬菌体液与大肠杆菌e324各200微升加入到含有5ml lb液体培养基的10ml离心管中，37℃180rpm摇床培养2h，12000rpm离心5min，0.22微米滤膜过滤。取无菌96孔板，每孔加入宿主菌e3242微升，单噬菌体或混合物2微升，200微升lb液体，37℃培养4h，同时在e324的双层平板上点滴单噬菌体(p286)与混合噬菌体各2微升，37℃培养12h，统计od620值与点滴结果进行分析(见表4、图4和图5)。
[0066]
表4 od620值与点滴结果
[0067]
[0068][0069]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。