磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体及其应用的制作方法

本发明属于微生物工程，具体地说，涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体及其应用。

背景技术：

1、核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna组成；由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。d-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，分别简称为腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。

2、鸟苷和肌苷在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(amp)和鸟苷酸(gmp)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。

3、目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差，核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体，所述突变体包含磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶第147位氨基酸由k到r或h的突变。

3、本发明中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在ncbi上的参考序列编号为np_390934.2。

4、第二方面，本发明提供编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的核酸分子。

5、第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

6、第四方面，本发明提供所述核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：

7、(1)用于核苷的发酵生产；

8、(2)用于提高核苷的发酵产量；

9、(3)用于构建产核苷的基因工程菌。

10、第五方面，本发明提供核苷生产菌株的构建方法，利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶包含k147r或k147h突变位点。

11、或者，

12、利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶包含k147r或k147h突变位点，且使其编码的丙酮酸激酶包含t101k、t101r或t101p突变位点。

13、或者，

14、利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶包含k147r或k147h突变位点，且使其编码丙酮酸羧化酶的pyca基因包含第一个碱基由t到g或a的突变。

15、或者，

16、利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶包含k147r或k147h突变位点，且使其编码的丙酮酸激酶包含t101k、t101r或t101p突变位点，且使其编码丙酮酸羧化酶的pyca基因包含第一个碱基由t到g或a的突变。

17、其中，所述微生物为芽孢杆菌属菌种，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。优选枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌，更优选b.subtilis a1(参见cn201910599510.8)或b.a 8333。

18、b.a 8333菌株的构建过程如下(参见cn202111266398.x)：以菌株dsm7(atcc23350，参见文献genome sequence of b.amyloliquefaciens type strain dsm7treveals differences to plant-associated b.amyloliquefaciens fzb42)基因组为模板，guab-1f/1r和guab-2f/3r为引物，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物guab-1f/3r将2个片段融合，获得重组片段(orf区核苷酸序列如seqid no:1所示)。将guabl454f片段与pksu质粒(pksu质粒由南开大学王淑芳教授惠赠，参见amarkerless gene replacement method for b.amyloliquefaciens ll3 and its use ingenome reduction and improvement of poly-γ-glutamic acid production[j]，applied microbiology and biotechnology,2014,98(21):8963-8973.zhang w,gao w,feng j,et al doi:10.1007/s00253-014-5824-2)经sali/psti双酶切、组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-guabl454f。转化至b.a 836菌株(参见cn112574934a)中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得guabl454f点突变菌株，获得的菌株为b.a 837。提取pbe43质粒(pbe43质粒为全基因合成，参考文献effects of overexpression of key enzymegenes on guanosine accumulation in bacillus amyloliquefaciens)，使用kpni/sali对质粒进行线性化，将突变的purr序列(简称r2，seq id no:2)及突变的tal序列(简称l5，seq id no:3)进行融合pcr，获得r2+l5片段，使用组装试剂盒连接至线性化的pbe43质粒中，构建获得质粒pbe43-r2+l5。将该质粒转化至b.a 837菌株中，得到出发菌株b.a8333。

19、本发明中，丙酮酸激酶在ncbi上的参考序列编号为np_390796.1。

20、pyca基因可以来自枯草芽孢杆菌，其为：

21、i)seq id no:5所示的核苷酸序列；

22、ii)seq id no:5所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

23、iii)在严格条件下与seq id no:5所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

24、iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

25、pyca基因可以来自解淀粉芽孢杆菌，其为：

26、a)seq id no:8所示的核苷酸序列；

27、b)seq id no:8所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

28、c)在严格条件下与seq id no:8所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

29、d)与a)、b)或c)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

30、第六方面，本发明提供按照所述方法构建得到的核苷生产菌株。

31、第七方面，本发明提供一种生产核苷的方法，所述方法包括如下步骤：

32、1)培养所述核苷生产菌株，以获得微生物的培养物；

33、2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的核苷。

34、所述核苷包括腺苷、肌苷、鸟苷及其对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。

35、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

36、丙酮酸激酶第101位氨基酸由苏氨酸(t)突变为赖氨酸(k)、精氨酸(r)或脯氨酸(p)后，腺苷、肌苷产量均有提升，尤其以苏氨酸(t)突变为赖氨酸(k)后效果最好。丙酮酸激酶突变菌株pykt101k与出发菌株a1相比，腺苷产量由1.3g/l提高到2.1g/l最高；丙酮酸激酶突变菌株pykt101r与出发菌株a1相比，肌苷产量由0.6g/l提高到1.1g/l最好。

37、丙酮酸羧化酶基因的第一位碱基由t突变为g或a后，腺苷、腺苷产量均有提升，尤其以t突变为a后效果最好。突变体对枯草芽孢杆菌腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pycat1a工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到2.5g/l最优，突变体pycaa1g工程菌株肌苷产量由0.6g/l提高到1.3g/l最优。

38、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶第147位氨基酸由赖氨酸(k)突变为精氨酸(r)或组氨酸(h)后，腺苷、肌苷产量均有提升，突变体pckak147h工程菌株与出发菌株a1相比，腺苷产量由1.3g/l提高到1.8g/l，肌苷产量由0.6g/l提高到1.3g/l。

39、丙酮酸羧化酶突变体与丙酮酸激酶突变体叠加，对腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pycat1a叠加pykt101k工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到3.4g/l最高，突变体pycat1g叠加pykt101k工程菌株肌苷产量由0.6g/l提高到1.8g/l最高。

40、丙酮酸羧化酶突变体、丙酮酸激酶突变体和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体3者叠加，对腺苷、肌苷产量提升效果显著，突变体pycat1a、pykt101k、pckak147r叠加工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到4.4g/l，肌苷产量由0.6g/l提高到2.2g/l最高。

41、丙酮酸羧化酶突变体对解淀粉芽孢杆菌鸟苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pycat1a工程菌株鸟苷产量由9.8g/l提高到17.1g/l最优，突变体pycat1g工程菌株肌苷产量由1.0g/l提高到1.6g/l最优。