一种与大肠癌相关的核苷酸分子及其应用

1.本技术涉及分子生物医学领域，具体涉及一种与大肠癌相关的核苷酸分子及 其应用。


背景技术：

2.大肠癌又称为结直肠癌(colorectal cancer，crc)，是一种常见的消化 道恶性肿瘤。结直肠癌(colorectal cancer，crc)是大肠黏膜上皮在环境和遗传 等多种致癌因素作用下通过遗传学和表观遗传学的改变而发生的恶性病变。随着 人们生活水平的提高和饮食结构的改变，大肠癌的发病率逐年升高。
3.在西方国家，crc是一种常见的致死性疾病,每年有超过百万人被诊断为 crc并且大约一半的人因此死亡。crc是美国恶性肿瘤的第二位。在我国，crc 居恶性肿瘤的第四位。近年来,由于人们生活方式的改变、环境因素的恶化、慢 性病的增加以及遗传等多种致癌因素的作用,我国crc的发病率和死亡率逐年 上升。近年来我国大肠癌的发病率呈上升趋势。大肠癌是恶性程度很高的消化道 肿瘤，由于早期不易发现且病死率高，手术、放化疗及生物治疗预后不佳，因此 早诊断、早发现、早治疗显得尤为重要。
4.外科手术是其主要治疗手段，但术后复发率高，且5年生存率低。肿瘤 的浸润程度、是否发生淋巴结和远处转移是决定其预后的一个重要的因素，原位 癌(i期)的5年生存率超过90％，而转移到远处器官(iv期)时，5年生存率仅 为约10％。显然需要一种更好的生物标志物，以改善对crc的筛查和诊断效果。 ii期和iii期的大肠癌患者手术切除后是否应接受辅助化疗以及进行何种化疗，都 影响其预后。对于已经发生转移的crc(iv期)患者来说，虽然已失去手术切除 的指征，但仍然存在是否进行“传统”化疗与新的生物治疗相组合，以延长生存 期的选择。因此，找到新的的生物标志物用于预测患者对化疗药物的反应也迫在 眉睫。
5.crc的形成是一个多基因、多途径、多步骤、多阶段的复杂而又冗长的过 程,早期的crc症状不明显,大多数患者初次诊断已处于中晚期,一般早期患者 通过根治手术可以获得治愈,中晚期患者主要以放化疗为主,虽然有一定的疗效, 但大多数预后都很差。初次诊断时大多已处于中晚期。只有少数患者通过根治性 手术获得治愈，因此早期发现早期诊断结直肠癌尤为迫切。探索crc分子水平 的发生发展机制对其早期筛查、诊断、治疗和预后等显得尤为重要。
6.近年来,关于crc的研究主要集中在挖掘crc突变基因及表达紊乱的致病 蛋白编码基因上。然而对长非编码rna(long noncoding rna,lncrna)的研究却 相对较少。长链非编码rna(lncrna)是近年来分子生物学领域 新的研究热点，已经在多种肿瘤中发现其异常表达并且异常表达与肿瘤的发生、 发展、转移、复发及预后等方面密切相关。lncrna作为一类转录本长度在 200nt-100kb之间的rna，广泛存在于细胞核和细胞质内，其缺少开放阅读框， 不参与或很少参与蛋白质编码，而是以rna的形式在多种层面上调控基因的表 达水平。相对于蛋白编码序列以及小分子rna，lncrna的相关研究仍处于起 步阶段。
7.lncrna最初被认为是转录的“噪音”,没有实际的生物学功能,但近年来越 来越多的证据表明,lncrna的量与mrna相当,可以参与细胞周期的任何过程, 如细胞增殖、细胞生长和细胞凋亡,其异常表达也会影响到肿瘤的发生发展,其 中包括crc。lncrna参与crc的形式多种多样,其差异表达影响crc的细胞 增殖、凋亡、转移和侵袭等多种生物过程,有些lncnra甚至可以作为crc诊断 预后的标记。研究表明，长链非编码rna(lncrna)与恶性肿瘤的发生、发展 密切相关，将它们作为肿瘤诊断和预后的标志物具有潜在的优势。
8.本课题组前期采用全基因组芯片技术结合文献挖掘的生物信息学方法筛选 大肠癌转移相关基因，发现大肠癌组织与癌旁组织中多个长链非编码rna基因 表达量存在差异，某些长链非编码rna在转移侵袭能力较强的大肠癌细胞中其 表达量高于转移侵袭能力较弱的细胞。暗示了这些长链非编码rna在crc的 发生发展以及侵袭中可能具有重要的功能。


技术实现要素：

9.本发明公开了一种sirna分子，所述sirna分子的正义链序列为5
’ꢀ‑
cgagacuguugcaaaccggc-3’(seq id no:6)；或所述sirna分子的正 义链序列为5
’‑
ccccggcucgguccacaagcu-3’(seq id no:7)；或所 述sirna分子的正义链序列为5
’‑
gcaugaccgcauuuccaaua-3’(seq idno:8)。
10.优选的，所述sirna分子的反义链序列为5
’‑ꢀ
gccgguuugcaacagucucg-3’(seq id no:9)；或所述sirna分子的 反义链序列为5
’‑
agcuuguggaccgagccgggg-3’(seq id no:10)； 或所述sirna分子的反义链序列为5
’‑
uauuggaaaugcggucaugc-3
’ꢀ
(seq id no:11)。
11.优选的，所述sirna分子的正义链序列为5
’ꢀ‑
cgagacuguugcaaaccggc-3’(seq id no:6)；所述sirna分子的反义 链序列为5
’‑
gccgguuugcaacagucucg-3’(seq id no:9)。
12.本发明公开了一种组合物，所述组合物包括权利要求1-3任一权利要求所述 的sirna分子。
13.优选的，所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。
14.本发明公开了所述的sirna和/或所述的组合物在制备治疗大肠癌的药物中 的应用。
15.本发明公开了抑制ftmt23000006837.1表达的试剂在制备治疗大肠癌的药 物中的应用。
16.优选的，所述试剂为针对ftmt23000006837.1的sirna分子。
17.优选的，所述sirna分子的正义链序列为5
’ꢀ‑
cgagacuguugcaaaccggc-3’(seq id no:6)；或所述sirna分子的正 义链序列为5
’‑
ccccggcucgguccacaagcu-3’(seq id no:7)；或所 述sirna分子的正义链序列为5
’‑
gcaugaccgcauuuccaaua-3’(seq idno:8)；所述sirna分子的反义链序列为5
’‑
gccgguuugcaacagucucg-3
’ꢀ
(seq id no:9)；或所述sirna分子的反义链序列为5
’‑ꢀ
agcuuguggaccgagccgggg-3’(seq id no:10)；或所述sirna分子 的反义链序列为5
’‑
uauuggaaaugcggucaugc-3’(seq id no:11)。
18.优选的，所述大肠癌为大肠癌细胞sw620。
19.本发明基于基因芯片数据以及rt-pcr方法首次发现了在大肠癌细胞和癌旁 组织中存在明显差异表达的分子ftmt23000006837.1，并通过设计针对 ftmt23000006837.1的
sirna分子，通过实现对ftmt23000006837.1的表达的抑 制，筛选获得了能够高效抑制ftmt23000006837.1表达的sirna分子，同时，将 转化该sirna分子的细胞进行生长增值监测，发现细胞的生长受到显著抑制，表 明ftmt23000006837.1分子可以作为一个候选的靶点用于制备大肠癌细胞的抑 制剂。
附图说明
20.图1为培养的sw620细胞的光学照片。
21.图2为提取的组织细胞的rna的电泳照片。
22.图3为不同组织中ftmt23000006837.1的表达情况。
23.图4为转化不同sirna分子的sw620细胞中ftmt23000006837.1 的表达的差异。
24.图5为转化不同sirna分子的sw620细胞的生长增值情况。
25.图6为转化sirna1的sw620细胞的生长抑制曲线。
具体实施方式
26.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
27.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
28.实施例1大肠癌细胞sw620的培养
29.大肠癌细胞sw620为本研究室保存。sw620在液氮罐中保存，37℃ 解冻后，将细胞置于37℃，体积分数为5％co2，95％饱和湿度 的培养箱中用rpmi1640培养液(含有10％胎牛血清(fbs)及青链 霉素100mg/l)培养。每2d换液一次。实验为生长至对数期的细胞。 培养的细胞在显微镜下的光学照片如图1.
30.实施例2不同组织及细胞rna的提取及反转录
31.采用trizol法抽提取大肠癌患者部分切割的患癌组织，癌旁组 织以及sw620细胞的总rna。
32.主要操作步骤如下：
33.(1)取适量患癌组织，癌旁组织以及离心收集的sw620细胞， 研磨磨碎，放入无酶的1.5ml离心管，加入1ml上下颠倒静置10 min；用pbs侵洗3次，然后加入1ml的trizol吹打，静置8 min；
34.(2)加入200μl的氯仿，利用震荡离心机剧烈震荡15s后 室温放置5min，然后4℃离心机，12000rpm/min离心8min；
35.(3)用移液枪将无色透明的上清转移至无rna酶的1.5ml离 心管中，加入等体积的异丙醇后颠倒混匀，冰上放置6min，然后12 000rpm/min，4℃离心8min；
36.(4)切掉上清，加入700μl的75％乙醇，混匀，然后12000 rpm/min，4℃离心8min；
37.(5)用移液枪吸掉上清，超净台内静置10min，让乙醇完全挥 发，加入50μl depc水，然后50℃水浴8min，超净台内吸取2μl 用于浓度测定和电泳检测。剩余部分放置在-80℃冰箱保存，用于后 续实验。
38.(6)对提取的rna进行紫外分光光度计的吸光度测定，以检测 提取的rna的完整
度，测定结果参见下表1，其中所提取的样品的 od260/od280值均大于1.8。这表明从三种样品中提取的rna较完整， 可满足pcr反应的要求。
39.表1:提取的rna紫外分光光度计的吸光度测定
40.rna类型患癌组织rna癌旁组织rnasw620 rnaod260/od2801.8641.8731.926
41.(7)电泳检测总rna经1％琼脂糖电泳后在紫外灯下观察显示 出清晰的18s和28s两条带，证明所提取的总rna中的m rna完整、 无降解，见图2。
42.(8)用cdna第一链合成试剂盒将提取的rna反转录为c dna，反应条件为65℃6min，42℃50min，72℃12min，逆转 录后用超微量紫外可见分光光度计检测cdna浓度和od值 (od260/od280)，保存于-20℃备用。
43.实施例3 rt-pcr检测不同组织中ftmt23000006837.1的表达
44.采用real-time pcr法。以gapdh为内参进行real-time pcr反应。根据ftmt23000006837.1的全序列信息(seq id no:1)， 设计一对扩增引物，序列如下：
45.上游引物：5
’‑
agagctgggctagggcga-3’(seq id no:2)
46.下游引物：5
’‑
ctagctaagtcgaagcgta-3’(seq id no:3)，扩 增产物626bp。
47.gapdh扩增引物序列:
48.上游引物：5'-acggatttggtcgtattgggcg-3'(seq id no:4)，
49.下游引物：5'-ctcctggaagatggtgatgg-3'(seq id no:5)，扩 增产物212bp。
50.以cdna为模板进行pcr扩增：95℃变性5min，95℃，15s； 64℃，50s；72℃，15s，共40个循环，72℃，15min。
51.取扩增产物进行电泳检测，电泳图参见图3。
52.采用mx3000p定量pcr仪对结果进行定量分析，以 ftmt23000006837.1条带光密度(od)值/gapdh条带od值表示 ftmt23000006837.1mrna相对表达量。计算结果参见表2。其中， 在大肠癌组织以及sw620细胞中，ftmt23000006837.1mrna相对表 达量均高于正常组织(癌旁组织)(p《0.05)。
53.表2:三种不同细胞中ftmt23000006837.1mrna相对表达量
54.组别癌旁组织sw620细胞大肠癌组织mrna相对表量0.718
±
0.0451.512
±
0.0391.437
±
0.017
55.实施例4针对ftmt23000006837.1的sirna分子的设计及细胞 转化
56.鉴于ftmt23000006837.1在大肠癌细胞中的高表达，为了进一步 研究ftmt23000006837.1的功能，根据ftmt23000006837.1的序列，我 们进一步设计了针对ftmt23000006837.1的三种sirna分子，转化 sw620细胞，通过检测干扰后的ftmt23000006837.1在细胞中的表达， 监测细胞的增殖情况，以进一步研究ftmt23000006837.1的功能。
57.根据ftmt23000006837.1的基因的序列，设计三对针对 ftmt23000006837.1的sirna分子，其序列分别如下：
58.sirna1正义:5
’‑
cgagacuguugcaaaccggc-3’(seq id no:6)；
59.sirna1反义:5
’‑
gccgguuugcaacagucucg-3’(seq id no:9)；
60.sirna2正义:5
’‑
ccccggcucgguccacaagcu-3’(seq id no:7)；
61.sirna2反义:5
’‑
agcuuguggaccgagccgggg-3’(seq id no:10)；
62.sirna3正义:5
’‑
gcaugaccgcauuuccaaua-3’(seq id no:8)；
63.sirna3反义:5
’‑
uauuggaaaugcggucaugc-3’(seq id no:11)。
64.选择生长状态良好的细胞，以1
×
105/孔的密度接种6孔 板；待细胞密度达到50％～70％后，根据lipofectamine 2000转 染试剂盒说明书进行转染。每组设4个复孔，培养24h后换新鲜培养 液。
65.实施例5转化sirna的细胞ftmt23000006837.1表达鉴定
66.收集转染48h的细胞，按照实施例2的方法提取rna并反转录 成cdna作为pcr扩增的模版。按照实施例3的方法检测转化相应 sirna分子的sw620细胞中ftmt23000006837.1的表达。
67.取扩增产物进行电泳检测，电泳图参见图4。
68.采用mx3000p定量pcr仪对结果进行定量分析，以 ftmt23000006837.1条带光密度(od)值/gapdh条带od值表示 ftmt23000006837.1mrna相对表达量。计算结果参见表3。其中， 在转化sirna1的sw620细胞中，ftmt23000006837.1mrna相对表 达量受到最大的抑制(p《0.05)。
69.表3:三种不同sirna转化细胞中ftmt23000006837.1相对表达量
70.组别sirna1sirna2sirna3mrna相对表量0.684
±
0.0270.823
±
0.0710.817
±
0.031
71.实施例6转化细胞的增殖活性检测
72.采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法测定细胞增殖率。取密度为 0.5
×
105/ml的细胞悬液每孔100μl接种于96孔细胞培养板。培 养24h待细胞贴壁后更换培养液。按上述方法分组并设空白孔。每 组设3个复孔37℃、5％co2培养箱中分别培养48h后检测时每孔 加入5g/lmtt20μl按试剂盒说明进行测量490nm处各孔吸 光度值(a)。其中，以空白孔的细胞的平均吸光度作为增殖倍数 1，检测得到的生长抑制结果参见图5，其中，在转化了相应sirna 的细胞中，sw620的生长得到不同程度的抑制，其中，转化sirna1 分子的细胞，生长受到最大程度的抑制，这和sirna1分子对于 ftmt23000006837.1的表达的抑制最强烈的结果是一致的，也进一步 表明，大肠癌细胞细胞中ftmt23000006837.1的表达与细胞的增殖 侵袭相关。
73.实施例7转化sirna1分子的细胞的生长检测
74.根据实施例6中不同sirna分子对于sw620细胞的生长抑制，进 一步监测抑制效果最好的sirna1在不同时间对于sw620细胞的生长 抑制情况下。
75.转化sirna1分子的细胞的生长检测操作按照实施例6中的方法 进行，检测结果参见图6。从图6的结果可以看出，sirna1在转化 24小时之后，细胞的增殖相对于空白对照生长受到明显的抑制。
76.上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做 出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。