一种Expi293F细胞培养方法与流程

一种expi293f细胞培养方法
技术领域
1.本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种expi293f细胞培养方法。


背景技术：

2.细胞培养是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。进行大规模细胞培养，常常用到生物反应器。生物反应器即就是用微生物、植物、动物或人细胞，通过生物方法将原料转化为产品的容器。
3.细胞培养生物反应器能够进行大规模细胞培养，它的优点在于可在细胞培养过程中实现自动控制、培养条件的实时监控，能够对整个生产条件进行相对稳定的调整，从而可提高产品质量的稳定性。然而在实际生产过程中，当反应器体积增加时，为了保持环境的均一性，需要提高搅拌的强度，但因此带来较高的剪切速率和剪切力而使得细胞受到物理损害；但若因此降低搅拌强度，则不利于传质。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供了一种expi293f细胞培养方法，使得灌注过程培养基的注入也起到扩大传质、减少细胞团聚的作用，获得了高密度的细胞。
5.本发明通过下述技术方案实现：一种expi293f细胞的培养方法，将expi293f细胞接种至生物反应器培养，进行灌注动态培养32-72h：将待灌注的培养液均分为多股，沿着生物反应器内壁贴壁灌注入生物反应器中，其中生物反应器内的搅拌速度为80-90 rpm，灌注液的灌注速率为0.5-2个工作体积/d，细胞生长旺盛期的搅拌速率要低于细胞生长初期和细胞生长稳定期二者的搅拌速率，细胞生长旺盛期的灌注速率要高于细胞生长初期和细胞生长稳定期二者的灌注速率，灌注动态培养时，保持反应器内培养条件：温度36.5-37℃，do 40-60%，ph7.2
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0.2；培养过程中用到的无血清培养液为： 24.75g/l 的dynamis培养基95wt%、200 mm谷氨酰胺4wt%和抗结团剂 1wt%。
6.灌注培养时，将待灌注的培养液均分为多股，同时沿着反应器内壁贴壁均匀灌注入反应器中。可根据生物反应器的具体体积进行分流设计。搅拌的死角常常出现在远离搅拌器的反应器内边缘，虽然为了解决这个问题，现有技术对搅拌器进行了改进，但是仍然或多或少会存在搅拌不到位的位置，而这样却会因为搅拌不匀，对细胞的生长带来影响，从而影响热量平衡。当多个路径注入的培养液能够和因搅拌作用扬起靠近反应器内壁的培养液进行多广度的上下混合传质，让细胞代谢充分进行，实现均匀传质的同时减小对动物细胞的机械损伤，提高动物细胞的活性和质量，最后能够实现快速获得高密度细胞的目的。本发明对灌注方式进行改进，再配合适当的灌注速率和降低搅拌强度，使得灌注过程培养基的注入也起到扩大传质、减少细胞团聚对细胞代谢影响、减少细胞受到的物理损伤的作用，获
得了高密度的细胞，取得了显著的效果。
7.灌注动态培养条件过程中，细胞生长初期，培养液注入速率为0.5个工作体积/d，搅拌转速为85-86 rpm；细胞生长稳定期，培养液注入速率为1个工作体积/d，搅拌转速为84-85 rpm。在细胞生长初期和生长末期设定灌注的培养液温度和反应器内培养液温度相等，即灌注液温度和反应器控制温度一致。
8.灌注动态培养条件过程中，细胞生长旺盛期，培养液注入速率为1.5-2个工作体积/d，搅拌转速为80-83 rpm。本发明中不同生长期的注入速率和搅拌转速的配合，以维持细胞培养过程中的环境热相对稳定，以满足细胞不同生长期的环境需求和培养质量的需求。
9.在细胞生长旺盛期，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.1-0.4℃，即灌注液温度比反应器控制温度低0.1-0.4℃。本发明采取在细胞生长旺盛期，将灌注液温度调低0.1-0.4℃，细胞密度得到进一步提升。这可能是expi293f细胞指数生长期时，新陈代谢非常旺盛，新陈代谢产生的热量到反应环境中无法及时疏散，反应液中出现局部温度梯度，且温控系统因滞后和检测局限性的原因，局部的温度梯度并不能得到很好的控制，局部热量的突然变化会对细胞的生长产生影响，因此本发明将灌注液温度调低少许，降低了反应器内热量的波动频率，使得反应器内的反应热得到相对的平衡稳定，减小了温度梯度对细胞生长的影响，提升了细胞密度。在实践中发现，0.1-0.2℃的降低是比较有利于细胞生长环境中热量的平衡，即有利于生长环境的平衡。
10.转移至生物反应器培养的细胞接种密度为0.2
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6 cells/ml。在反应器内沿着其内壁设置多个进料孔，灌注液通过进料孔进入反应器内，进料孔的下端设置在反应器内培养液高度的一半位置处。抗结团剂采用常用的即可，如f68等。
11.进料孔连接有1-2cm长的不锈钢短管，目的是防止灌注液直接进入对细胞影响过大，短管可对灌注液和细胞起到短暂隔离的作用，在灌注液和短管进行了热量交换后，能够降低灌注液与细胞直接接触时对细胞产生的温度影响。
12.多个路径培养液注入到反应容器中，由于其沿着反应器的圆周均匀注入，而使得每个角落的细胞更加容易获得足够的营养成分，液体的不断注入对生物反应容器内的液体流动也不断起到推进的作用，而这种推进作用一方面使得液体充分流动，而不会对细胞产生机械损伤，因此能够实现搅拌转速的降低，另一方面多范围多广度的营养液不断流动注入相比单股营养液大量注入，更加推进了反应容器内液体全方位的溶氧进行，使得细胞能够在较长时间内处于一个动态稳定的较好的繁殖环境，能够实现降低搅拌速率降低而实现减小细胞损伤，却又能获得高密度细胞的效果。expi293f细胞购自atcc。
13.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：1、本发明中能够获得expi293f细胞密度高达 0.9-1.3
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108cells/ml。
14.2、本发明对灌注方式进行改进，再配合适当的灌注速率和降低搅拌强度，使得灌注过程培养基的注入也起到扩大传质、减少细胞团聚对细胞代谢影响、减少细胞受到物理损伤的作用，获得了高密度细胞和高存活率取得了显著的效果。
具体实施方式
15.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作
进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
16.实施例1 expi293f细胞的培养按照细胞密度0.2
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6 cells/ml将细胞接种至50升奇志生物反应器（工作体积为40l）中进行灌注动态培养48h，将待灌注的无血清培养液均分为6股，（待灌注的培养液经预热处理至37℃），沿着生物反应器内壁均匀分散，贴壁灌注入生物反应器中，灌注动态培养时，保持反应器内培养条件：温度37℃，do 40-60%，ph7.2
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0.2；培养过程中用到的无血清培养液为： 24.75g/l 的dynamis培养基95wt%、200 mm谷氨酰胺4wt%，抗结团剂 1wt%。
17.培养液注入速率为：细胞生长初期，培养液注入速率为0.5个工作体积/d，搅拌转速为85 rpm，细胞生长稳定期，培养液注入速率为1个工作体积/d，搅拌转速为84 rpm，细胞生长旺盛期，培养液注入速率为1.5个工作体积/d，搅拌转速为83 rpm。
18.实施例2按照细胞密度0.2
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6 cells/ml将细胞接种至50升生物反应器中进行灌注动态培养48h，将待灌注的培养液均分为6股，（待灌注的培养液经预热处理至37℃），沿着生物反应器内壁均匀分散，贴壁灌注入生物反应器中，灌注动态培养时，保持反应器内培养条件：温度37℃，do 40-60%，ph7.2
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0.2；培养过程中用到的无血清培养液为： 24.75g/l 的dynamis培养基95wt%、200 mm谷氨酰胺4wt%和抗结团剂 1wt%。
19.培养液注入速率为：细胞生长初期，培养液注入速率为0.5个工作体积/d，搅拌转速为86 rpm，细胞生长稳定期，培养液注入速率为1个工作体积/d，搅拌转速为85 rpm，细胞生长旺盛期，培养液注入速率为2个工作体积/d，搅拌转速为81 rpm。
20.实施例3和实施例2类似，不同在于，在细胞生长期时，对待灌注液预热处理后，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.1℃。
21.实施例4和实施例2类似，不同在于，在细胞生长期时，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.2℃。
22.实施例5和实施例2类似，不同在于，在细胞生长期时，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.3℃。
23.实施例6和实施例2类似，不同在于，在细胞生长期时，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.4℃。
24.对比例1和实施例2类似，不同在于，在细胞生长期时，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.6℃。
25.对比例2和实施例2类似，不同在于，在细胞生长期时，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.7℃。
26.对比例3和实施例2类似，不同在于，在细胞生长期时，灌注的培养液温度与反应器内培养液温度的相比低0.5℃。
27.对比例4和实施例2类似，不同在于，灌注不采用分流。
28.对比例5和实施例2类似，不同在于，细胞生长初期，培养液注入速率为2个工作体积/d，搅拌转速为86 rpm，细胞生长稳定期，培养液注入速率为1个工作体积/d，搅拌转速为85 rpm，细胞生长旺盛期，培养液注入速率为0.5个工作体积/d，搅拌转速为81 rpm。
29.对比例6和实施例2类似，不同在于，培养液注入速率为：细胞生长初期，培养液注入速率为0.5个工作体积/d，搅拌转速为85 rpm，细胞生长稳定期，培养液注入速率为1个工作体积/d，搅拌转速为84 rpm，细胞生长旺盛期，培养液注入速率为2个工作体积/d，搅拌转速为90 rpm。
30.在实施上述在实施例和对比例时，可按照实际需求进行：反应器内沿着其内壁设置6个进料孔，灌注液通过6个进料孔均分进入反应器内，进料孔的下端设置在反应器内培养液高度的一半位置处。进料孔连接有1-2cm长的不锈钢短管。
31.按照实施列和对比例中所述的生产工艺生产得到expi293f细胞，并对expi293f细胞培养后的细胞密度进行测定，与3个批次采用静态培养工艺的培养后细胞密度结果进行比较，结果如下表1：
从实施例和对比例可以看出，本发明能够获得高密度细胞且有效提升细胞的存活率，而对于灌注液温度的细微调整，能够有效平衡培养液内细胞快速生长所产生的细胞热量和环境热量，减小细胞受到培养液内来不及平衡的阶梯热度对细胞的影响，因此实施例3、4表现出了较优异的结果，而培养温度差异过大，则会影响培养环境的稳定，因此，实施例5、6表现出稍逊的结果，而对比例1-3的结果则不太理想。
32.本发明中，未详细描述的均是现有技术。
33.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。