产核苷工程菌的构建方法及生产核苷的方法与流程

本发明属于微生物工程，具体地说，涉及产核苷工程菌的构建方法及生产核苷的方法。

背景技术：

1、核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna组成，由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。d-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。

2、鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(amp)和鸟苷酸(gmp)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可以治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。

3、目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差，核苷的转化率仍较低，无法满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种产核苷工程菌的构建方法及生产核苷的方法。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种修饰的微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其葡萄糖激酶(由glck基因编码)的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的核苷生产能力。并且，这些未修饰的微生物本身具有核苷生产能力。

3、本发明中，所述微生物为芽孢杆菌属(bacillus)或埃希菌属(escherichia)菌种，优选枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、大肠杆菌(escherichia coli)。更优选枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌，如b.a 8333菌株。

4、b.a 8333菌株的构建过程如下(参见cn202111266398.x)：以菌株dsm7(atcc23350，参见文献genome sequence of b.amyloliquefaciens type strain dsm7treveals differences to plant-associated b.amyloliquefaciens fzb42)基因组为模板，guab-1f/1r和guab-2f/3r为引物，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物guab-1f/3r将2个片段融合，获得重组片段(orf区核苷酸序列如seqid no:1所示)。将guabl454f片段与pksu质粒(pksu质粒由南开大学王淑芳教授惠赠，参见amarkerless gene replacement method for b.amyloliquefaciens ll3 and its use ingenome reduction and improvement of poly-γ-glutamic acid production[j]，applied microbiology and biotechnology,2014,98(21):8963-8973.zhang w,gao w,feng j,et al doi:10.1007/s00253-014-5824-2)经sali/psti双酶切、组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-guabl454f。转化至b.a 836菌株(参见cn112574934a)中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得guabl454f点突变菌株，获得的菌株为b.a 837。提取pbe43质粒(pbe43质粒为全基因合成，参考文献effects of overexpression of key enzymegenes on guanosine accumulation in bacillus amyloliquefaciens)，使用kpni/sali对质粒进行线性化，将突变的purr序列(简称r2，seq id no:2)及突变的tal序列(简称l5，seq id no:3)进行融合pcr，获得r2+l5片段，使用组装试剂盒连接至线性化的pbe43质粒中，构建获得质粒pbe43-r2+l5。将该质粒转化至b.a 837菌株中，得到出发菌株b.a8333。

5、葡萄糖激酶活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：

6、1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；

7、2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；

8、3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；

9、4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；

10、5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；

11、6)通过对酶的编码基因的核苷酸序列进行改变而增强。

12、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过在glck基因起始密码子上游插入p43启动子来实现的。

13、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过将葡萄糖激酶的第105位氨基酸由i突变为m来实现的。

14、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过异位插入由p43启动子驱动的一个、二个或多个拷贝glck基因(优选二拷贝glck基因)来实现的。

15、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过在glck基因起始密码子上游插入p43启动子，且异位插入由p43启动子驱动的一个、二个或多个拷贝glck基因(优选二拷贝glck基因)，并将葡萄糖激酶的第105位氨基酸由i突变为m来实现的。

16、优选地，所述微生物为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

17、第二方面，本发明提供一种修饰的微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其葡萄糖激酶(由glck基因编码)以及葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白(由glcp基因编码)的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的核苷生产能力。并且，这些未修饰的微生物本身具有核苷生产能力。

18、葡萄糖激酶、葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：

19、1)通过导入具有所述酶或蛋白的编码基因的质粒而增强；

20、2)通过增加染色体上所述酶或蛋白的编码基因的拷贝数而增强；

21、3)通过改变染色体上所述酶或蛋白的编码基因的启动子序列而增强；

22、4)通过将强启动子与所述酶或蛋白的编码基因可操作地连接而增强；

23、5)通过对酶或蛋白的氨基酸序列进行改变而增强；

24、6)通过对酶或蛋白的编码基因的核苷酸序列进行改变而增强。

25、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过在glck基因起始密码子上游插入p43启动子来实现的。

26、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过将葡萄糖激酶的第105位氨基酸由i突变为m来实现的。

27、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过异位插入由p43启动子驱动的一个、二个或多个拷贝glck基因(优选二拷贝glck基因)来实现的。

28、进一步地，葡萄糖激酶活性的增强是通过在glck基因起始密码子上游插入p43启动子，且异位插入由p43启动子驱动的一个、二个或多个拷贝glck基因(优选二拷贝glck基因)，并将葡萄糖激酶的第105位氨基酸由i突变为m来实现的。

29、进一步地，葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白活性的增强是通过在glcp基因起始密码子上游插入p43启动子来实现的。

30、进一步地，葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白活性的增强是通过在α淀粉酶基因处插入由p43启动子驱动的二拷贝glcp基因来实现的。

31、进一步地，葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白活性的增强是通过在glcp基因起始密码子上游插入p43启动子，且在α淀粉酶基因处插入由p43启动子驱动的二拷贝glcp基因来实现的。

32、进一步地，葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白活性的增强是通过在glcp基因起始密码子上游插入p43启动子，且在α淀粉酶基因处插入由p43启动子驱动的二拷贝glcp基因，并将葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白的第206位氨基酸由h突变为r来实现的。

33、优选地，所述微生物为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

34、本发明中，葡萄糖激酶在ncbi上的参考序列编号为ks08_12550，或与其相似性为90％的氨基酸序列。葡萄糖/甘露糖转运蛋白glcp在ncbi上的参考序列编号为ks08_00900，或与其相似性为90％的氨基酸序列。α淀粉酶基因在ncbi上的参考序列编号为ks08_07940，或与其相似性为97％的核苷酸序列。

35、第三方面，本发明提供一种产核苷工程菌的构建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，增强具有核苷生产能力的微生物中的基因glck，获得葡萄糖激酶活性增强的菌株；或者，增强具有核苷生产能力的微生物中的基因glck和glcp，获得葡萄糖激酶以及葡萄糖转运蛋白和/或甘露糖转运蛋白活性增强的菌株。

36、第四方面，本发明提供一种生产核苷的方法，所述方法包括如下步骤：

37、a)培养所述微生物，以获得所述微生物的培养物；

38、b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的核苷。

39、所述核苷包括肌苷、鸟苷等核苷或对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。

40、第五方面，本发明提供所述修饰的微生物或按照上述方法构建得到的产核苷的工程菌在核苷发酵生产或提高核苷发酵产量中的应用。

41、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

42、突变菌株b.a 8338(含有glcki105m点突变、p43-glcp二拷贝其中原位glcp发生h206r点突变菌株)、b.a 8339(glck启动子强化、p43-glcp二拷贝其中原位glcp发生h206r点突变菌株)及b.a 8340(glcki105m二拷贝菌株、p43-glcp二拷贝其中原位glcp发生h206r点突变)较各自出发菌株相比，鸟苷产量分别由15.0g/l、15.5g/l、16.2g/l提高至15.5g/l、16.2g/l及17g/l。糖苷转化率分别提高1％、1％和0.7％。