一种近红外荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于有机化合物及其制备的技术领域，具体为一种近红外荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.1,4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)以及它的磷酸酯(nadph)是维持细胞内氧化还原稳态所必需的辅酶。它们作为一种电子载体，与氧化还原酶紧密相关，并参与糖酵解、柠檬酸循环、β-氧化等代谢途径中重要的氧化还原反应。nad(p)h是能量代谢的重要产物，与癌症的发生密切相关。因此，寻找一种合适的方法实现对nad(p)h水平的检测至关重要。
3.目前，已经开发了很多用于体外检测nad(p)h的方法，如电泳、酶法和荧光成像方法，如基因编码蛋白、纳米颗粒、小分子探针等。其中，小分子荧光探针因具备很多优点而受到广泛关注，如制备简单、使用方便、细胞渗透性好、毒性低、适合体内实验等。但是，大多数探针为关闭型荧光探针，且无法应用于活细胞成像，甚至是活体成像。因此，开发一种打开型、可用于活细胞成像以及活体成像的荧光探针具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对现有检测nad(p)h的小分子荧光探针存在的缺陷，本发明提供了一种近红外荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针是本技术发明人在前期研究中，发现基于苯并吡喃嗡盐骨架的小分子探针可以对nad(p)h有所响应。因此，通过一系列有机合成反应完成了该化合物荧光探针的设计与合成，并对其进行了紫外吸收和荧光测试，随后，还在细胞共聚焦以及活体实验中发现可以检测到nad(p)h。
5.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
6.本发明提供一种近红外荧光探针，所述探针为3-(9-(2-((乙酰氧基甲氧基)羰基)苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基亚甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-高氯酸盐三氟甲磺酸酯，其结构式为：
[0007][0008]
本发明还提供一种上述近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤:
[0009]
步骤1，将4-二乙氨基酮酸与环己酮、浓硫酸、高氯酸反应生成9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐；
[0010]
步骤2，将步骤1生成的9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐与3-喹啉甲醛反应生成9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-4-(喹啉-3-亚甲基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐；
[0011]
步骤3，将步骤2生成的9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-4-(喹啉-3-亚甲基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐与三氟甲烷磺酸甲酯反应生成3-(9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-过氯酸盐三氟甲磺酸酯；
[0012]
步骤4，将步骤3生成的3-(9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-过氯酸盐三氟甲磺酸酯与溴乙酸甲酯反应生成3-(9-(2-((乙酰氧基甲氧基)羰基)苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基亚甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-高氯酸盐三氟甲磺酸酯，即得到所述近红外荧光探针。
[0013]
进一步，所述制备方法具体为：
[0014]
步骤1，在0℃下将环己酮逐滴加入到质量分数为98％浓硫酸中并进行搅拌，然后分批加入4-二乙氨基酮酸，在90℃～120℃条件下继续搅拌，待反应进行3～5h后停止反应，将最终反应混合物倒入0℃水中，加入质量分数为70％高氯酸，将析出的沉淀物进行抽滤，并用0℃水洗涤后得到橙红色固体化合物，即9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐；
[0015]
步骤2，向反应容器中依次加入9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐、3-喹啉甲醛和哌啶，再加入无水乙醇溶解，将溶解后的混合物加热到80℃进行回流，反应过夜，待反应结束，温度恢复到室温后，将其冷却至0℃放置2～4h，析出紫色固体，随后用叔丁基甲基醚洗涤固体，待固体干燥后得到化合物：9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-4-(喹啉-3-亚甲基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐；
[0016]
步骤3，在二氯甲烷中先加入三氟甲烷磺酸甲酯，再加入9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-4-(喹啉-3-亚甲基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐，室温搅拌3h，停止反应，冷却析出紫色固体，进行抽滤后，用二氯甲烷洗涤，干燥后得到化合物：3-(9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-过氯酸盐三氟甲磺酸酯；
[0017]
步骤4，将3-(9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-过氯酸盐三氟甲磺酸酯和n,n-二异丙基乙胺加入到反应容器中，再加入乙腈混合均匀，随后向混合溶液加入溴乙酸甲酯，在氩气保护下搅拌48h，经柱色谱分离得到化合物：3-(9-(2-((乙酰氧基甲氧基)羰基)苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基亚甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-高氯酸盐三氟甲磺酸酯，即得到所述近红外荧光探针。
[0018]
更进一步，所述步骤1中环己酮、质量分数为98％浓硫酸、4-二乙氨基酮酸、质量分数为70％高氯酸用量的体积：体积：质量：体积＝6.6ml：72ml：9.82g：7.9ml；将最终反应混合物倒入200ml的0℃水中。
[0019]
所述步骤2中9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐、3-喹啉甲醛、哌啶、无水乙醇的质量：质量：体积：体积＝2g：1g：0.04ml：35ml。
[0020]
所述步骤3中二氯甲烷、三氟甲烷磺酸甲酯、9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-4-(喹啉-3-亚甲基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐用量的体积：体积：质量＝108ml：1.2ml：1.53g。
[0021]
所述步骤4中3-(9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基甲基-4(1h)-亚甲
基)-1-甲基喹啉-1-过氯酸盐三氟甲磺酸酯、n,n-二异丙基乙胺、乙腈、溴乙酸甲酯用量的质量：体积：体积：体积＝60mg：0.124ml：2ml：0.1ml。
[0022]
进一步，所述步骤1和步骤3中的抽滤用减压真空泵，所述步骤4中柱色谱的流动相为体积比为二氯甲烷：甲醇＝8:1。
[0023]
本发明还提供一种上述近红外荧光探针的应用，用于制备检测1,4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以及其磷酸酯的试剂。
[0024]
与现有技术相比本发明具有以下优点：
[0025]
1、本发明提供了一种打开型荧光探针，具有较高的信噪比。
[0026]
2、本发明提供了一种基于苯并吡喃嗡盐骨架的小分子探针，该探针合成路线简单，原料易得，成本较低。
[0027]
3、本发明小分子探针可以与nad(p)h响应，对nad(p)h具有很高的选择性，发射波长可达745nm左右，可为后续分子探针的结构优化奠定基础。
[0028]
4、本发明提供了小分子探针的生物应用，由于其较长的发射波长，使其在细胞和小鼠实验中均得以利用，有助于癌症的后续研究。
附图说明
[0029]
图1是本发明探针的核磁共振的氢谱图；
[0030]
图2是本发明探针的核磁共振的碳谱图；
[0031]
图3是本发明探针的高分辨质谱；
[0032]
图4是本发明探针的光谱测试图；
[0033]
图5是本发明探针在不同活细胞中检测nad(p)h的细胞成像图；
[0034]
图6是本发明探针在不同葡萄糖浓度下hela细胞的细胞成像图；
[0035]
图7是本发明探针的小鼠活体成像图。
具体实施方式
[0036]
下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
[0037]
实施例1
[0038]
一种近红外荧光探针的制备：
[0039]
1)化合物2的制备
[0040]
向200ml烧瓶中加入质量分数为98％浓硫酸(72ml)，接着在0℃下将环己酮(6.6ml，64mmol)逐滴加入到98％浓硫酸(72ml)中并进行搅拌，然后分批次加入4-二乙氨基酮酸(9.82g，32mmol)，将混合物在90℃条件下搅拌。待反应进行3小时后停止反应。将最终反应混合物倒入0℃水(200ml)中，加入质量分数为70％高氯酸(7.9ml)，将析出的沉淀物通过减压真空泵进行抽滤，并用0℃水洗涤三次，得到橙红色固体化合物2(15g)，即9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐，产率为98％。
[0041][0042]
2)化合物3的制备
[0043]
向50ml烧瓶中依次加入化合物2(2g，4.2mol)，3-喹啉甲醛(1g，6.3mol)和哌啶(40μl)，再加入一定量的溶剂无水乙醇(35ml)使化合物溶解，最终混合物加热至80℃进行回流，反应过夜，待反应结束，温度恢复到室温后，将其冷却至0℃放置2小时，析出紫色固体，随后用叔丁基甲基醚洗固体3次，待固体干燥后得到化合物3(1.5513g)，即9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-4-(喹啉-3-亚甲基)-1,2,3,4-四羟基高氯酸盐，产率为61％。
[0044][0045]
3)化合物4的制备
[0046]
在二氯甲烷(108ml)中加入三氟甲烷磺酸甲酯(1200μl，10.2mol)，再加入化合物3(1.53g，2.5mol)，室温搅拌3小时，停止反应，冷却析出紫色固体，用减压真空泵进行抽滤，用二氯甲烷洗三次，干燥后得到化合物4(0.9133g)，即3-(9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-过氯酸盐三氟甲磺酸酯，产率为58％。
[0047][0048]
4)化合物1(探针)的制备
[0049]
将化合物4(60mg，0.097mmol)和n,n-二异丙基乙胺(124μl，0.75mmol)加入到10ml圆底烧瓶中，再加入乙腈(2ml)混合均匀，随后，向混合溶液加入溴乙酸甲酯(100μl，1.02mmol)，在氩气保护下搅拌48小时，经柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝8:1，体积比)分离得到化合物1，即3-(9-(2-((乙酰氧基甲氧基)羰基)苯基)-6-(二乙氨基)-2,3-二羟基亚甲基-4(1h)-亚甲基)-1-甲基喹啉-1-高氯酸盐三氟甲磺酸酯(近红外荧光探针)，产率为22％。
[0050][0051]
图1为本实施例探针的核磁共振的氢谱图，从图1可得：
[0052]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ9.09(s,1h),8.96(s,1h),8.39(d,j＝6.7hz,1h),8.28(d,j＝7.8hz,1h),8.20(t,j＝7.0hz,1h),8.07(s,1h),7.98(t,j＝7.1hz,1h),7.84(t,j＝7.8hz,1h),7.73(t,j＝7.6hz,1h),7.28(s,2h),7.26(d,j＝7.4hz,1h),7.10(d,j＝9.7hz,1h),7.01(d,j＝9.6hz,1h),5.77
–
5.73(m,2h),4.94(s,3h),4.29(s,4h),4.20
–
4.11(m,2h),3.84(s,2h),3.43(s,3h),3.37(s,2h),2.24(s,6h).
[0053]
图2为本实施例探针的核磁共振的碳谱图，从图2可得：
[0054]
13c nmr(151mhz,cdcl3)δ169.3,167.9,163.6,161.6,158.8,156.4,152.3,137.2,136.5,134.5,134.1,133.8,132.7,131.8,130.6,130.6,130.3,129.8,129.7,129.7,129.1,129.0,127.8,123.7,118.8,118.7,118.0,98.2,86.7,80.0,62.5,54.2,53.4,42.4,29.6,14.0,12.1,10.5.
[0055]
图3为本实施例探针的高分辨质谱图，从图3可得：
[0056]
hrms(esi)[m]
2+
calculated for c
38h38
n2o5:301.1390,found:301.1387。
[0057]
实施例2
[0058]
对实施例1制得的荧光探针进行光谱测试：
[0059]
该测试是在体系pbs：ch3ch2oh＝3：2(体积比)进行的，探针配制的母液浓度为2mm，nadh和nadph的母液浓度均为20mm。(所有测试均控制温度在37℃进行)
[0060]
测试结果如图4所示。图4中(a)为化合物1(10μm，pbs：ch3ch2oh，体积比3：2)加入100μm nadh后随时间的推移紫外吸收的变化；(b)为化合物1(10μm，pbs：ch3ch2oh，体积比3：2)的荧光强度随nadh浓度(0-100μm)的变化；(λex＝680nm，狭缝：10nm/10nm)；(c)为化合物1(10μm，pbs：ch3ch2oh，体积比3：2)加入100μm nadh后随时间的增加，荧光光谱的变化；(d)为化合物1(10μm)在pbs和ch3ch2oh(体积比3：2)混合溶剂中加入100μm nadh的动力学曲线；(λex＝680nm，狭缝:10nm/10nm)；(e)为化合物1(10μm)在不同浓度nadh存在下的工作曲线；(f)为化合物1(10μm，pbs：ch3ch2oh，体积比3：2)与各种离子、氨基酸以及酶在37℃水浴中反应2.5小时后在745nm的荧光强度；横坐标a至w分别代表200μm k
+
，na
+
，ca
2+
，mg
2+
，f-，br-，no
2-，oh-，hso
3-，so
32-，scn-，h2o2，vc，cys，hcy，gsh，lys，asn，脂肪酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，nadph，nadh。
[0061]
从图4中可以看出，探针的紫外吸收峰在556nm处，加入nadh后，在723nm出现一个新的吸收峰，并且随着时间的增加，在556nm处的紫外吸收逐渐下降，在723nm的紫外吸收逐渐升高(a)，说明该探针能对nadh响应。随后，用680nm作为探针的激发波长，当加入不同浓度的nadh(0-100μm)，发现745nm处的荧光强度逐渐增强(b)，说明该探针对nadh的响应呈浓度依耐性，加入100μm nadh后，随着时间的推移，荧光强度也逐渐增强(c和d)，说明该探针对一定浓度nadh的相应呈时间依耐性。图(e)中曲线的r2＝0.99，表明该探针用于检测nadh
具有很好的线性关系。从图(f)可以看出：同样条件下检测nadph和nadh的荧光强度远高于其它物质，表明本发明荧光探针对nadph和nadh具有很好的选择性。同时，图4的结果也表明本发明荧光探针属于打开型荧光探针，具有较高的信噪比。
[0062]
实施例3
[0063]
细胞实验：对实施例1制得的荧光探针进行细胞实验
[0064]
(1)不同活细胞中nad(p)h的共聚焦荧光检测
[0065]
图5为在不同活细胞中检测nad(p)h的细胞成像图。其中：(a)为用10μm的化合物1分别孵育正常细胞(7702)、人宫颈癌细胞(hela)、人肝癌细胞(hepg2)1小时后的成像结果。(b)为正常细胞(7702)、人宫颈癌细胞(hela)、人肝癌细胞(hepg2)三种类型细胞的平均荧光强度；正常细胞(7702)作为对照组定义为1.0，数据表示为平均值
±
sd(n＝3)。
[0066]
在细胞实验中发现(图5)，当将探针加入正常细胞(7702)、人宫颈癌细胞(hela)、人肝癌细胞(hepg2)中，都会有红色荧光产生，但hela和hepg2细胞中的荧光强度要相对高于正常细胞(7702)。说明化合物1(本发明荧光探针)可以检测到不同细胞中nad(p)h的水平，并且发现癌细胞中nad(p)h的水平要高于正常细胞。
[0067]
(2)不同葡萄糖浓度下hela细胞中nad(p)h的共聚焦荧光检测
[0068]
图6为不同葡萄糖浓度下hela细胞的细胞成像图。(a)为分别用5、10、20mm的葡萄糖预孵hela细胞15分钟后，再用10μm的化合物1孵育15分钟后进行的成像；(b)为hela细胞在不同浓度葡萄糖的条件下显示的平均荧光强度；将细胞预孵5mm的葡萄糖的荧光强度作为对照组定义为1.0，数据表示为平均值
±
sd(n＝3)。
[0069]
从图6可以看到：在向平均荧光强度最高的hela细胞中加入不同浓度的葡萄糖时，随着葡萄糖浓度的增加，hela细胞中的荧光强度也逐渐增强。说明在细胞发生糖酵解的过程中会有nad(p)h的产生。
[0070]
通过上述结果可以得出：本发明荧光探针可用于癌症的后续研究。
[0071]
实施例4
[0072]
小鼠活体实验：将母液浓度为2mm的探针稀释到500μm，吸取10μl经尾静脉注射至小鼠体内。分别在0、20、30和50分钟后，进行小鼠体内荧光成像。
[0073]
图7为小鼠的体内荧光成像图。从图中可以看到：小鼠体内的荧光强度随着时间的增加，由弱到强再渐渐变弱，说明本发明探针可以在小鼠体内检测nad(p)h，可以用于活体成像。