一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用。


背景技术：

2.近年来，真菌的次级代谢产物因结构出新率高、生物活性显著，是新药物开发的重要来源，已成为药物化学领域的研究热点。淡水真菌是真菌的一个重要类群，其生存环境与海洋真菌和土壤真菌的巨大差异，导致淡水真菌次级代谢产物的化学多样性明显不同于这两类真菌。
3.有报道显示，淡水真菌代谢产物的次级代谢产物结构类型复杂多样，多数具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗虫等生物活性，在医药与农药研发等领域有着广阔的应用前景。并且与从植物中提取或者合成具有抑制食源性病原细菌的化合物相比较，从淡水真菌的次级代谢产物中提取具有周期短、成本低的特点。然而，目前对于淡水真菌及其次级代谢产物的研究相对较少。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用，该淡水真菌及其次级代谢产物能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌等食源性病原细菌。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一株淡水真菌，所述淡水真菌的保藏名称为v8，拉丁文为chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.22419。
7.本发明还提供了所述淡水真菌在抑制食源性病原细菌中的应用。
8.作为优选，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。
9.本发明还提供了所述淡水真菌的次级代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将淡水真菌接种到培养基中发酵9～15天，将发酵液用乙酸乙酯萃取后收集萃取液，过滤浓缩得到淡水真菌的次级代谢产物。
10.作为优选，所述培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基。
11.作为优选，所述萃取的方法为：在发酵液中加入0.8～1.2倍体积的乙酸乙酯，超声提取25～35min，提取后静置12～36h。
12.本发明还提供了所述制备方法制备的次级代谢产物。
13.本发明还提供了所述次级代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用。
14.作为优选，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。
15.本发明提供了一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用，所述淡水真菌的保藏名称
为v8，拉丁文为chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.22419。本发明的淡水真菌及其次级代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌均有良好的抑菌效果，次级代谢产物的提取方法简单、易实现、周期短、成本低，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
16.图1为自然基质上的淡水真菌菌落；
17.图2为淡水真菌的分生孢子梗、产孢细胞、分生孢子的显微结构，右侧空白为标尺，标尺长度为30μm；
18.图3为淡水真菌的分生孢子，右侧空白为标尺，标尺长度为10μm；
19.图4为为基于lsu、its和tef1-α数据集的chaetosphaeriaceae的最大似然分析系统发育图，最大似然值(ml)高于50％在分枝附近标出，本发明的淡水真菌用加下划线表示，系统发育树以gelasinospora tetrasperma(aftol-id 1287)和sordariafimicola(cbs 508.50)为外源基因；
20.图5为本发明淡水真菌代谢产物对六种食源性病原细菌的抑菌实验结果，其中a为大肠杆菌，b为金黄色葡萄球菌，c为枯草芽孢杆菌，d为李斯特菌，e为沙门氏菌，f为志贺菌，每个图中标出的d表示为dmso空白对照。
21.保藏说明
22.淡水真菌v8，拉丁文为chaetosphaeria thailandense，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年5月10日，保藏编号为：cgmcc no.22419。
具体实施方式
23.本发明提供了一株淡水真菌，其特征在于，所述淡水真菌的保藏名称为v8，拉丁文为chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.22419。
24.本发明还提供了所述的淡水真菌在抑制食源性病原细菌中的应用。
25.在本发明中，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。
26.本发明还提供了所述淡水真菌的次级代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将淡水真菌接种到培养基中发酵9～15天，将发酵液用乙酸乙酯萃取后收集萃取液，过滤浓缩得到淡水真菌的次级代谢产物。
27.在本发明中，所述发酵时优选在摇床上进行。
28.在本发明中，所述发酵时摇床的转速优选为140～180r/min，进一步优选为160r/min。
29.在本发明中，所述发酵的温度优选为25～30℃，进一步优选为27～28℃。
30.在本发明中，所述发酵的时间优选为10～14天，进一步优选为11～13天，再进一步优选为12天。
31.在本发明中，所述培养基优选为马铃薯葡萄糖肉汤培养基。
32.在本发明中，所述萃取的方法为：在发酵液中加入0.8～1.2倍体积的乙酸乙酯，超声提取25～35min，提取后静置12～36h。
33.在本发明中，所述乙酸乙酯的体积优选为发酵液的0.9～1.1倍，进一步优选为1倍。
34.在本发明中，所述超声提取的时间优选为28～32min，进一步优选为30min。
35.在本发明中，所述静置的时间优选为18～30h，进一步优选为24h。
36.在本发明中，所述过滤时优选采用滤纸过滤。
37.在本发明中，所述浓缩时优选采用旋转蒸发仪。
38.在本发明中，所述旋转蒸发仪的使用条件优选为35～41℃、60～100r/min，进一步优选为38℃、80r/min。
39.本发明还提供了所述制备方法制备的次级代谢产物。
40.本发明还提供了所述的次级代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用。
41.在本发明中，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。
42.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
43.实施例1菌种筛选和鉴定
44.1、菌种来源：从泰国攀牙府塔布区的小河边的淡水腐木上分离。
45.2、淡水腐木上的形态特征(如图1所示)：无性型：丝孢菌。菌落在自然基质上疏展，表生，直立，单个或者聚集，毛发状，棕色到黑棕色，大量的黏糊状，反光的孢子聚集在分生孢子梗顶部。菌丝体部分埋生，部分表生，由具有隔膜的，分枝的，透明到近透明的菌丝组成，光滑。不具有刚毛。分生孢子梗(如图2所示)粗大，单生，长70～135μm底部宽3.5～5.0μm，中部宽2.3～4μm，直的或弯曲，圆柱状，底部棕色到深棕色，向顶端逐渐变浅至近透明到淡棕色，多隔膜，光滑，无分枝，有时顶部增殖1到2次。产孢细胞(如图2所示)单瓶梗或偶尔多瓶梗产孢，末端的，圆柱状的，透明到浅棕色的，在顶部具有一个明显的领状结构。分生孢子(如图3所示)2.5～4.5
×
1.9～3μm顶生，无隔，近透明到浅棕色，椭圆形到卵圆形，顶部圆形，无隔膜，有一个液滴，光滑。
46.3、菌落的形态学特征：菌落整齐，圆形的，菌丝体在中部稠密，边缘稀疏，中部微微隆起，颜色从正面和背面看，中部为金黄色到中棕色，边缘未白色到浅黄色，表面粗糙，干燥，边缘完整。
47.4、分子鉴定：采用植物基因组dna提取试剂盒(通用型)提取该菌株的总dna，后进行pcr扩增，扩增出lsu、its和tef1-α基因序列。pcr产物送到云南省擎科生物技术有限公司进行测序。所获得的基因序列经过拼接，进行多基因系统发育分析(如图4所示)。
48.跑树结果发现该菌株与chaetosphaeria dilabens跑在一簇(98％ml)。但是与c.dilabens比较，c.thailandense有更短的分生孢子梗(70～135μm vs.180(-200)μm)。另外，比较了我们的菌株和c.dilabens(cbs 735.83，模式菌株)的lsu和its序列，发现lsu相差0.1％(8/847)，its相差5.8％(31/537)。因此认为我们的菌株不是c.dilabens。
49.结合形态学特征和多基因系统发育结果，菌株cgmcc no.22419被鉴定为
dmso作空白对照。封口膜封口后，正置放于37℃恒温培养箱中培养1d，观察抑菌圈，游标卡尺测量抑菌圈直径。每种致病菌测量三组数据取平均值，实验结果见图5和表1；
66.表1
[0067][0068][0069]
从上述结果可以看出：本发明淡水真菌新种chaetosphaeria thailandense的代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌均有良好的抑菌效果。
[0070]
由以上实施例可知，本发明提供了一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用，所述淡水真菌的保藏名称为v8，拉丁文为chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.22419。本发明的淡水真菌及其次级代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌均有良好的抑菌效果，次级代谢产物的提取方法简单、易实现、周期短、成本低，具有广阔的市场应用前景。
[0071]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。